CN105176818A - 微重力悬浮培养动物细胞的*** - Google Patents

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高毅
李阳
张志�
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Abstract

本发明公开一种微重力悬浮培养动物细胞的***，其包括为动物细胞提供生长场所的培养罐、为所述培养罐提供氧气的供氧器、储存培养基的灌流液瓶、用于驱动所述培养基在该***内流动的蠕动泵，以及将所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动泵导通连接的循环管路，其中，所述培养罐设置有两个相对的用于灌注培养基的端口；该培养罐罐体内部靠近所述端口处设有筛网。本发明微重力悬浮培养动物细胞的***有效增加培养罐内物质交换效率，提高细胞培养质量。

Description

微重力悬浮培养动物细胞的***
技术领域
本发明涉及一种动物细胞培养技术，尤其涉及一种微重力悬浮培养动物细胞的***。
背景技术
我国是肝炎、肝硬化的高发国家，临床上由此引发的肝功能衰竭十分常见，原位肝移植是临床治疗爆发性肝功能衰竭的有效手段，但供体有限、费用昂贵等因素，极大地限制了肝移植手术的推广和普及。近年来，体外人工肝支持***的出现为挽救肝功能衰竭患者的生命带来了希望。
随着体外人工肝支持***的发展，以具有解毒、合成、分泌、转化等全面代谢支持的肝细胞为核心的生物人工肝支持***已经逐渐发展成为非常有效的体外人工肝支持***。生物反应器是生物型或混合型生物人工肝的核心装置。目前国内外主流的生物反应器包括多层平板式反应器、中空纤维反应器等。但这些反应器都存在着物质交换能力有限、管道易于堵塞、细胞不易收集等诸多技术缺陷。微重力悬浮式生物反应器具有较好的物质交换能力，管路不直接与细胞接触，不易堵塞，大规模培养后细胞易于收集等特点。在传统三维细胞培养条件下，由于重力作用，尽管细胞可在各种培养支架上黏附生长，所建立的三维培养体系中细胞的分布不均匀，往往集中在支架靠下的一侧，这样会影响三维培养体系作为移植物应用的实际效果，阻碍组织特异性分化，丧失其特征和分化，形成的聚集出现中央坏死。因此，体外高密度三维细胞培养具有较高的难度。微重力反应器在旋转过程中，重力向量持续随机化而形成一定程度的三维空间自由，有利于细胞有选择的、均匀地分布于支架的表面，是避免这一问题的有效方法，可以保持所培养细胞的组织分化特异性。
生物微胶囊技术是采用多种无毒的高分子材料包裹细胞形成直径数十微米至数百微米微囊的技术。细胞生存所需要的营养物质、氧气、代谢产物及其分泌的生物活性物质能通过半透膜出入，而宿主免疫细胞、免疫球蛋白、补体等则不能通过半透膜，故囊内肝细胞可不受宿主的免疫排斥而长期存活，发挥其生物学功能，达到治疗目的。由于微胶囊是球形膜，较现有的平板膜、中空纤维膜反应器提供了更大的表面积，具备了更高效的物质交换能力；微胶囊膜的存在能够有效保护细胞，免受培养过程及人工肝反应器工作过程中流体高剪切对细胞造成的伤害，因此可以通过强化传质来提高培养环境的物质传递性能，提高氧传质能力，从而有利于获得较高的细胞密度。微胶囊是一个相对封闭的体系，通过改变体系内部物理、化学环境可以构建满足细胞存活、生长和功能表达的细胞微反应器，更有利于细胞生长与功能发挥，培养过程中还可以将一些必须添加的、价格昂贵的、分子量较大的营养物质包封在微囊内，从而提高该营养物质局部的浓度，减少使用量，降低培养成本。
但是，这种生物微胶囊技术也有显著的缺点，由于半透膜的存在以及细胞间的相互聚集，导致微囊内外物质能量交换受限，对于贴壁依赖性的细胞，如失去对微囊壁的贴附，将促发细胞发生凋亡，因此如何进一步提高反应器物质交换效率是关键技术问题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种增加物质交换效率的微重力悬浮培养动物细胞的***。
