CN105175532B - 结合pcsk9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合PCSK9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质。本发明还涉及新蛋白质在治疗应用中用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的用途。本发明进一步涉及包含这些蛋白质、编码这些蛋白质或其片段的多核苷酸的细胞，且涉及包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。

Description

结合PCSK9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质
本申请是2011年4月13日提交的申请号为201180029216.5(国际申请号PCT/US2011/032231)、发明名称为“结合PCSK9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质”的发明专利申请的分案申请。
序列表
本申请包含已通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，兹通过提述并入其全部内容。所述ASCII拷贝于2011年4月13日生成，名为11594PCT.ST25.txt，大小为1,382KB。
发明领域
本发明涉及结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新(kexin)9型(PCSK9)的基于纤连蛋白的支架域蛋白质。本发明还涉及该新蛋白质在治疗应用中用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的用途。本发明进一步涉及包含这些蛋白质、编码这些蛋白质或其片段的多核苷酸的细胞，且涉及包含编码这些新蛋白质的多核苷酸的载体。
背景技术
动脉粥样硬化是导致造成工业化国家大多数死亡的冠心病(CHD)的动脉疾病(Lusis(2000))。现已充分确定CHD的若干风险因素：血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、不良饮食、不活动及紧张。在临床上最相关且常见的血脂异常以高甘油三酯血症存在或不存在下伴随高胆固醇血症的低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白(LDL及VLDL)的增加为特征(Fredrickson等人(1967))。LDL胆固醇的单独升高是CHD的最常见风险因素之一。PCSK9(亦称作HCHOLA3、NARC-1或FH3)系属于分泌性枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚家族的蛋白酶(Naureckiene等人，Arch.Biochem.Biophy.,420:55-57(2003))。已显示，PCSK9是胆固醇稳态及循环低密度脂蛋白浓度的关键调节者。循环PCSK9蛋白通过直接结合LDL受体并促进其在肝细胞中的降解来控制LDL代谢。PCSK9介导的LDL受体蛋白质及活性的下调可减少LDL从循环中的清除并提高LDL浓度。已知PCSK9的若干突变形式，包括S127R、N157K、F216L、R218S及D374Y，其中S127R、F216L及D374Y与常染色体显性高胆固醇血症(ADH)关联。人们相信野生型PCSK9可增加LDL受体的更换速率，从而导致LDL清除降低(Maxwell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,102(6):2069-2074(2005)；Benjannet等人及Lalanne等人)，而PCSK9的功能丧失突变会导致低密度脂蛋白受体(LDLR)浓度增加、循环LDL清除增加及血浆胆固醇水平的相应降低(Rashid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,102(15):5374-5379(2005))。因此，PCSK9是治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的潜在靶标。
基于纤连蛋白的支架(fibronectin based scaffolds)是一个蛋白质家族，这些蛋白质能够进化而结合任何感兴趣的化合物。这些蛋白质通常利用源自纤连蛋白III型(Fn3)或Fn3-样结构域的支架，以具有天然或工程化抗体(亦即，多克隆、单克隆或单链抗体)的特征的方式作用，且另外具有结构优势。具体而言，这些抗体模拟物的结构已经设计而具有最优的折叠、稳定性及溶解性，甚至在通常导致抗体结构及功能损失的条件下亦如此。基于纤连蛋白的支架蛋白质的一个实例是阿德奈汀(Adnectin)(Adnexus,Bristol-Myers Squibb R&D公司)。
纤连蛋白III型(Fn3)结构域自N末端至C末端按顺序包含：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF及FG中的任一者或全部皆可参与靶物结合。BC、DE及FG环在结构与功能两方面皆与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)类似。美国专利第7,115,396号描述了Fn3结构域蛋白质，其中改变BC、DE及FG环可获得高亲和力TNFα结合物。美国专利申请公开第2007/0148126号描述了Fn3结构域蛋白质，其中改变BC、DE及FG环可获得高亲和力VEGFR2结合物。
获得结合PCSK9的经改良的纤连蛋白域支架蛋白质对于治疗性处理动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病将是有利的。
发明内容
本申请提供针对人类PCSK9的阿德奈汀。本发明的一个方面提供包含Fn3结构域的多肽，其中一或多个溶剂可及(solvent accessible)环已经过随机化或突变。在一些实施方案中，Fn3结构域是源自人类纤连蛋白III型结构域的野生型第10模块(10Fn3)的Fn3结构域。在一些实施方案中，本发明的10Fn3多肽与人类10Fn3结构域至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％同一。
在一些实施方案中，一或多个选自BC、DE及FG的环的长度可相对于相应的人类纤连蛋白环延长或缩短。
在一些实施方案中，本发明多肽包含纤连蛋白III型第10(10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域包含环AB；环BC；环CD；环DE；环EF；及环FG；且选自环BC、DE及FG中的至少一个环具有相对于人类10Fn3结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明多肽包含含有与非环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列的Fn3结构域。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自由SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含如表3中所展示的SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，BC环包含序列PPPSHGYG(SEQ ID NO:2的残基3-10)、DAPAHAYG(SEQ ID NO:5的残基3-10)、EPFSRLPGGGE(SEQ ID NO:106的残基3-13)或DAPADGGYG(SEQ ID NO:107的残基3-11)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自SEQ ID NO:18-27及136-141的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含如表3中所示的SEQ ID NO:18-27及136-141中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，DE环包含序列PGKG(SEQID NO:18的残基2-5)、VGVG(SEQ ID NO:27的残基2-5)或VSKS(SEQ ID NO:137的残基2-5)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自SEQ ID NO:28-38及142-172的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含如表3中所示的SEQ ID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，FG环包含序列EYPYKHSGYYHR(SEQ ID NO:28中的残基1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO:142中的残基1-12)或EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO:167中的残基1-12)。
在一些实施方案中，10Fn3结构域可以以氨基酸取代、***或缺失开始及/或结束。
在一些实施方案中，本发明蛋白质包含SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中所示的BC环序列中的一个环序列；SEQ ID NO:18-27及136-141中所示的一个DE环序列；及SEQID NO:28-38及142-172中所示的一个FG环序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质包含一个BC环序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分；一个DE环序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO:18-27及136-141中任一者的阴影部分；及一个FG环序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。
在一些实施方案中，本发明蛋白质包含与SEQ ID NO:2-38、106-172及301-303中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的BC、DE及FG环氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质包含与如上文所述表3中所示的BC、DE及FG环的阴影部分中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的BC、DE及FG环氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO:39-76、173-290及304-309中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO:39-76、173-290及304-309中任一者的第3至96位的Fn3结构域氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)ZX2G(SEQ IDNO:323)的BC环，其中X1为任意氨基酸，Z为6至9的数值，且X2为Y或H。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列PX1X1X1X3T(SEQ IDNO:324)的DE环，其中X1为任意氨基酸且X3为G或S。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP(SEQ ID NO:325)的FG环，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F；X5为Y、F或W；且X6系S或A。在某些实施方案中，X4及X5系各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)ZX2G(SEQ IDNO:323)的BC环、具有序列PX1X1X1X3T(SEQ ID NO:324)的DE环及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP(SEQ ID NO:325)的FG环，如本文所定义。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SWEPFSRLPGGGE(SEQID NO:106)的BC环、具有序列PX1X1X1X3T(SEQ ID NO:324)的DE环、及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP(SEQ ID NO:325)的FG环，如本文所定义。
在一个方面，本公开提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列(X1)ZX2G(SEQ ID NO:449)的BC环，其中X1为任意氨基酸，Z为6至9的数值，且X2为Y或H。
在一个方面，本公开提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列PX1X1X1X3T(SEQ IDNO:450)的DE环，其中X1为任意氨基酸，且X3为G或S。
在一个方面，本公开提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID NO:451)的FG环，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F；X5为Y、F或W；且X6为S或A。在某些实施方案中，X4及X5为各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列(X1)ZX2G(SEQ ID NO:449)的BC环、具有序列X1X1X1X3(SEQ ID NO:450)的DE环及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQID NO:451)的FG环，如本文所定义。
在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀的N末端存在至少一个氨基酸缺失。
在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀的C末端存在至少一个氨基酸缺失、***或取代。
在一些实施方案中，将接头添加至PCSK9阿德奈汀的C末端。
在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀可与非10Fn3部分(例如人类血清白蛋白(HSA))偶联，如PCT公开第WO 2009/133208号及第WO 2009/083804中所述。
在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀在AB、CD及EF环氨基酸序列中可具有突变，如PCT公开第WO 2009/133208号及第WO 2009/083804号中所述。
在一个方面中，抗PCSK9阿德奈汀进一步包含药动学(PK)部分。在一个实施方案中，PK部分包含聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PK部分包含Fc区域。在一些实施方案中，PK包含一或多个结合血清白蛋白的阿德奈汀。例示性抗PCSK9阿德奈汀-Fc融合蛋白质展示于表1中。例示性结合抗PCSK9-血清白蛋白的阿德奈汀包含SEQ ID NO:618或619。