为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种微重力悬浮培养动物细胞的***，其包括为动物细胞提供生长场所的培养罐、为所述培养罐提供氧气的供氧器、储存培养基的灌流液瓶、用于驱动所述培养基在该***内流动的蠕动泵，以及将所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动泵导通连接的循环管路，其中，所述培养罐设置有两个相对的用于灌注培养基的端口；该培养罐罐体内部靠近所述端口处设有筛网。
具体地，所述筛网的孔径为50～500微米。优选地，所述筛网由混合纤维素酯滤膜制成，所述滤膜的膜厚为0.22微米。
为方便取样检测，所述培养罐开设有取样口，该取样口的口径为4～8毫米。
为大规模培养动物细胞，优选地，所述培养罐为微囊化细胞旋转培养罐。
进一步地，所述供氧器为膜式氧合器。
更进一步地，所述循环管路包括阀门组件和多条通过该阀门组件导通所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动泵分管路。
具体地，所述阀门组件包括第一阀门、第二阀门、第三阀门和第四阀门，其中，第一阀门和第三阀门相互导通并且在两者中间设置第一接口，第二阀门和第四阀门相互导通并且在两者中间设置第二接口。
所述分管路包括：与所述第一阀门连接的第一分管路，与所述第二阀门连接的第二分管路，与所述第三阀门连接的第三分管路，与所述第四阀门连接的第四分管路，其中，所述第一分管路和第四分管路的另一端相互连接形成第三接口，第二分管路和第三分管路的另一端相互连接形成第四接口；还包括第五分管路，其两端分别与所述第一接口和第二接口连接，并且该第五分管路将所述灌流液瓶、蠕动泵和供氧器串接起来；还包括连接所述第三接口和培养罐的第六分管路，以及连接所述第四接口和培养罐的第七分管路。
与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
(1)本发明的微重力悬浮培养动物细胞的***，所使用的培养罐设有两个相对的端口，***中的培养基可以周期性地从这两个端口灌入或流出培养罐，可以防止培养罐内的细胞代谢产物在一处堆积，以及避免发生灌注入口细胞供氧良好而罐体出口细胞缺氧和缺乏营养物质的情况，有效消灭培养死腔形成；
(2)本发明的微重力悬浮培养动物细胞的***，其培养罐内设有筛网，可以将微胶囊、细胞的代谢大分子保留在罐体内，便于维持培养罐内的培养环境的稳定性；
(3)本发明的微重力悬浮培养动物细胞的***，其培养罐内设有取样口，便于操作人员从取样口提取少量培养液进行关键数据的检测，可以实时了解培养罐内的微环境，并且可以根据检测所得的数据对培养条件进行调节。
附图说明
图1为本发明微重力悬浮培养动物细胞的***的结构示意图，示出当第一阀门和第二阀门打开，第三阀门和第四阀门关闭时该***内培养基的流动方向。
图2为本发明微重力悬浮培养动物细胞的***的结构示意图，示出当第一阀门和第二阀门关闭，第三阀门和第四阀门打开时该***内培养基的流动方向。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
参考图1，本发明的微重力悬浮培养动物细胞的***包括培养罐1、灌流液瓶2、蠕动泵3、膜式氧合器4以及将上述各个部件有序导通连接的循环管路5。
进一步地，所述培养罐1是动物细胞的生长场所，培养过程完成后可以从该培养罐1中收获动物细胞或者动物细胞的目标代谢物。所述培养罐1在罐体11的左侧和右侧分别设置了连通该罐体11内部的第一端口12和第二端口13，所述第一端口12和第二端口13都用于向所述罐体灌注培养基，由于该第一端口12和第二端口13的位置相对，依次经过这两个端口的培养基可以流通整个罐体11，让罐体11内的物质交换更加充分。更进一步地，所述罐体11靠近所述两个端口处设置了筛网11，所述筛网11的孔径优选为50～500微米，更优地，所述筛网由混合纤维素酯滤膜制成，所述滤膜的膜厚为0.22微米。所述筛网11的孔径大小既可以驻留培养的动物细胞和动物细胞的代谢物大分子，又可以使培养基较顺利地通过。为便于取样检测，该罐体11的底部开设有取样口15，所述取样口15的口径为4～8毫米。
所述培养罐1适用于培养微囊化的动物细胞，若在该培养罐1设置低速搅拌装置(未图示)而成为微囊化细胞旋转培养罐，可以实现动物细胞的微重力悬浮培养。
继续参考图1，所述灌流液瓶2用于储存新鲜的液体培养基，该灌流液瓶2具有分别连接用于导入和导出液体培养基的管道的孔道(未图示)。所述蠕动泵3为在该***内流动的液体培养基提供流动的驱动力，可以利用对应的控制装置调节该蠕动泵3的流速等影响液体培养基循环的参数。所述膜式氧合器4是供氧设备的一种，为所述培养罐1提供动物细胞体外扩增所需的氧气，所述“氧气”并不是纯氧，而是5％的二氧化碳和50％的氧气的混合气。
所述循环管路5包括阀门组件51和多条通过该阀门组件51导通所述培养罐1、灌流液瓶2、蠕动泵3和膜式氧合器4的分管路52。
具体地，所述阀门组件51包括第一阀门51a、第二阀门51b、第三阀门51c和第四阀门51d，其中，第一阀门51a和第三阀门51c相互导通并且在两者中间设置第一接口511，第二阀门51b和第四阀门51d相互导通并且在两者中间设置第二接口512。
所述分管路52包括与所述第一阀门51a连接的第一分管路52a，与所述第二阀门51b连接的第二分管路52b，与所述第三阀门51c连接的第三分管路52c，与所述第四阀门51d连接的第四分管路52d，其中，所述第一分管路52a和第四分管路52d的另一端相互连接形成第三接口521，第二分管路52b和第三分管路52c的另一端相互连接形成第四接口522；还包括第五分管路52e，其两端分别与所述第一接口511和第二接口512连接，并且该第五分管路52e将所述灌流液瓶2、蠕动泵3和膜式氧合器4串接起来；还进一步包括连接所述第三接口521和培养罐1的第一端口12的第六分管路52f，以及连接所述第四接口522和培养罐1的第二端口13的第七分管路52g。
进一步地，所述第一阀门51a、第二阀门51b、第三阀门51c和第四阀门51d的开、闭状态影响了该微重力悬浮培养动物细胞的***中液体培养基的流动方向，具体情况如下：
(1)如图1所示，假设所述蠕动泵3驱动液体培养基向左流动，所述第一阀门51a和第二阀门51b处于打开状态，所述第三阀门51c和第四阀门51d处于关闭的状态；该***中的液体培养基从所述灌流液瓶2一侧流出，沿所述第五分管路52e经过所述膜式氧合器4后通过所述第一接口511进入所述第一分管路52a，再通过所述第三接口521进入所述第六分管路52f并且进一步通过所述第一端口12灌入所述培养罐1中；所述培养罐1内满溢的液体培养基从所述第二端口13流出进入所述第七分管路52g，通过所述第四接口522进入所述第二分管路52b，进一步通过所述第二接口512再次进入所述第五分管路52e，直到回流到所述灌流液瓶2，以此完成一轮循环(参考虚线箭头指示的循环路线)。
(2)如图2所示，假设所述蠕动泵3驱动液体培养基向左流动，所述第一阀门51a和第二阀门51b处于关闭状态，所述第三阀门51c和第四阀门51d处于打开的状态；该***中的液体培养基从所述灌流液瓶2一侧流出，沿所述第五分管路52e经过所述膜式氧合器4后通过所述第一接口511进入所述第三分管路52c，再通过所述第四接口522进入所述第七分管路52g并且进一步通过所述第二端口13灌入所述培养罐1中；所述培养罐1内满溢的液体培养基从所述第一端口12流出进入所述第六分管路52f，通过所述第三接口521进入所述第四分管路52d，进一步通过所述第二接口512再次进入所述第五分管路52e，直到回流到所述灌流液瓶2，以此完成一轮循环(参考虚线箭头指示的循环路线)。
进一步地，采用本发明的***培养由改良原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞，具体操作流程如下：
将已分离的猪肝细胞在方瓶中进行平面培养，待平面生长的猪肝细胞长到对数生长期，用0.25％胰酶消化，生理盐水洗涤3次，离心收集细胞，计数，悬浮于15g/L的海藻酸钠溶液中，利用微囊静电液滴发生器喷入0.1mol/LCaCl2溶液中，形成海藻酸钙胶珠，然后用0.5g/L多聚赖氨酸包裹，再与1.5g/L的海藻酸钠溶液反应，最后用55mmol/L柠檬酸钠溶液处理，获得微囊化的猪肝细胞1a。将制备好的微囊化猪肝细胞1a于37℃，体积分数5％CO2的培养箱中继续培养。