在某些实施方案中，具有PK部分的抗PCSK9阿德奈汀包含如SEQ ID NO:322中所述的序列。
在另一方面中，抗PCSK9阿德奈汀不包含任何PK部分(即，“裸露的”抗PCSK9阿德奈汀)。在某些实施方案中，可以利用可充分达成期望治疗效果的频率施用裸露的抗PCSK9阿德奈汀。在另一实施方案中，可使用延长释放制剂(例如，皮下制剂)施用裸露抗PCSK9阿德奈汀。在一些实施方案中，延长释放制剂增加吸收期的长度、或延长该药效学效应、或二者。仅仅为了举例说明，延长释放制剂包含丙二醇/PBS溶液。
在一个方面，本申请提供可用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的抗PCSK9阿德奈汀。
在一个方面，本发明提供融合多肽，其包含结合血清白蛋白的纤连蛋白III型第10(10Fn3)结构域及抗PCSK9阿德奈汀，其中所述结合血清白蛋白的10Fn3结构域以1μM或更低的Kd结合至血清白蛋白(例如，HSA)。在某些实施方案中，结合至血清白蛋白的10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:330至少70％同一的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合至血清白蛋白的10Fn3结构域包含具有SEQ ID NO:331中所述氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:332中所述氨基酸序列的DE环、及具有SEQ ID NO:333中所述氨基酸序列的FG环。在另一实施方案中，结合至血清白蛋白的10Fn3结构域包含以下中的一或多者：具有SEQ ID NO:331中所述氨基酸序列的BC环、具有SEQ ID NO:332中所述氨基酸序列的DE环及具有SEQ ID NO:333中所述氨基酸序列的FG环。
在一个实施方案中，融合多肽的结合血清白蛋白的10Fn3结构域亦结合至以下中的一或多者：猕猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)或鼠血清白蛋白(MuSA)。在其他实施方案中，结合至血清白蛋白的10Fn3结构域不与RhSA、CySA或MuSA中的一或多者交叉反应。
在某些实施方案中，融合多肽的结合血清白蛋白的10Fn3结构域以1μM或更低的Kd结合至HSA。在一些实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域以500nM或更低的Kd结合至HSA。在其他实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域以至少200nM、100nM、50nM、20nM、10nM或5nM的Kd结合至HSA。
在其他实施方案中，融合多肽的结合血清白蛋白的10Fn3结构域结合至HSA的结构域I或II。在一个实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域结合至HSA的结构域I与II二者。在一些实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域在5.5至7.4的pH范围结合至HSA。在其他实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域在pH 5.5以200nM或更低的Kd结合至HSA。在另一实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域在5.5至7.4的pH范围以至少500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM或5nM的Kd结合至HSA。在一个实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域在pH 5.5以至少500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM或5nM的Kd结合至HSA。
在一些实施方案中，融合多肽在血清白蛋白存在下的血清半衰期为融合多肽在血清白蛋白不存在下的血清半衰期的至少5倍。在某些实施方案中，融合多肽在血清白蛋白存在下的血清半衰期为融合多肽在血清白蛋白不存在下的血清半衰期的至少2倍、5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍或30倍。在一些实施方案中，血清白蛋白是HSA、RhSA、CySA或MuSA中的任一者。
在某些实施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期为至少20小时。在某些实施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期系至少10小时、12小时、15小时、20小时、25小时、30小时、40小时、50小时、75小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、150小时、170小时或200小时。在一些实施方案中，融合多肽的半衰期是在灵长类动物(例如，人类或猴)或小鼠中观察到的。
在上述的任一方面及实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3结构域包含选自SEQ IDNO:334、338、342、346及348-370的序列。
更具体地，本公开涉及：
1.一种多肽，其包含纤连蛋白III型第10结构域(10Fn3)，其中该10Fn3的选自环BC、DE及FG的至少一个环具有相对于人10Fn3结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列，且其中该多肽结合(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型)PCSK9。
2.项1所述的多肽，其中该多肽以小于500nM的KD结合PCSK9。
3.项1或2所述的多肽，其中该BC环包含根据式(X1)ZX2G(SEQ ID NO:449)的序列，其中X1为任意氨基酸，Z为6-9的数值，且X2为Y或H。
4.项1-3中任一项所述的多肽，其中所述BC环包含如表3中所示的SEQ ID NO:2-17、107-135及301-303中任一者的阴影部分。
5.项3或4所述的多肽，其中所述BC环选自SEQ ID NO:2-17、107-135及301-303。
6.项1-5中任一项所述的多肽，其中所述DE环包含根据式X1X1X1X3(SEQ ID NO:450)的序列，其中X1为任意氨基酸；且X3为G或S。
7.项1、2或6中任一项所述的多肽，其中所述DE环包含如表3中所示的SEQ ID NO:18-27及136-141中任一者的阴影部分。
8.项6或7所述的多肽，其中所述DE环选自SEQ ID NO:18-27及136-141。
9.项1-8中任一项所述的多肽，其中所述FG环包含根据式EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQID NO:451)的序列，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F；X5为Y、F或W；且X6为S或A。
10.项1、2或9中任一项所述的多肽，其中所述FG环包含如表3中所示的SEQ ID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。
11.项9或10所述的多肽，其中所述FG环选自SEQ ID NO:28-38及142-172。
12.项1、2、3、6或9中任一项所述的多肽，其中所述BC、DE或FG环氨基酸序列与SEQID NO:2-38、106-172及301-303中任一者至少80％同一。
13.项1-12中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:39-76、173-290及304-309中任一者至少80％同一的氨基酸序列。
14.项1-10中任一项所述的多肽，其进一步包含一个或多个选自下组的药动学(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白、及血清免疫球蛋白结合蛋白。
15.项14所述的多肽，其中所述血清白蛋白结合蛋白包含纤连蛋白III型第10结构域(10Fn3)。
16.项15所述的多肽，其中所述10Fn3结构域结合HSA。
17.项14所述的多肽，其中所述PK部分是聚乙二醇。
18.一种可药用的组合物，其包含项1-17中任一项所述的多肽，其中该组合物基本上不含内毒素。
附图说明
图1展示例示性抗PCSK9阿德奈汀氨基酸序列的比对。BC、DE及FG环氨基酸序列分别通过下划线、斜体/下划线或粗体/下划线来标识。
图2是描绘PCSK9：表皮生长因子前体同源结构域(EGFA结构域)荧光共振能量转移(FRET)测定的示意图，使用该测定来测量抑制PCSK9:LDLR的PCSK9阿德奈汀的效能，如实施例2中所述。
图3展示自FRET测定生成的曲线，使用该测定来测量PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04及1923B02(小图A)及克隆1459D05、2012A04、2011H05及2013E01(小图B)对人PCSK9:EGFA的抑制，如实施例2中所述。
图4展示自FRET测定生成的曲线，使用该测定来测量PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04及1923B02(小图A)及克隆2011H05、2012A04及2013E01(小图B)对人类PCSK9:ATI000972相互作用的抑制，如实施例2中所述。
图5展示PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04及1923B02(小图A)及克隆2011H05、2012A04及2013E01(小图B)在直接结合人PCSK9FRET测定中的活性，如实施例2中所述。
图6展示通过DiI-LDL摄取法测定的HepG2细胞中对PCSK9活性的抑制，如实施例2中所述。
图7展示PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、2012A04及2011H05(小图A)及克隆ID 2011H05、2012A04及2013E01(小图B)对由PCSK9诱导的HepG2细胞表面LDLR消耗的抑制，如实施例2中所述。1784F03、2012A04、2011H05及2013E01的EC50(nM)分别为15.98、7.78、8.85及12.41；75nM的PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、2012A04、2011H05及2013E01对PCSK9抑制的百分比分别为66.8、150.2、190.1、177.4及152.2。
图8展示在过表达hPCSK9的转基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI000959(100mg/kg)对血浆胆固醇(小图A)及血浆未结合hPCSK9(小图B)的体内效应，如实施例3中所述。ATI000959含有40kDa的带支链NOF PEG。
图9展示在过表达hPCSK9的转基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI001114(10或60mg/kg)对血浆胆固醇水平(小图A)及血浆未结合hPCSK9水平(小图B)的体内效应，如实施例3中所述。
图10展示在正常表达者hPCSK9转基因小鼠中，以5mg/kg经腹膜内(i.p.)单剂量施用的PCSK9阿德奈汀ATI000959(小图A)或ATI001114(小图B)对未结合血浆hPCSK9的体内效应(平均值+/-SD)，如实施例3中所述。
图11展示在正常表达者hPCSK9转基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI001114对未结合hPCSK9的剂量依赖性效应，如实施例3中所述。
图12展示在食蟹猴中，单剂量PCSK9阿德奈汀ATI001114(5mg/kg，经静脉内)对LDL-C降低的效应(平均值+/-SEM，n＝3)，如实施例3中所述。
图13.PCSK9阿德奈汀结合hPCSK9的亲和力及化学计量的ITC测定。PCSK9阿德奈汀以1:1化学计量结合hPCSK9。左图展示PCSK9阿德奈汀ATI001081的数据。左图展示PCSK9阿德奈汀ATI001174的数据。
图14.PCSK9阿德奈汀对PCSK9:EGFA FRET测定(左图)及PCSK9:ATI-972FRET测定(右图)的抑制。
图15.抗PCSK9阿德奈汀对由PCSK9诱导的HepG2细胞表面LDLR消耗的抑制。
图16.在HepG2细胞中对PCSK9-AF647细胞进入的抑制。
图17.经PRD460处理(经腹膜内给予)的转基因小鼠中血浆未结合hPCSK9的水平。
图18.在食蟹猴中，PRD460(15mg/kg，经静脉内)对LDL-C及游离PCSK9的效应(平均值+/-SEM，n＝3)。
图19.在食蟹猴中，ATI-1081(亦称作ATI001081)对未结合PCSK9水平的效应。
图20.在食蟹猴中，ATI-1081对LDL-C水平的效应。
图21.存于PBS媒介中的ATI-1081在转基因小鼠中的效应。该图说明了转基因小鼠中未结合血浆hPCSK9的水平。
图22.在PG媒介中经皮下给予的ATI-1081在转基因小鼠中的效应。该图说明了转基因小鼠中未结合hPCSK9的水平。
图23.小鼠中的体内HSA半衰期。以20mg/kg(小图A)或50mg/kg(小图B)将HSA注射至裸小鼠中。
图24.SABA 1.1(小图A)、SABA2.1(小图B)、SABA3.1(图C)及SABA4.1(图D)在小鼠中的半衰期测定。
图25.展示SABA1-4在与HSA共注射时在小鼠中的半衰期延长的总结的线图。
图26.SABA1.1(小图A)及SABA5.1(小图B)在食蟹猴中的半衰期测定。
图27.通过直接结合ELISA测定测得的SABA1.2与人、小鼠及大鼠的白蛋白的结合。
图28.SABA1.1与HSA的化学计量的测定。SABA1.1与HSA以1:1的化学计量结合。
图29.SABA1.2对HSA的重组结构域片段的结合的
Figure BDA0000786597750000111
分析。
图30.以1mpk及10mpk给予的SABA1.2在食蟹猴中的药动学概貌。
图31.经静脉内或皮下以1mpk给予的SABA1.2在猴中的药动学概貌。
发明详述
定义
“多肽”意指任何两个或更多个氨基酸的序列，无论其长度、翻译后修饰或功能。在本文中，”多肽”、”肽”与”蛋白质”可互换使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如阐述于美国专利第6,559,126号中者，该专利以引用方式并入本文中。多肽亦可以多种标准化学方式中的任一者来修饰(例如，氨基酸可用保护基团修饰；羧基末端氨基酸可变成末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰以(例如)增强亲脂性；或多肽可经化学糖基化或以其他方式修饰以增加稳定性或体内半衰期)。多肽的修饰可包括另一结构(例如环状化合物或其他分子)与多肽的附接，亦可包括含有一或多个构型改变(即，R或S；或L或D)的氨基酸的多肽。本发明的肽为源自纤连蛋白的第10III型结构域的蛋白质，它们已经过修饰而特异性结合至PCSK9，并且在本文中被称作”抗PCSK9阿德奈汀”或”PCSK9阿德奈汀”。
术语”PK”是”药动学”的缩写，且涵盖化合物的包括(例如)被受试者吸收、分布、代谢及消除的性质。”PK调节蛋白质”或”PK部分”指任何当与生物活性分子融合或一起施用时影响生物活性分子的药动学性质的蛋白质、肽或部分。PK调节蛋白质或PK部分的实例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合物(如美国专利申请公开第2005/0287153号及第2007/0003549号、PCT专利申请公开第WO 2009/083804号及第WO 2009/133208号中所公开的、及如本文中所述的SABA分子)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段及其变体、及糖(例如，唾液酸)。
本文中的”氨基酸序列百分比同一性(％)”定义为：在比对各序列及(若需要)引入缺口以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分的条件下，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以通过本领域现有技术之内的多种方式来达成，例如，使用可公开获得的电脑软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNAStar)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较序列全长范围内达到最大比对所需要的任何算法。
“分离”的多肽是已经被鉴定并与其天然环境的成分分离和/或从其天然环境的成分回收的多肽。其天然环境的污染性成分是会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素及其他蛋白质性溶质或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，可将多肽纯化至(1)含有95重量％以上的多肽，且最优选含有99重量％以上的多肽，如通过Lowry方法测定的；(2)可通过使用旋杯式序列分析仪至少获得N末端或内部氨基酸序列残基的程度；或(3)均一，如通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色所测量的。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为至少有一种多肽天然环境的成分不会存在。不过，通常来说，分离的多肽会通过至少一个纯化步骤来制备。
符号”mpk”、”mg/kg”或”mg/kg”指毫克每千克。所有符号在本公开通篇中可互换使用。
氨基酸序列或化合物的”半衰期”通常可定义为在活体内多肽血清浓度降低50％(例如由于天然机制而导致的序列或化合物的降解及/或序列或化合物的清除或螯合)所耗费的时间。半衰期可以本身已知的任意方式(例如藉由药动学分析)来确定。本领域技术人员容易想到适宜的技术，适宜的技术通常可涉及例如以下步骤：向灵长类动物适宜地施用适宜剂量的本发明的氨基酸序列或化合物；以规律的间隔收集来自该灵长类动物的血样或其他试样；测定本发明的氨基酸序列或化合物在该血样中的水平或浓度；并根据由此获得的数据(的作图)计算到本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度相对于给予时的初始水平降低50％为止所经过的时间。可参照例如标准手册，例如Kenneth,A等人：ChemicalStability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete Analysis:A Practical Approach(1996)。亦可参照Gibaldi,M.等人，Pharmacokinetics，第2修订版，Marcel Dekker(1982)。
半衰期可使用诸如t1/2-α、t1/2-β、HL_λ_z及曲线下面积(AUC)等参数来表示。在本说明书中，”半衰期的增加”系指这些参数中的任一个、这些参数中的任两个、这些参数中的任三个或这些参数中的所有四个的增加。”半衰期的延长”尤其系指t1/2-β及/或HL_λ_z的增加，同时有或无t1/2-α及/或AUC或二者的增加。
概述
本申请提供针对人类PCSK9的阿德奈汀。为了鉴定PCSK9特异性的拮抗剂，将PCSK9提交至大型阿德奈汀合成文库。对结合至PCSK9的阿德奈汀筛选PCSK9结合、生物物理学性质及PCSK9抑制活性。将抗PCSK9阿德奈汀突变，并通过降低靶物浓度将它们置于进一步选择压力下，选择具有缓慢解离速率(off-rate)的抗PCSK9阿德奈汀。通过此优化过程，将一个阿德奈汀家族鉴定为具有有利的生物化学及生物物理学性质的PCSK9特异性抑制剂。
基于纤连蛋白的支架
本申请的一个方面提供包含Fn3结构域的多肽，其中一或多个溶剂可及环已被随机化或突变。在一些实施方案中，Fn3结构域源自人纤连蛋白III型结构域(10Fn3)的野生型第10模块的Fn3结构域：VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:1)。在10Fn3序列中，BC、DE及FG环带下划线。
如本文所述，可改变10Fn3的非配体结合序列，即“10Fn3支架”，前提为10Fn3保持配体结合功能及/或结构稳定性。已报导多种突变型10Fn3支架。在一个方面中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中的一或多者被替换成另一氨基酸(例如非带负电荷的氨基酸残基(例如，Asn、Lys等))。已报导与野生型形式相比，这些突变在中性pH下具有促进突变10Fn3的更大稳定性的效应(参见，PCT专利申请公开第WO 02/04523号)。以公开了多种其他的10Fn3支架中有益的或中性的改变。例如，参见Batori等人，Protein Eng.15(12):1015-1020(2002年12月)；Koide等人，Biochemistry 40(34):10326-10333(2001年8月28日)。
10Fn3蛋白质的变体与野生型二者都具有相同的结构特征，即命名为A至G的7个β链结构域序列及连结该7个β链结构域序列的6个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环及FG环)。位于最靠近N-及C末端处的β链在溶液中可采取β样构象。在SEQ ID NO:1中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基60-66，且FG环对应于残基76-87(Xu等人，Chemistry&Biology 9:933-942(2002))。
在一些实施方案中，10Fn3多肽可与展示于SEQ ID NO:1中的人10Fn3结构域至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％同一。大部分变化通常会发生在一或多个这些环中。10Fn3多肽的每一个β或β样链均可基本上由与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少80％、85％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列组成，前提为此变化不会破坏多肽在生理条件下的稳定性。
在一些实施方案中，本公开提供包含纤连蛋白III型第10(10Fn3)结构域的多肽，其中该10Fn3结构域包含环AB；环BC；环CD；环DE；环EF；及环FG；且至少一个选自环BC、DE及FG的环具有相对于人10Fn3结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，BC及FG环是经改变的，且在一些实施方案中，BC、DE及FG环是经改变的，即，Fn3结构域包含非天然存在的环。在一些实施方案中，AB、CD及/或EF环是经改变的。”经改变的”意指相对于模板序列(相应人类纤连蛋白结构域)的一处或多处氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、缺失及取代。氨基酸序列的改变可以通过有意的、盲目的或自发的序列变化，通常是核酸编码序列的序列变化来达成，并且可以通过任何技术(例如PCR、易错PCR或化学DNA合成)来进行。
在一些实施方案中，选自BC、DE及FG的一或多个环的长度可相对于相应人类纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可延长2至25个氨基酸。在一些实施方案中，环的长度可减少1至11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，可改变10Fn3环的长度以及序列以获得最大可能的抗原结合灵活性及亲和力。
在一些实施方案中，多肽包含Fn3结构域，所述结构域包含与SEQ ID NO:1的非环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，其中选自BC、DE及FG的至少一个环是经改变的。在一些实施方案中，经改变的BC环具有最多10个氨基酸取代、最多4个氨基酸缺失、最多10个氨基酸***，或其组合。在一些实施方案中，经改变的DE环具有最多6个氨基酸取代、最多4个氨基酸缺失、最多13个氨基酸***，或其组合。在一些实施方案中，FG环具有最多12个氨基酸取代、最多11个氨基酸缺失、最多25个氨基酸***，或其组合。
如上文所述，对应于SEQ ID NO:1的残基21-30、51-56及76-87的氨基酸残基分别界定BC、DE及FG环。然而，应了解，为了实现对期望的靶物(例如，PCSK9)具有强亲和力的10Fn3结合物，并非环区域内的每一个残基都需要进行修饰。
举例而言，如SEQ ID NO:1中所示的BC环的残基21(S)及22(W)无需为了结合PCSK9而进行修饰。亦即，以高亲和力结合PCSK9的10Fn3结构域可通过仅修饰如SEQ ID NO:1所示的环BC的残基23-30来获得。这一点显示于表3中例示的BC环中，其表明仅有跨越阴影位置的残基被改变。因此，在一些实施方案中，根据该指定的BC环包含表3中所示的SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，BC环可包含序列PPPSHGYG(SEQ ID NO:2的残基3-10)、DAPAHAYG(SEQ ID NO:5的残基3-10)、EPFSRLPGGGE(SEQ ID NO:106的残基3-13)或DAPADGGYG(SEQ ID NO:107的残基3-11)。
同样，如SEQ ID NO:1中所示的环DE的位置51(P)及56(T)无需进行修饰以结合PCSK9。亦即，以高亲和力结合PCSK9的10Fn3结构域可通过仅修饰如SEQ ID NO:1所示的环DE的残基52-55来获得。这一点显示于表3中例示的DE环中，其显示仅有跨越阴影位置的残基被改变。因此，在一些实施方案中，根据该指定的DE环包含如表3中所示的SEQ ID NO:18-27及136-141中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，DE环可包含序列PGKG(SEQID NO:18的残基2-5)、VGVG(SEQ ID NO:27的残基2-5)或VSKS(SEQ ID NO:137的残基2-5)。
同样，如SEQ ID NO:1中所示的FG环的位置87(P)无需为了结合PCSK9而进行修饰。亦即，以高亲和力结合PCSK9的10Fn3结构域可通过仅修饰如SEQ ID NO:1所示的环FG的残基76-86来获得。这一点显示于表3中例示的FG环中，其指示仅有跨越阴影位置的残基被改变。因此，在一些实施方案中，根据该指定的FG环包含如表3中所示的SEQ ID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，FG环可包含序列EYPYKHSGYYHR(SEQ ID NO:28中的残基1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO:142中的残基1-12)或EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO:167中的残基1-12)。
在一些实施方案中，本申请揭示，BC、DE及FG环区域可以根据共有序列来概括性地描述。举例而言，BC环可由共有序列SW(X1)ZX2G(SEQ ID NO:323)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸，Z系6至9的数值，且X2为Y或H。表3中所示的BC环，除由SEQ ID NO:106所界定BC环以外，是此共有序列的实例。在其他实施方案中，Z为选自2至5的数值。在某些实施方案中，Z为选自10至15的数值。在一些实施方案中，X2为任意芳香族残基(即，Y、F、W或H)。
在另一实施方案中，DE环可由共有序列PX1X1X1X3T(SEQ ID NO:324)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸，且X3为G或S。表3中所示的DE环是此共有序列的实例。
在另一实施方案中，FG环可由共有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP(SEQ ID NO:325)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F；X5为Y、F或W；且X6为S或A。在某些实施方案中，X4及X5为各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。表3中所示的FG环是此共有序列的实例。。
因此，在某些实施方案中，本公开提供结合PCSK9的阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)ZX2G(SEQ ID NO:323)的BC环、具有序列PX1X1X1X3T(SEQ ID NO:324)的DE环、及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP(SEQ ID NO:325)的FG环，如上文所定义。
在另一实施方案中，本发明提供结合PCSK9的阿德奈汀，其包含具有序列SWEPFSRLPGGGE(SEQ ID NO:106)的BC环、具有序列PX1X1X1X3T(SEQ ID NO:324)的DE环及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP(SEQ ID NO:325)的FG环，如上文所定义。
在某些实施方案中，BC环可由共有序列(X1)ZX2G(SEQ ID NO:449)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸，Z为6至9的数值，且X2为Y或H。表3中所示的BC环，除由SEQ ID NO:106所界定的BC环以外，是此共有序列的实例。在其他实施方案中，Z为选自2至5的数值。在某些实施方案中，Z为选自10至15的数值。在一些实施方案中，X2为任何芳香族残基(即，Y、F、W或H)。
在某些实施方案中，DE环可由共有序列X1X1X1X3(SEQ ID NO:450)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸且X3为G或S。此共有序列由表3中所示的DE环来展示。
在某些实施方案中，FG环可由共有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID NO:451)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F；X5为Y、F或W；且X6为S或A。在一些实施方案中，X4及X5为各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。此共有序列由表3中所示的FG环来展示。