在无菌超净台内完成所述微重力悬浮培养动物细胞的***的循环管路5的连接，收集各方瓶中微囊包裹的猪肝细胞1a，血球细胞计数板计数，待细胞总数约109～1010，台盼蓝染色细胞活力大于95％后，将微囊细胞悬液加入到所述培养罐1中(如图1和图2所示)，驱动所述蠕动泵3向所述培养罐1中缓缓注入液体培养基。当该***内的管道因为液体培养基的填充而排尽空气后，将所述整个***搬到已经过紫外线消毒过的孵箱里，在37℃、5％CO2培养箱内连接所述膜式氧合器4，接通含50％氧气的混合气体，开始猪肝细胞的微重力悬浮培养。所述培养罐1的搅拌装置的旋转速度维持在30～80r/min。每24小时更换新鲜的液体培养基500ml，更换培养基时，停止所述蠕动泵3和培养罐1的搅拌装置，将所述培养罐1置于灭菌超净台中，更换装有新鲜液体培养基的所述灌流液瓶2。
操作中需要取样检测时将所述培养罐1置于灭菌超净台中，用75％酒精棉球擦拭取样口15的外盖，旋开所述取样口15的外盖，接入5ml注射器，待所述微囊化猪肝细胞1a尽可能在所述培养罐1中分布均匀后抽取1ml样品。然后，待所述微囊化猪肝细胞1a下沉后抽取5ml细胞培养上清样品，75％酒精棉签擦拭取样口15，盖上取样口15的外盖，再用75％酒精棉签擦拭取样口15的外盖，将所述培养罐1放回二氧化碳孵箱中，重新安装循环管路，开启蠕动泵3和搅拌装置，继续猪肝细胞的培养。取样过程要避免在整个***内产生气泡，若产生气泡需要用注射器及时抽出。
综上所述，本发明微重力悬浮培养动物细胞的***有效增加培养罐内物质交换效率，提高细胞培养质量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微重力悬浮培养动物细胞的***，其包括为动物细胞提供生长场所的培养罐、为所述培养罐提供氧气的供氧器、储存培养基的灌流液瓶、用于驱动所述培养基在该***内流动的蠕动泵，以及将所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动泵导通连接的循环管路，其特征在于：所述培养罐设置有两个相对的用于灌注培养基的端口；该培养罐罐体内部靠近所述端口处设有筛网。
2.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述筛网的孔径为50～500微米。
3.如权利要求2所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述筛网由混合纤维素酯滤膜制成，所述滤膜的膜厚为0.22微米。
4.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述培养罐开设有取样口，该取样口的口径为4～8毫米。
5.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述培养罐为微囊化细胞旋转培养罐。
6.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述供氧器为膜式氧合器。
7.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述循环管路包括阀门组件和多条通过该阀门组件导通所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动泵分管路。
8.如权利要求7所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于：所述阀门组件包括第一阀门、第二阀门、第三阀门和第四阀门，其中，第一阀门和第三阀门相互导通并且在两者中间设置第一接口，第二阀门和第四阀门相互导通并且在两者中间设置第二接口。
9.如权利要求8所述的微重力悬浮培养动物细胞的***，其特征在于，所述分管路包括：与所述第一阀门连接的第一分管路，与所述第二阀门连接的第二分管路，与所述第三阀门连接的第三分管路，与所述第四阀门连接的第四分管路，其中，所述第一分管路和第四分管路的另一端相互连接形成第三接口，第二分管路和第三分管路的另一端相互连接形成第四接口；还包括第五分管路，其两端分别与所述第一接口和第二接口连接，并且该第五分管路将所述灌流液瓶、蠕动泵和供氧器串接起来；还包括连接所述第三接口和培养罐的第六分管路，以及连接所述第四接口和培养罐的第七分管路。
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