因此，在一个实施方案中，本公开提供结合PCSK9的阿德奈汀，其具有包含序列(X1)ZX2G的BC环、包含序列X1X1X1X3的DE环、及包含序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR的FG环，如上文所定义。
在某些实施方案中，以基于10Fn3支架的抗体样蛋白质可由以下序列来概括性地定义：
EVVAAT(X)aSLLI(X)xYYRITYGE(X)bQEFTV(X)yATI(X)cDYTITVYAV(X)zISINYRT(SEQID NO:328)。
在SEQ ID NO:328中，AB环由Xa表示，CD环由Xb表示，EF环由Xc表示，BC环由Xx表示，DE环由Xy表示，且FG环由Xz表示。X表示任意氨基酸，且X后的下标表示氨基酸数目的整数。具体而言，a可为1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2个氨基酸的范围内的任意值；且b、c、x、y及z可各自独立为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7个氨基酸的范围内的任意值。在优选的实施方案中，a为2个氨基酸，b为7个氨基酸，c为7个氨基酸，x为9个氨基酸，y为6个氨基酸，且z为12个氨基酸。β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个取代、缺失或添加：0至10个、0至8个、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个或0至1个。在例示性实施方案中，β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ IDNO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个保守取代：0至10个、0至8个、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个或0至1个。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸残基以外的残基处发生。
在例示性实施方案中，分别由(X)x、(X)y、及(X)z表示的BC、DE及FG环被用多肽替代，所述多肽包含来自表3中所示的任意PCSK9结合物的BC、DE及FG环序列，或其阴影部分，或共有序列323-325或449-451。
在某些实施方案中，基于10Fn3支架的抗体样蛋白质可由以下序列来概括性地定义：
EVVAATPTSLLI(X)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)yATISGLKPGVD YTITVYAV(X)zISINYRT(SEQ ID NO:329)
在SEQ ID NO:329中，BC环由Xx表示，DE环由Xy表示，且FG环由Xz表示。X表示任意氨基酸，且X后的下标表示氨基酸数目的整数。具体而言，x、y及z可各自独立为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7个氨基酸的范围内的任何值。在优选的实施方案中，x为9个氨基酸，y为6个氨基酸，且z为12个氨基酸。β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个取代、缺失或添加：0至10个、0至8、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个或0至1个。在例示性实施方案中，β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个保守取代：0至10个、0至8个、0至6个、0至5个、0至4个、0至3个、0至2个或0至1个。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸残基以外的残基处发生。在例示性实施方案中，分别由(X)x、(X)y、及(X)z表示的BC、DE及FG环被多肽替代，所述多肽包含来自表3中所示的任意PCSK9结合物的BC、DE及FG环序列，或其阴影部分，或共有序列323-325或449-451。
在某些实施方案中，本文所述抗PCSK9阿德奈汀可包含如SEQ ID NO:328或329中所述的序列，其中分别由(X)x、(X)y及(X)z所表示的BC、DE及FG环被替代为来自表3中任意克隆的指定BC、DE及FG环的相应集合或与表3中所列出的克隆的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一的序列。在例示性实施方案中，本文所述抗PCSK9阿德奈汀由SEQ ID NO:329来定义，且具有来自表3中所列出的任意克隆的BC、DE及FG环序列的相应集合。举例而言，表3中的克隆1459D05包含分别如SEQ ID NO:2、18及28所述的BC、DE及FG环。因此，基于这些环的抗PCSK9阿德奈汀可包含SEQ ID NO:328或329，其中(X)x包含SEQ ID NO:2，(X)y包含SEQ ID NO:18，且(X)z包含SEQ ID NO:28。涵盖利用表3中其他克隆的BC、DE及FG环的集合、或共有序列323-325或449-451的相似构建体。此类抗PCSK9阿德奈汀的支架区域可相对于SEQ ID NO:1的支架氨基酸残基包含下列范围中的任意个取代、保守取代、缺失或添加：0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1。只要抗PCSK9阿德奈汀能够以期望KD结合PCSK9即可作出这些支架修饰。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自下组的氨基酸序列：SWPPPSHGYG(SEQ ID NO:2)、SWRPPIHAYG(SEQ ID NO:3)、SWDAPIHAYG(SEQ ID NO:4)、SWDAPAHAYG(SEQ ID NO:5)及SWDAPAVTYG(SEQ ID NO:6)、SWSPPANGYG(SEQ ID NO:7)、SWTPPPKGYG(SEQ ID NO:8)、SWRPPSHAYG(SEQ ID NO:9)、SWDPPSHAYG(SEQ ID NO:10)、SWEPPSHAYG(SEQ ID NO:11)、SWSPPSHAYG(SEQ ID NO:12)、SWRPPSNGHG(SEQ ID NO:13)、SWVPPSDDYG(SEQ ID NO:14)、SWVPSSHAYG(SEQ ID NO:15)、SWDPSSHAYG(SEQ ID NO:16)、及SWEPSSHAYG(SEQ ID NO:17)。在其他实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自SEQ IDNO:106-135及301-303的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含如表3中所示的SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，BC环包含序列PPPSHGYG(SEQ ID NO:2的残基3-10)、DAPAHAYG(SEQ ID NO:5的残基3-10)、EPFSRLPGGGE(SEQ ID NO:106的残基3-13)或DAPADGGYG(SEQ ID NO:107的残基3-11)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自下组的氨基酸序列：PPGKGT(SEQ ID NO:18)、PIVEGT(SEQ ID NO:19)、PGSEGT(SEQ ID NO:20)、PGSKGT(SEQ ID NO:21)、PGSKST(SEQ ID NO:22)、PVGRGT(SEQ ID NO:23)、PVGEGT(SEQ ID NO:24)、PIGKGT(SEQID NO:25)、PVNEGT(SEQ ID NO:26)、及PVGVGT(SEQ ID NO:27)。在其他实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自SEQ ID NO:136-141的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含如表3中所示的SEQ ID NO:18-27及136-141中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，DE环包含序列PGKG(SEQ ID NO:18的残基2-5)、VGVG(SEQ ID NO:27的残基2-5)或VSKS(SEQ ID NO:137的残基2-5)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自下组的氨基酸序列：EYPYKHSGYYHRP(SEQ ID NO:28)、EYTFKHSGYYHRP(SEQ ID NO:29)、EYTYKGSGYYHRP(SEQ IDNO:30)、EYTYNGAGYYHRP(SEQ ID NO:31)、EYTYIGAGYYHRP(SEQ ID NO:32)、EYTYEGAGYYHRP(SEQ ID NO:33)、EYAYNGAGYYHRP(SEQ ID NO:34)、EYPWKGSGYYHRP(SEQ ID NO:35)、EFPFKWSGYYHRP(SEQ ID NO:36)、EFPWPHAGYYHRP(SEQ ID NO:37)及EYAFEGAGYYHRP(SEQ IDNO:38)。在其他实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自SEQ ID NO:142-172的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含如表3中所示的SEQ ID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，FG环包含序列EYPYKHSGYYHR(SEQID NO:28中的残基1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO:142中的残基1-12)或EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO:167的残基1-12)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质包含一个BC环序列，其选自具有SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303、或如表3中所展示的SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分的BC环序列；一个DE环序列，其选自具有SEQ ID NO:18-27及136-141、或如表3中所展示的SEQ ID NO:18-27及136-141中任一者的阴影部分的DE环序列；及一个FG环序列，其选自SEQ ID NO:28-38及142-172、或具有如表3中所展示的SEQ ID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分的FG环序列。在一些实施方案中，本发明蛋白质包含与SEQ ID NO:2-38、106-172、301-303中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的BC、DE及FG环氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明的蛋白质包含与如表3中所示的SEQ ID NO:2-38、106-172、301-303中任一者的阴影部分至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的BC、DE及FG环氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO:39-76、173-290及304-309中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO:39-76、173-290及304-309中任一者的位置3-96的Fn3结构域氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含与SEQ ID NO:39-76、173-290及304-309中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
纤连蛋白天然地经由其整联蛋白结合基序”精氨酸-甘氨酸～天冬氨酸”(RGD)结合某些类型的整联蛋白。在一些实施方案中，多肽包含缺乏(RGD)整联蛋白结合基序的10Fn3结构域。可通过氨基酸取代、缺失或***改变RGD序列来去除整联蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本发明的抗PCSK9阿德奈汀分子可经修饰以包含N末端延伸序列及/或C末端延伸。举例而言，MG序列可位于由SEQ ID NO:1所界定10Fn3的N末端处。通常M将被切除，在N末端处留下G。或者，可用如表6中所展示的备选N末端序列(在本文中称作N末端延伸)(即，SEQ ID NO:371-379)来替代表4中所示的抗PCSK9阿德奈汀的前10个氨基酸。另外，M、G或MG亦可位于任何具有SEQ ID NO:371-379的N末端延伸的N末端侧。本文所述抗PCSK9阿德奈汀亦可包含备选C末端尾序列(在本文中称作C末端延伸序列)。举例而言，表4中所展示的抗PCSK9阿德奈汀序列可在对应于SEQ ID NO:1的T94的苏氨酸处截短(即，在该序列的INYRT部分之后截短)。可使用此截短形式作为呈截短形式的治疗分子，或可在苏氨酸残基后添加备选的C末端延伸。例示性C末端延伸序列作为SEQ ID NO:380-395展示于表6中。包含C末端延伸序列的例示性抗PCSK9阿德奈汀展示于表4中。举例而言，SEQ ID NO:49(克隆1813E02)依次包含天然存在的C末端延伸EIDKPSQ(SEQ ID NO:380)及His6标签。然而，应了解，His6标签完全是可选的。
在某些实施方案中，C末端延伸序列(亦称为”尾”)包含E及D残基，且长度可为介于8个与50个氨基酸之间、10个与30个氨基酸之间、10个与20个氨基酸之间、5个与10个氨基酸之间、及2个与4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾序列包括基于ED的接头，其中该序列包含ED的串联重复。在例示性实施方案中，尾序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾序列亦可包括额外氨基酸残基，例如：EI、EID、ES、EC、EGS及EGC。这些序列部分基于已知的阿德奈汀TM尾序列，例如EIDKPSQ(SEQ ID NO:380)，其中残基D及K已被去除。在例示性实施方案中，基于ED的尾在ED重复前包含E、I或EI残基。
在其他实施方案中，当设计抗PCSK9阿德奈汀融合分子时，N或C末端序列可视需要与其他已知接头序列(例如，表6中的SEQ ID NO:396-419)组合。包含接头序列的例示性抗PCSK9阿德奈汀展示于表4中(例如，SEQ ID NO:53、55及57)。在一些实施方案中，可在10Fn3结构域的C末端处放置序列以便于药动学部分的附接。举例而言，可将诸如GSGC(SEQ IDNO:77)等含有半胱氨酸的接头添加至C末端，以便于对半胱氨酸残基进行定点聚乙二醇化。
药动学部分
在一个方面中，本申请提供进一步包含药动学(PK)部分的抗PCSK9阿德奈汀。改善的药动学可根据认识到的治疗需要来评估。通常，增加生物利用度及/或延长剂量间隔时间是理想的，这可能通过增加蛋白质给药后在血清中保持可用的时间来实现。在一些情况下，提高蛋白质血清浓度随时间的连续性(例如，减小刚施用后与即将施用前蛋白质血清浓度的差异)是理想的。可以将抗PCSK9阿德奈汀可附接至这样的部分，该部分将该多肽在哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人类)中的清除率降低至相对于未经修饰的抗PCSK9阿德奈汀小于1/3。改善的药动学的其他量度可包括血清半衰期，血清半衰期通常分为α阶段及β阶段。此两个阶段中的任一个或二者可通过添加合适的部分来显著改善。
倾向于延缓蛋白质自血液清除的部分(本文中称为”PK部分”)包括聚氧化烯部分(例如，聚乙二醇、糖(例如唾液酸))及耐受良好的蛋白质部分(例如，Fc及其片段及变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。抗PCSK9阿德奈汀可融合至白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体，如美国专利申请公开第20070048282号中所述。在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀可融合至一或多个如本文所述的结合血清白蛋白的阿德奈汀(serum albumin bindingAdnectin)。
在一些实施方案中，PK部分是血清白蛋白结合蛋白(serum albumin bindingprotein)，例如美国专利申请公开第2007/0178082号及第2007/0269422号中记载者。
在一些实施方案中，PK部分是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如美国专利申请公开第2007/0178082号中记载者。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含聚乙二醇(PEG)。一或多个PEG分子可附接于蛋白质上的不同位置，并且这样的附接可通过与胺、硫醇或其他适宜的反应基团反应来达成。胺部分可以是例如存在于多肽的N末端、或诸如赖氨酸或精氨酸等氨基酸中的胺基团处的一级胺。在一些实施方案中，PEG部分附接于多肽上选自下组的位置：a)N末端；b)介于N末端与最靠N末端的β链或β样链之间；c)位于多肽上与靶结合位点对置的面上的环；d)介于C末端与最靠C末端的β链或β样链之间；及e)在C末端。
聚乙二醇化可通过定点聚乙二醇化来达成，其中将适宜反应基团引入蛋白质中以产生优先发生聚乙二醇化的位点。在一些实施方案中，对蛋白质进行修饰以在期望位置处引入半胱氨酸残基，从而允许对该半胱氨酸进行定点聚乙二醇化。PEG的分子量可大幅度变化，且可具支链或为直链。在一个实施方案中，PEG具有两条支链。在另一实施方案中，PEG具有4条支链。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀融合至免疫球蛋白Fc结构域、或其片段或变体。在例示性实施方案中，Fc结构域源自IgG1亚类，然而，亦可使用其他亚类(例如，IgG2、IgG3及IgG4)。下文所示的是人类IgG1免疫球蛋白Fc结构域的序列，且根据EU编号格式标明了Fc结构域内每一区域的相对位置：
Figure BDA0000786597750000231
Figure BDA0000786597750000232
DKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:315)
核心铰链序列加下划线，且CH1区域为斜体；CH2及CH3区域为普通文本。应理解的是，C末端的赖氨酸是可选的。
所述融合物可通过将抗PCSK9阿德奈汀附接至Fc分子的任一端来形成，即，Fc-抗PCSK9阿德奈汀或抗PCSK9-阿德奈汀-Fc排列。在某些实施方案中，Fc与抗PCSK9阿德奈汀经由接头融合。例示性接头序列包括AGGGGSG(SEQ ID NO:310)、GSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:311)、QPDEPGGS(SEQ ID NO:312)、ELQLEESAAEAQDGELD(SEQ ID NO:313)、TVAAPS(SEQ IDNO:314)、KAGGGGSG(SEQ ID NO:620)、KGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:621)、KQPDEPGGS(SEQ IDNO:622)、KELQLEESAAEAQDGELD(SEQ ID NO:623)、KTVAAPS(SEQ ID NO:624)、KAGGGGSGG(SEQ ID NO:625)、KGSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO:626)、KQPDEPGGSG(SEQ ID NO:627)、KELQLEESAAEAQDGELDG(SEQ ID NO:628)、KTVAAPSG(SEQ ID NO:629)、AGGGGSGG(SEQ IDNO:630)、GSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO:631)、QPDEPGGSG(SEQ ID NO:632)、ELQLEESAAEAQDGELDG(SEQ ID NO:633)及TVAAPSG(SEQ ID NO:634)。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀融合物中所用Fc区域包含Fc分子的铰链区域。本文所用”铰链”区域包含跨越IgG1的SEQ ID NO:315中位置104-119的核心铰链残基(DKTHTCPPCPAPELLG；SEQ ID NO:316)，其对应于按照EU编号法的位置221-236。在某些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀-Fc融合物采取多聚体结构(例如，二聚体)，此部分地是由于SEQID NO:315在铰链区域内的位置109及112(EU编号分别为226及229)处具有半胱氨酸残基。在其他实施方案中，本文所用的铰链区域可进一步包括源自位于核心铰链序列两侧的CH1及CH2区域的残基，如SEQ ID NO:315中所示的。
在一些实施方案中，铰链序列可包括赋予的期望药动学性质、生物物理学性质及/或生物学性质的取代。一些例示性铰链序列包括EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:317；核心铰链区域带下划线)、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:318；核心铰链区域带下划线)、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:319；核心铰链区域带下划线)、DKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO:320；核心铰链区域带下划线)、及DKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO:321；核心铰链区域带下划线)。在一个实施方案中，SEQ ID NO:315的位置122(EU编号238)处的残基P已被S替代以消除Fc效应物功能；具有SEQ ID NO:318、319及321中的任一者的铰链中示例了该替代。在另一实施方案中，SEQ ID NO:315的位置104-105(EU编号221-222)处的残基DK已被GS替代以去除潜在的回形针(clip)位点；SEQ ID NO:319中示例了此替代。在另一实施方案中，SEQ ID NO:315的位置103(EU编号220)处的C已被S替代以防止在不存在轻链时形成不适当的胱氨酸键；SEQ ID NO:317-319中示例了此替代。
在某些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀-Fc融合物可具有以下构型：1)抗PCSK9阿德奈汀-铰链-Fc或2)铰链-Fc-抗PCSK9阿德奈汀。因此，任何本发明的抗PCSK9阿德奈汀皆可融合至包含根据这些构型的铰链序列的Fc区域。在一些实施方案中，可使用接头将抗PCSK9阿德奈汀与铰链-Fc部分接合，举例而言，一种例示性融合蛋白质可具有构型铰链-抗PCSK9阿德奈汀-接头-Fc。另外，依赖于产生融合多肽的***，融合多肽的N末端处可以放置前导序列。举例而言，若在哺乳动物***中产生融合物，则可将诸如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQID NO:326)等前导序列添加至融合分子的N末端。若在大肠杆菌(E.coli)中产生融合物，则融合序列的前端将为甲硫氨酸。
以下序列例示哺乳动物***中产生的抗PCSK9阿德奈汀-铰链-Fc构建体：
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EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:322)。此处，Fc结构域包含如下人类IgG1CH2及CH3区域：VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:448)及SEQ ID NO:319的铰链序列。在SEQ ID NO:322中，前导序列以粗体表示，抗PCSK9阿德奈汀序列以斜体表示，且铰链区域带下划线。应理解，SEQ ID NO:322末端处的赖氨酸是可选的。如SEQ ID NO:322中所示的多肽融合物(本文中亦称为PRD460)的效力展示于实施例4中。
表1中展示了例示性PCSK9阿德奈汀-Fc融合物。所有序列皆可以甲硫氨酸或哺乳动物前导序列(例如，SEQ ID NO:326)起始。
表1.例示性抗PCSK9阿德奈汀-Fc融合蛋白质
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在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含Fn3结构域及PK部分。在一些实施方案中，Fn3结构域是10Fn3结构域。在一些实施方案中，相对于单独的Fn3结构域，PK部分使所述多肽的血清半衰期延长5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、400％、600％、800％、1000％或更多。
在一些实施方案中，PK部分是聚合糖。在一些实施方案中，PK部分是聚乙二醇部分。在一些实施方案中，PK部分是血清白蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，PK部分是人血清白蛋白。在一些实施方案中，PK部分是血清免疫球蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，PK部分是转铁蛋白。
在一些实施方案中，PK部分是对血清蛋白(例如，HSA)具有特异性的另一阿德奈汀。本申请提供如本文所述的特异性的结合血清白蛋白的阿德奈汀分子(或SABA)。在某些实施方案中，融合至SABA的PCSK9阿德奈汀可概括性地定义如下：X1-PCSK9阿德奈汀核心-X2-X3-X4-SABA核心-X5(SEQ ID NO:618)或X1-SABA核心-X2-X3-X4-PCSK9阿德奈汀核心-X5(SEQ ID NO:619)，其中X1及X4表示任选的N末端延伸序列，X2及X5表示任选的C末端延伸序列，且X3为接头。在一个实施方案中，SEQ ID NO:618及619的阿德奈汀(结合PCSK9或血清白蛋白的)包含阿德奈汀的”核心”区域，即，PCSK9阿德奈汀核心序列可以是表4中所示的PCSK9阿德奈汀序列中的任一个，其中该序列始于对应于SEQ ID NO:1的E8的氨基酸残基，且止于对应于SEQ ID NO:1的残基T94的氨基酸；且SABA核心序列可选自表6中所示的SABA核心序列中的任一个。
在一些实施方案中，X1及X4是独立可选的，且当其存在时，独立地选自表6中所列示的SEQ ID NO:371-379，且当不存在M、G或MG序列时，可视情况在N末端处包含这些残基。对于哺乳动物***中的表达而言，融合蛋白质可在N末端处进一步包含前导序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:326)。在一些实施方案中，X2及X5是独立可选的，且在其存在时，独立地选自表6中所列示的SEQ ID NO:380-395。在某些实施方案中，X3是选自表6中所列的SEQ ID NO:396-419的接头序列。表2中所示的序列表示抗PCSK9阿德奈汀与SABA的例示性融合物。应了解，本申请中所述的任意PCSK9阿德奈汀及SABA序列皆可纳入这些构型中。
表2.例示性PCSK9阿德奈汀-SABA融合序列
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生物物理学及生物化学表征
本申请提供包含结合至PCSK9的Fn3结构域的阿德奈汀。可以用平衡常数(例如，解离，KD)及动力学常数(例如，结合速率常数Kon及解离速率常数koff)来评估多肽与靶分子的结合。阿德奈汀通常将以小于500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、100pM的KD结合至靶分子，但在Koff足够低或Kon足够高的场合，更高的KD值是可以容忍的。
本发明的抗PCSK9阿德奈汀的BC、DE及FG环的SEQ ID NO提供于表3中。
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核酸-蛋白质融合技术
在一个方面中，本申请提供包含纤连蛋白III型结构域的、可结合PCSK9的阿德奈汀。一种快速制作并测试具有特异性结合性质的Fn3结构域的方法是Adnexus(Bristol-Myers Squibb的一家研发公司)的核酸-蛋白质融合技术。本公开利用称为PROfusion的体外表达及标签技术，其采用核酸-蛋白质融合物(RNA-及DNA-蛋白质融合物)来鉴定对于与蛋白质的结合而言重要的新颖多肽及氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术是使蛋白质共价偶联至其编码的遗传信息的技术。关于RNA-蛋白质融合技术及基于纤连蛋白的支架蛋白质文库筛选方法的详细说明，参见Szostak等人，美国专利第6,258,558号、第6,261,804号、第6,214,553号、第6,281,344号、第6,207,446号、第6,518,018号及第6,818,418号及Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,94:12297-12302(1997)，其以引用方式并入本文中。
载体及多核苷酸实施方案
编码本文所公开的各种蛋白质或多肽中的任一者的核酸可化学合成。可选择密码子用法以改善在细胞中的表达。这些密码子用法将取决于所选定的细胞类型。已研发出针对大肠杆菌及其他细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞及昆虫细胞的专用密码子使用模式。例如，参见：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):438-442(2003年1月21日)；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.,26(I):96-105(2002年10月)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5):446-449(2001年10月)；Makrides等人，MicrobiolRev.,60(3):512-538(1996年9月)；及Sharp等人，Yeast,7(7):657-678(1991年10月)。
核酸操作的通用技术阐述于例如以下文献中：Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，第1至3卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，或Ausubel,F.等人，Current Protocols in Molecular Biology,GreenPublishing and Wiley-Interscience,New York(1987)及周期性更新，其以引用方式并入本文中。通常，将编码多肽的DNA可操作地连接至源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适宜转录或翻译调节元件。这些调节元件包括转录启动子、可选的控制转录的操纵基因序列、编码适宜mRNA核糖体结合位点的序列、及控制转录及翻译终止的序列。另外引入在宿主中复制的能力(该能力一般由复制起点赋予)以及帮助识别转化体的选择基因。
本文所述的蛋白质不仅可以重组方式直接产生，且亦可作为与异源多肽的融合多肽以重组方式来产生，该异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切断位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切断)的。在哺乳动物***中产生多肽的一种示例性N末端前导序列是METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:326)，其在表达后被宿主细胞去除。
对于不识别及加工天然信号序列的原核宿主细胞而言，可用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代该信号序列。
对于酵母分泌而言，天然信号序列可例如取代为：酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列、或美国专利第5,631,144号中所述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如单纯疱疹gD信号。可以将这些前体区的DNA与编码蛋白质的DNA连接在阅读框中。
表达载体及克隆载体二者均含有使载体能在一种或多种选定的宿主细胞内复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是使载体能独立于宿主染色体DNA复制的序列，其包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母、及病毒而言，这些序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适用于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可使用SV40起点，只是由于其含有早期启动子)。
表达及克隆载体可含有选择基因，其亦称为选择标记。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄西林(ampicillin)、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补足营养缺陷型不足，或(c)供给无法自复合培养基中获得的关键营养素，例如对于芽孢杆菌(Bacilli)而言编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
表达及克隆载体通常含有被宿主生物识别且与编码本发明蛋白质(例如，基于纤连蛋白的支架蛋白质)的核酸可操作地连接的启动子。适合与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子***、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***、及杂合启动子(例如tan启动子)。然而，其他已知细菌启动子也是适合的。用于细菌***的启动子亦可含有与编码本发明蛋白质的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。对于真核生物而言，启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因都具有AT-富集区，其位于转录起始的位点上游约25至30个碱基处。另一种在许多基因的转录起始点上游70至80个碱基处发现的序列是CNCAAT区，其中N可为任意核苷酸。在大多数真核基因的3'端处为AATAAA序列，其可能是向编码序列的3'端添加多聚A尾的信号。所有这些序列均以适当方式***真核生物表达载体中。
用于酵母宿主的适宜启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(例如，烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、及葡糖激酶)的启动子。
在哺乳动物宿主细胞中自载体转录可受(例如)以下启动子控制：自病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选猿猴病毒(Simian Virus)40(SV40))基因组获得的启动子、自异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)获得的启动子、自热激启动子获得的启动子，前提为这些启动子皆与宿主细胞***相容。
通常可通过将增强子序列***载体中来增强高等真核生物对编码本发明蛋白质的DNA的转录。当前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白及胰岛素)的增强子序列。然而，典型地使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点晚期侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子及腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件亦可参见Yaniv,Nature,297：17-18(1982)。增强子剪接至载体中肽编码序列的5'或3'侧的位置，但优选位于启动子5'侧的位点。
用于真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类细胞或来自其他多细胞生物的有核细胞)中的表达载体还会含有终止转录及稳定化mRNA所需的序列。这些序列通常可自真核生物或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区，偶尔可自3'非翻译区获得。这些区域含有在编码本发明蛋白质的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO94/11026及本文所公开的表达载体。
重组DNA亦可包括可用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。与细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主一起使用的合适克隆及表达载体可参见Cloning Vectors:ALaboratory Manual,(Elsevier,New York(1985))，其相关公开内容以引用方式并入本文中。
使用适于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中，如本领域技术人员容易想到的。多种用于将核酸引入至宿主细胞中的方法是现有技术中已知的，其包括但不限于电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂质体转染；及感染(其中载体系感染剂)。
适宜的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。适宜的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌属(Bacillus spp)。优选地，亦可使用来自酵母属物种的酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)来产生多肽。亦可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养***来表达重组蛋白质。Luckow等人对在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒***进行了综述(Bio/Technology,6:47(1988))。适宜的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾细胞、HeLa、293、293T及BHK细胞系。通过培养适宜宿主/载体***以表达重组蛋白质来制备纯化的多肽。对于许多应用而言，本文所公开的许多多肽的小尺寸将使在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。随后自培养基或细胞提取物纯化蛋白质。
蛋白质生产
用本文所述的用于蛋白质生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，且在经修饰以适于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中进行培养。在此处所展示的实例中，用于高通量蛋白质生产(HTPP)及中等规模生产的宿主细胞是HMS174-细菌菌株。可在多种培养基中培养用于生产本发明蛋白质的宿主细胞。诸如Ham'sF10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)、Sigma))等市售培养基适于培养这些宿主细胞。另外，可使用Ham等人，Meth.Enzymol.,58:44(1979)；Barites等人，Anal.Biochem.,102:255(1980)；美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、第5,122,469号、第6,048,728号、第5,672,502号；或美国专利第RE 30,985号中所述的任何培养基作为宿主细胞的培养基。可根据需要向这些培养基中的任一者中补加激素及/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷及胸苷)、抗生素(例如庆大霉素(Gentamycin)药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可以本领域技术人员可以知道的适当浓度纳入其他任何必要的补充物。培养条件，诸如温度、pH等，是先前用来表达选定的宿主细胞时所使用的条件，且应为本领域技术人员所明了。
还可使用细胞翻译***来产生本文所公开的蛋白质。为此目的，编码多肽的核酸必须经修饰以允许进行体外转录以产生mRNA，并允许mRNA在所用的特定无细胞***(真核生物(例如哺乳动物或酵母)无细胞翻译***或原核(例如细菌)无细胞翻译***)中进行无细胞翻译。
还可通过化学合成(例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，ThePierce Chemical公司，Rockford,IL(1984)中阐述的方法)来产生本发明蛋白质。还可通过化学合成来产生蛋白质的修饰。
可通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化本发明蛋白质。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，利用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析、亲和层析、电泳、逆流分配或这些方法的任何组合。在纯化后，可将多肽交换至不同缓冲液中及/或通过本领域已知的多种方法中的任一者(包括但不限于过滤及透析)来浓缩。
经纯化的多肽为优选至少85％纯、或优选至少95％纯且最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值为多少，多肽的纯度皆足以用作医药产品。
使用平台制造方法来制备抗PCSK9阿德奈汀。抗PCSK9阿德奈汀在大肠杆菌(E.coli)中产生。大肠杆菌BLR(DE3)细胞用表达载体(pET9d/ATI001173)转化，该表达载体在细胞内产生呈可溶形式的蛋白质。使重组菌株在搅拌罐发酵器中生长。发酵结束时，收集细胞，将其裂解并澄清以准备用于纯化。ATI001173是ATI001114的无his标签形式。使用马来酰亚胺接头使经纯化的抗PCSK9阿德奈汀与40kDa具支链的甲氧基PEG缀合。随后将缀合物再纯化以去除游离PEG、游离抗PCSK9阿德奈汀及产物相关杂质。对原料药物实施质量控制测试。
体内治疗用途
在一个方面，本申请提供可用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的抗PCSK9阿德奈汀。本申请亦提供向受试者施用抗PCSK9阿德奈汀的方法。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀是对于哺乳动物、尤其人类而言是可药用的。”可药用”的多肽是指施用动物而无显著不良医疗后果(例如基本上不含内毒素或内毒素水平极低)的多肽。
制剂及施用
本申请进一步提供包含本文所述抗PCSK9阿德奈汀或其融合蛋白质的可药用的组合物，其中该组合物基本上不含内毒素。通过将具有期望纯度的所述多肽与可选的生理上可接受的担载体、赋形剂或稳定剂(Osol,A.,Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980))混合来制备包含抗PCSK9阿德奈汀或其融合物的治疗制剂以用于储存，这些制剂呈水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式。可接受的担载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对接受者无毒性，且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鳌合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；及/或非离子型表面活性剂，例如Tween、
Figure BDA0000786597750001721
或聚乙二醇(PEG)。
本发明制剂还可视需要含有超过一种用于所治疗特定适应症的活性化合物，优选地是具有相互间不会产生不利影响的互补活性者。这些分子以对欲达成目的有效的量以适宜的组合形式存在。
用于活体内施用的制剂必须无菌。此可通过经由无菌过滤膜过滤来容易地达成。
本领域技术人员应了解，各治疗剂的剂量将依赖于药剂的身份而定。
对于治疗应用而言，将抗PCSK9阿德奈汀或包含抗PCSK9阿德奈汀的融合蛋白质以可药用的剂型施用给受试者。其可以作为推注或通过经一段时间的连续输注来静脉内施用，或通过皮下途径施用。可药用的适宜担载体、稀释剂及赋形剂是公知的，且可由本领域技术人员根据临床情况需要来确定。适宜的担载体、稀释剂及/或赋形剂的实施例包括：(1)达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate buffered saline)、(2)0.9％盐水(0.9％w/v NaCl)及(3)5％(w/v)右旋糖。
本发明方法可在体外、体内或离体实施。
可如上文针对治疗应用所述的那样以共施用或顺序施用方式来施用抗PCSK9阿德奈汀或其融合蛋白与一或多种额外治疗剂。本领域技术人员应了解，用于共施用的可药用的适宜担载体、稀释剂及赋形剂将依赖所施用特定治疗剂的身份而定。
当蛋白质以水性剂型而非冻干形式存在时，其通常将以约0.1mg/ml至100mg/ml的浓度来调配，但允许使用超出这些范围外的多种浓度。对于治疗疾病而言，抗PCSK9阿德奈汀或其融合物的合适剂量将取决于：待治疗的疾病类型、疾病严重程度及病程、施用该蛋白质的目的是预防或是治疗、先前疗程、患者临床史及对该蛋白质的反应，以及主治医师的裁量。该蛋白质一次性或经一系列治疗以适当方式施用给患者。
结合血清白蛋白的阿德奈汀(SABA)的融合物
在某些方面中，本申请提供包含与10Fn3结构域融合且可结合人类血清白蛋白的抗PCSK9-阿德奈汀的融合蛋白(结合血清白蛋白的阿德奈汀(10Fn3结构域)或SABA)。这些融合蛋白质在白蛋白存在下可相对于单独抗PCSK9阿德奈汀(例如，不与PK部分缀合)延长血清半衰期。
10Fn3结构域由于约10kDa的小尺寸而经由肾过滤及降解，自循环快速清除(t1/2＝15-45分钟，在小鼠中；1-3小时，在猴中)。可利用10Fn3结构域(例如抗PCSK9阿德奈汀)与包含特异性结合至血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA))的10Fn3结构域的第二多肽的融合物来延长抗PCSK9阿德奈汀的t1/2。
在某些实施方案中，融合至SABA的抗-PCSK9-阿德奈汀的血清半衰期相对于抗PCSK9-阿德奈汀在不偶联至SABA时的血清半衰期得到增加。在某些实施方案中，相对于抗PCSK9-阿德奈汀在不融合至SABA时的血清半衰期，SABA融合物的血清半衰期长至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％、1000％、1200％、1500％、1800％、1900％、2000％、2500％或3000％。在其他实施方案中，SABA融合物的血清半衰期为抗PCSK9-阿德奈汀在不融合至SABA时的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在一些实施方案中，SABA融合物的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。
在某些实施方案中，SABA融合蛋白质中结合血清白蛋白的部分以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pM或10pM的KD结合至HSA。在某些实施方案中，SABA融合蛋白质中结合血清白蛋白的部分在25℃或37℃下在5.5至7.4的pH范围下以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pM或10pM的KD结合至HSA。在一些实施方案中，与在pH 7.4的结合相比，SABA融合蛋白质中结合血清白蛋白的部分在小于7.4的pH更紧密地结合至HSA。
因此，本文所述SABA融合分子可用于通过形成抗PCSK9-阿德奈汀与SABA之间的融合物来延长抗PCSK9-阿德奈汀的半衰期。这些融合分子可用来治疗对PCSK9的生物活性有反应的状况。本发明涵盖SABA融合分子在由PCSK9失调所引起的疾病中的用途。
融合物可通过将抗PCSK9-阿德奈汀附接至SABA分子的任一端来形成，即，SABA-抗PCSK9-阿德奈汀或抗PCSK9-阿德奈汀-SABA的排列。
HSA在人体中的血清浓度为600μM，t1/2为19天。HSA的t1/2的延长的部分原因被归于其经由新生Fc受体(FcRn)的再循环。HSA在经内体被摄入内皮细胞中后以pH依赖性方式结合FcRn；此相互作用使HSA再循环而返回血流，藉此使其避开溶酶体降解。FcRn具有广泛表达，且再循环途径被认为是组成型。在大多数细胞类型中，多数FcRn位于细胞内的分类内体中。HSA可通过一种非特异性机制——体液相胞饮作用而容易地内在化，且并通过FcRn的作用避免在溶酶体中降解。在内体中存在的酸性pH下，HSA对FcRn的亲和力有所增加(5μM，在pH 6.0下)。HSA在与FcRn结合后，可避开溶酶体降解途径，经转胞吞作用在细胞表面释放。
在某些实施方案中，本文所述的SABA融合蛋白质中结合血清白蛋白的部分亦可结合来自猴、大鼠或小鼠中的一或多者的血清白蛋白。在某些实施方案中，本文所述的SABA融合蛋白质中结合HSA的部分以小于3μM、2.5μM、2μM、1.5μM、1μM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM或100pM的KD结合至猕猴血清白蛋白(RhSA)或食蟹猴血清白蛋白(CySA)。
在某些实施方案中，本文所述的SABA融合蛋白质中结合血清白蛋白的部分结合至HSA的结构域I及/或结构域II。在一个实施方案中，本文所述SABA融合蛋白质中结合HSA的部分不结合至HSA的结构域III。
在某些实施方案中，SABA融合蛋白质中结合血清白蛋白的部分包含与野生型10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％或85％同一性的序列。在一个实施方案中，BC、DE或FG环的中至少一个相对于野生型10Fn3结构域是经修饰的。在另一实施方案中，BC、DE或FG环中的至少二个相对于野生型10Fn3结构域是经修饰的。在另一实施方案中，BC、DE及FG环中的所有三个相对于野生型10Fn3结构域都是经修饰的。在其他实施方案中，SABA包含与表6中所示的26个核心SABA序列(即，SEQ ID NO:334、338、342、346及348-370)中的任一者或表6中所示的延伸的SABA序列(即，SEQ ID NO:420-447，不含6xHIS标签)中的任一者具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列。
在某些实施方案中，基于10Fn3支架的结合血清白蛋白的阿德奈汀可由以下序列来概括性地定义：
EVVAAT(X)aSLLI(X)xYYRITYGE(X)bQEFTV(X)yATI(X)cDYTITVYAV(X)zISINYRT(SEQID NO:328)。
在某些实施方案中，基于10Fn3支架的结合血清白蛋白的阿德奈汀可由以下序列来概括性地定义：
EVVAATPTSLLI(X)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)yATISGLKPGVDYTITVYAV(X)zISINYRT(SEQ ID NO:329)。
如本文针对抗PCSK9阿德奈汀所述，SEQ ID NO:328及329可以按照相同方式定义并应用于SABA分子。在例示性实施方案中，分别由(X)x、(X)y、及(X)z表示的BC、DE及FG环被如下所述的多肽替代：这些多肽包含下表6中所示的HSA结合物(即，表6中的SEQ ID NO:330、334、338、342、346及348-370)中任一者的BC、DE及FG环序列。在某些实施方案中，表6中所显示的BC、DE或FG环序列可含有一或多个位于N-及/或C末端两侧的额外残基。特别地，在替代SEQ ID NO:328中的(X)x时，BC环在表6中所示的BC环序列的N末端可含有SW。同样，在替代SEQ ID NO:328中的(X)y时，DE环可含有在环DE之前的P及在环DE之后的残基T。在替代SEQ ID NO:328中的(X)z时，FG环可含有在FG环之后的P。举例而言，SEQ ID NO:330指示BC、DE及FG环分别包含HSYYEQNS(SEQ ID NO:638)、YSQT(SEQ ID NO:639)及YGSKYYY(SEQ IDNO:640)。然而，在替代SEQ ID NO:328中的(X)x、(X)y及(X)z(即，BC、DE及FG环)时，(X)x序列可以是SWHSYYEQNS(SEQ ID NO:641)，(X)y序列可以是PYSQTT(SEQ ID NO:642)，且(X)z序列可为YGSKYYYP(SEQ ID NO:643)。
在某些实施方案中，用于本文所述融合物中的SABA可包含如SEQ ID NO:328或329中所述的序列，其中分别由(X)x、(X)y及(X)z表示的BC、DE及FG环被替换为来自26个核心SABA序列(即表6中的SEQ ID NO:330、334、338、342、346及348-370)中的任一者的指定BC、DE及FG环的相应集合或与26个核心SABA序列的BC、DE及FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一的序列。在例示性实施方案中，本文所述的SABA由SEQ IDNO:329来定义，且具有来自26个核心SABA序列(即表6中的SEQ ID NO:330、334、338、342、346及348-370)中任意者的BC、DE及FG环序列的集合，并任选在上文所述环序列上具有N-及/或C末端添加。举例而言，SABA1具有如SEQ ID NO:330中所述的核心序列、且包含分别如SEQ ID NO:331-333中所述的BC、DE及FG环。因此，基于SABA1的SABA可包含SEQ ID NO:328或329，其中(X)x包含SEQ ID NO:331，(X)y包含SEQ ID NO:332，且(X)z包含SEQ ID NO:333。在一些实施方案中，替代(X)x、(X)y及(X)z的序列在如上文所述环的任一或两端上包含额外残基。涵盖利用其他SABA核心序列的BC、DE及FG环的集合的相似构建体。此SABA的支架区域可相对于SEQ ID NO:1的支架氨基酸残基包含以下范围内的任意个取代、保守取代、缺失或添加：0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1个。只要SABA能够以期望的KD结合血清白蛋白(例如，HSA)即可进行这些支架修饰。
在某些实施方案中，可以修饰SABA(例如，如上文所述的SABA核心序列或以其为基础的序列)而使其包含N末端延伸序列及/或C末端延伸序列。例示性的延伸序列展示于表6中。举例而言，命名为SABA1.1的SEQ ID NO:420包含核心SABA 1序列(SEQ ID NO:330)，其具有N末端序列MGVSDVPRDLE(SEQ ID NO:371，命名为AdNT1)及C末端序列EIDKPSQ(SEQ IDNO:380，命名为AdCT1)。SABA1.1在C末端处进一步包含His6标签，然而，应了解，His6标签完全是可选的，可位于N-或C末端延伸序列内的任何位置，或者可以完全不存在于序列中。此外，可以使用表6中所提供的任何例示性N-或C末端延伸序列(SEQ ID NO:371-395)、及其任何变体都可用来修饰表6中所提供的任何给定的SABA核心序列。
在某些实施方案中，C末端延伸序列(亦称为”尾”)包含E及D残基，且长度可为介于8个与50个氨基酸之间、10个与30个氨基酸之间、10个与20个氨基酸之间、5个与10个氨基酸之间、及2个与4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾序列包括基于ED的接头，其中该序列包含ED的串联重复。在例示性实施方案中，尾序列包含2-10个、2-7个、2-5个、3-10个、3-7个、3-5个、3个、4个或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾序列亦可包括额外氨基酸残基，例如：EI、EID、ES、EC、EGS及EGC。这些序列部分地基于已知的阿德奈汀尾序列，例如EIDKPSQ(SEQ ID NO:380)，其中残基D及K已被去除。在例示性实施方案中，基于ED的尾在ED重复之前包含E、I或EI残基。
在其他实施方案中，在设计SABA融合分子时，尾序列可视需要与其他已知接头序列(例如，表6中的SEQ ID NO:396-419)组合。
缀合/接头
可将SABA融合物共价或非共价连接。在一些实施方案中，结合血清白蛋白的10Fn3可直接或经由多肽接头间接连接至抗PCSK9-阿德奈汀。接合Fn3结构域的适宜接头是允许各单独结构域彼此独立折叠，形成允许对靶分子的高亲和力结合的三维结构的接头。
本公开提供满足这些要求的多种适宜接头，包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头，以及具有氨基酸序列PSTSTST(SEQ ID NO:416)的接头。本文所述的实例展示：经由多肽接头接合的Fn3结构域保持其靶结合功能。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸及丝氨酸残基，且长度可为介于8个与50个氨基酸之间、1个与30个氨基酸之间、及10个与20个氨基酸之间。实例包括具有氨基酸序列(GS)7(SEQ ID NO:403)、G(GS)6(SEQ ID NO:398)及G(GS)7G(SEQ ID NO:400)的接头。其他接头含有谷氨酸，且包括例如(GSE)5(SEQ ID NO:405)及GGSE GGSE(SEQ ID NO:409)。其他例示性甘氨酸-丝氨酸接头包括(GS)4(SEQ ID NO:402)、(GGGGS)7(SEQ ID NO:411)、(GGGGS)5(SEQ ID NO:412)及(GGGGS)3G(SEQ ID NO:413)。在一些实施方案中，接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸及脯氨酸残基，且长度可为介于3个与30个氨基酸之间、10个与30个氨基酸之间及3个与20个氨基酸之间。实例包括具有氨基酸序列(GP)3G(SEQ ID NO:414)、(GP)5G(SEQ ID NO:415)及GPG的接头。在其他实施方案中，接头可为基于脯氨酸-丙氨酸的接头，其长度为介于3个与30个氨基酸之间、10个与30个氨基酸之间及3个与20个氨基酸之间。基于脯氨酸丙氨酸的接头的实例包括例如(PA)3(SEQ ID NO:417)、(PA)6(SEQ ID NO:418)及(PA)9(SEQ ID NO:419)。考虑最优的接头长度及氨基酸组成可根据本文所提供的教示内容通过常规实验来确定。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀经由具有蛋白酶位点的多肽接头连接于SABA，该蛋白酶位点可以被血液或靶组织中的蛋白酶切断。这样的实施方案可以用来释放抗PCSK9阿德奈汀以实现更好地递送或治疗性质或更高效的生产。
可在Fn3结构域的C末端处，在Fn3结构域与多肽接头之间引入额外的接头或间隔物。可在Fn3结构域的N末端处，在Fn3结构域与多肽接头之间引入额外的接头或间隔物。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀可直接或经由聚合物接头间接连接至SABA。可使用聚合物接头来最优地改变融合物的各组分间的距离，以产生具有以下特性中的一或多者的蛋白质融合物：1)降低或增加一或多个蛋白质结构域在与感兴趣的蛋白质结合时的结合空间位阻，2)增加蛋白质稳定性或溶解性，3)减少蛋白质聚集，及4)增加蛋白质的总体亲合力或亲和力。
在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀经由生物相容性聚合物(例如聚合糖)连接至SABA。聚合糖可包括可被血液或靶组织中的酶切断的酶切割位点。这样的实施方案可以用来释放抗PCSK9阿德奈汀以实现更好地递送或治疗性质或更高效的生产。
序列概述
上文”结合血清白蛋白的阿德奈汀(SABA)的融合物”及“缀合/接头”部分中所提及的许多序列概述于下表6中。除非另有说明，否则所有N末端延伸皆以单下划线指示，所有C末端尾/延伸皆以双下划线指示，而接头序列带有边框。各核心SABA序列的环区BC、DE及FG加有阴影。如上文所进一步阐述的，亦可使用修饰序列(例如，N或C末端延伸及接头)来修饰抗PCSK9阿德奈汀分子。
表6.
例示性序列的概述
Figure BDA0000786597750001781
Figure BDA0000786597750001791
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Figure BDA0000786597750001891
Figure BDA0000786597750001901
实施例
实施例1
本文所用的材料及方法
高通量蛋白质生产(HTPP)
将克隆至pET9d载体中并转化至大肠杆菌HMS174细胞中的选定的结合物以24孔模式接种于含有50μg/mL卡那霉素(kanamycin)的5ml LB培养基中并在37℃下生长过夜。通过吸取200μl过夜培养物并将其分配于合适的孔中来制备5ml新鲜LB培养基(50μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达。使培养物在37℃下生长直至A600为0.6至0.9。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃下表达6小时并通过在4℃下以2750g离心10分钟来收获。
通过使细胞沉淀(24孔模式)重悬于450μl裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，1x完全蛋白酶抑制剂混合剂(不含EDTA)(Roche)，1mM PMSF，10mM CHAPS，40mM咪唑，1mg/ml溶菌酶，30μg/ml DNA酶，2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中来使其裂解并在室温下振荡1至3小时。将裂解物澄清，并通过将其转移至装配有96孔1.2ml捕捉板(catch plate)的96孔WhatmanGF/D
Figure BDA0000786597750001902
中而重排为96孔模式，通过正压力过滤。将经澄清的裂解物转移至已用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，40mM咪唑，pH 8.0)平衡的96孔Ni-螯合板中并温育5min。通过真空去除未结合材料。用1号洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5mMCHAPS，40mM咪唑，pH 8.0)以2×0.3ml/孔洗涤树脂，通过真空去除每次的洗涤液。在洗脱前，每个孔用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)洗涤，温育5min并通过真空弃去该洗涤液。向各孔中施加额外的100μl洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。在室温下温育30分钟后，将各板以200g离心5分钟并将洗脱蛋白质收集于96孔捕捉板中，这些捕捉板含有在洗脱前添加于洗脱捕捉板底部的5μl 0.5M MgCl2。使用BCA分析利用SGE作为蛋白质标准来定量洗脱蛋白质。
不溶性的基于纤连蛋白的支架蛋白质结合物的中等规模表达及纯化
对于不溶克隆的表达，将后面有HIS6标签的克隆克隆至pET9d(EMD Bioscience,San Diego,CA)载体中并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml接种培养物(自单一铺板菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄西林(carbenicillin)及34μg/ml氯霉素(chloromphenicol)的LB培养基。使培养物在37℃下生长直至A600为0.6至1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养物后，使其在30℃下生长4小时且通过在4℃下以≥10,000g离心30分钟来收获。将细胞离心沉淀物在-80℃下冷冻。在冰上使用Ultra-turrax均质器(IKA works)将细胞沉淀重悬于25ml裂解缓冲液(20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，1x完全蛋白酶抑制剂混合剂(不含EDTA)(Roche)，1mM PMSF，pH7.4)中。通过使用M-110S
Figure BDA0000786597750001911
(Microfluidics)进行高压均质化(≥18,000psi)以完成细胞裂解。将不溶级分通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离。自裂解物离心所回收的不溶沉淀用20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH7.4)洗涤。通过超音波处理将该沉淀重溶于20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)中的6.0M盐酸胍中，随后在37度下温育1至2小时。将重溶的沉淀通过0.45μm过滤，并加载到用20mM磷酸钠/500mM NaCl/6.0M胍(pH 7.4)缓冲液平衡的Histrap柱上。在加载后，用额外25个CV的相同缓冲液洗涤柱。用20mM磷酸钠/500mM NaCl/6.0M胍-HCl(pH 7.4)中的50mM咪唑洗脱结合蛋白。通过针对50mM乙酸钠/150mM NaCl(pH 4.5)进行透析使经纯化蛋白质再折叠。
可溶性的基于纤连蛋白的支架蛋白质结合物的中等规模表达及纯化
对于可溶克隆的表达，将后面带有HIS6标签的克隆克隆至pET9d(EMDBioscience,San Diego,CA)载体中并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml接种培养物(自单一铺板菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄西林及34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃下生长直至A600为6至1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养物后，使其在30℃下生长4小时且通过在4℃下以≥10,000g离心30分钟来收获。细胞离心沉淀在-80℃下冷冻。在冰上使用Ultra-turrax均质器(IKA works)将细胞沉淀重悬于25ml裂解缓冲液(20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，1×完全蛋白酶抑制剂混合剂(不含EDTA)(Roche)，1mMPMSF，pH 7.4)中。通过使用M-110S
Figure BDA0000786597750001921
(Microfluidics)进行高压均质化(≥18,000psi)达成细胞裂解。通过在4℃下以23,300×g离心30分钟来分离可溶级分。通过0.45μm过滤器使上清液澄清。将经澄清的裂解物加载至用20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH7.4)预平衡的Histrap柱(GE)上。然后依次用25个柱体积的相同缓冲液、20个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/25mM咪唑(pH 7.4)及随后35个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/40mM咪唑(pH 7.4)洗涤管柱。用15个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/500mM咪唑(pH7.4)洗脱蛋白质，根据A280吸光度汇集各个级分并针对1×PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)进行透析。通过以0.22μm过滤去除任何沉淀。
实施例2
体外非临床药理学
通过SPR测定的KD
通过表面等离子体共振(SPR)来表征结合特性。将人PCSK9及食蟹猴PCSK9固定在ProteOn XPR(Bio-Rad)芯片表面的一个维度上的不同通道上且暴露于同一SPR芯片表面上的另一维度上的6种不同浓度的2013E01。这样可以在没有再生的条件下进行动力学测定。在25℃下使用两块相同芯片对人类及食蟹猴PCSK9进行动力学测定。使用ProteOn Manager软件以Langmuir相互作用模型及常数参数拟合来实施对动力学参数的评价。
在这些条件下，抗PCSK9阿德奈汀以80pM至1.6nM的范围内的解离常数(KD)结合人PCSK9，且以8nM至24nM的范围内的解离常数(KD)结合食蟹猴PCSK9(表7)。缔合速率为约105M-1s-1，所关联的解离通常为10-3-10-5s-1。就一些阿德奈汀而言，自人PCSK9的解离速率较缓慢(约为10-5s-1的范围)，接近于SPR技术的检测限，因此这些自人类PCSK9的解离常数的测量值可能是低估的。
表7
SPR测定的抗PCSK9阿德奈汀针对经直接固定的人类及食蟹猴PCSK9的动力学参数
克隆编号 PCSK9物种 k<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup> s<sup>-1</sup>) k<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(nM)
1459D05 人类 1.13E+05 1.80E-04 1.58±0.176
2013E01 人类 7.03±0.1E+05 2.42±0.3E-05 0.292±0.008
2013E01 食蟹猴 2.19E+05 1.77E-03 8.1
1922G04 人类 5.41E+05 5.08E-05 0.094±0.009
1922G04 食蟹猴 4.65E+05 7.00E-03 15.03
2011H05 人类 1.18E+05 9.76E-06 0.079±0.038
2011H05 食蟹猴 1.90E+05 4.40E-03 23.1
2012A04 人类 2.59E+05 6.47E-05 0.251±0.011
2012A04 食蟹猴 1.95E+05 4.75E-03 24.32
通过BLI测定的KD
亦通过生物层干涉测量法(Bio-Layer Interferometry,BLI)来测定阿德奈汀与人类PCSK9的结合特性。将生物素化的人PCSK9固定至超级链亲和素(superstreptavidin)传感器尖端上，随后将其浸入含有经稀释的阿德奈汀的孔中并维持缔合期的持续时间。然后将尖端浸入仅含有缓冲液的孔中以观察阿德奈汀解离。在温度受控环境中在25或37℃下实施实验，且振荡速度设定为1500rpm。
使用Fortebio的专有软件(Fortebio数据分析软件6.3.0.36版)实施结合相互作用分析。使用1:1结合模型对所有试样实施整体拟合(global fit)。这些整体拟合的性质将所有浓度值约束到单独的一对缔合速率及解离速率，而这两个速率本身相互约束。对分析中所用的各种上样量将亲和力(KD)、缔合速率及解离速率平均化。在这些条件下，阿德奈汀以200pM至7.5nM范围内的亲和力结合人类PCSK9，如下表8中所示的。缔合速率在104-105M- 1s-1的范围内，且所关联的解离典型地为10-3-10-5s-1。
表8
BLI-测定的PCSK9阿德奈汀针对人类PCSK9的动力学参数
Figure BDA0000786597750001941
Figure BDA0000786597750001951
1ATI01168是1922G04具有R23E取代的去免疫化(deimmunized)形式。
2ATI001175是1922G04具有R23D取代的去免疫化形式。
溶液相亲和力
KinExA
使用动力学排除分析(KinExA)来测量ATI001081及ATI001174对人类PCSK9的溶液亲和力。通过在hPCSK9固体基质上进行捕获，随后用识别阿德奈汀支架的荧光标记抗体进行检测，来测量未结合阿德奈汀的相对浓度。因技术限制，可测试的阿德奈汀最低浓度为1nM。整体KD分析估计ATI001081的KD＝70pM(在95％置信区间内，28-127pM)且ATI001174的KD＝223pM(在95％置信区间内，54-585pM的范围)。
表9
PCSK9阿德奈汀的溶液相亲和力测量值
ATI001081 ATI001174
K<sub>D</sub> 69.5pM 223pM
95％置信区间：
Kd高 127pM 585pM
Kd低 28pM 54pM
ITC
通过等温滴定量热法(ITC)来表征阿德奈汀ATI001174及ATI001081与人类PCSK9结合的热动力学及化学计量。在25mM HEPES、pH 7.41、150mM NaCl中在37℃下测量溶液相结合。观察到ATI001174的平均单分子结合常数为1.3±0.2nM，ATI001081为1.4±0.4nM。详细的热动力学分析展示于表10及图13中。所观察到两种阿德奈汀的焓的差(-3.3千卡/mol)表明，ATI001174对PCSK9的亲和力因聚乙二醇化而降低一个数量级，此降低至少部分被对应的熵差(-10.4卡/mol·K)所抵消。
表10.
Figure BDA0000786597750001961
*3次实验的平均值
荧光共振能量转移(FRET)分析
建立了3种基于FRET的测定法以测定结合PCSK9的阿德奈汀的结合亲和力及效能，这些测定是自先前由Maio等人(参见Miao,B.等人，Meth.Enzymol.,357:180-188(2002))所述的一般方法调整而来的。PCSK9:EGFA FRET测定法(图2及3)使用在杆状病毒中表达的重组人类PCSK9及合成的40聚体EGFA肽(生物素化)来测量对PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)表皮生长因子前体同源性结构域(EGFA结构域)的结合的抑制。已显示EGFA代表LDLR与PCSK9相互作用的关键结构域(Kwon,H.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105(6):1820-1825(2008))。此测定使用一种经Eu螯合物标记的结合PCSK9C末端结构域的单抗(mAb4H5)，以藉由链亲和素/别藻蓝蛋白(allophycocyanin)荧光团复合物提供与生物素化EGFA的FRET相互作用。
还构建了另外两个相关的PCSK9依赖性FRET测定。在这些测定中的一者中，定量阿德奈汀对生物素化阿德奈汀(ATI000972或ATI001125)的竞争性置换(图4中展示ATI000972结果)。ATI000972是1459D05的生物素化形式，且ATI001125是ATI001081的生物素化形式。在另一测定中，使用抗his6抗体来测定阿德奈汀(带his标签)与PCSK9的直接结合(图5)。在每一FRET测定中，人PCSK9浓度均为1或5nM。在一些情况下，用食蟹猴PCSK9替代hPCSK9。表11总结了该三个FRET测定的全部数据。
表11
3个使用人PCSK9的FRET测定及对食蟹猴PCSK9的1个测定的阿德奈汀测试数据的概述
Figure BDA0000786597750001971
Figure BDA0000786597750001981
PCSK9阿德奈汀对PCSK9活性的基于细胞的抑制
DiI-LDL摄取分析
开发了细胞培养方法以分析阿德奈汀抑制PCSK9对LDLR的活性的能力。一种测量细胞LDLR活性的有效手段是通过针对经标记LDL的摄取的测定，如由Lagace,T.A.等人(J.Clin.Invest.,116(11):2995-3005(2006))所示的。本项工作进一步适用了一种用于LDLR功能活性的方法，该方法利用经荧光标记的LDL(DiI-LDL)的摄取，是由Teupser等人(Biochim.Biophys.Acta,1303(3):193-198(1996))最初展示的方法调整而来。首先在所示阿德奈汀存在及不存在下将细胞与重组人类PCSK9蛋白质(10μg/mL，135nM)预温育。在2小时后，通过与DiI-LDL(5μg)温育2小时，随后使用高含量荧光显微及影像分析(Cellomics)评估细胞内的累积DiI-LDL来分析残留LDLR活性。图6展示数种阿德奈汀在HepG2细胞中抑制PCSK9活性并恢复LDLR功能活性的效应。在此测定中，阿德奈汀以下列EC50值抑制PCSK9并恢复DiI-LDL摄取：1459D05，EC50＝190nM；1784F03，210nM；2012A04，130nM；2013E01，160nM。
LDLR消耗测定
使HepG2细胞生长于完全培养基(具有10％FBS(Hyclone)的伊格尔氏最低必需培养基(EMEM,ATCC))中且每周两次用胰蛋白酶0.25％(Invitrogen)分盘。为诱导LDL受体的上调，将细胞在LPDS培养基[具有5％无脂蛋白血清(Intracel)、100nM Superstatin(BMS)及50μM甲羟戊酸钠(Sigma)的RPMI(ATCC)]中温育过夜。次日，用胰蛋白酶0.05％(Invitrogen)将细胞短暂地胰蛋白酶消化且以2×10^6个细胞/ml使其重悬，然后以100μl/孔等分于V形底96孔板中。同时，在37℃下将阿德奈汀与PCSK9在LPDS培养基中预温育1小时。1小时后，将细胞离心并重悬于100μl阿德奈汀/PCSK9混合物中且在37℃下温育过夜。次日，用针对LDL受体的抗体(来自R&D的BAF 2148)、然后用藻红蛋白(PE)-链亲和素缀合第二抗体(来自BD Pharmingen的BD554061)标记细胞，且通过在FACS CantoII(BD)上实施FACS加以分析。
将10nM PCSK9与递增浓度的阿德奈汀候选物预温育1小时，随后添加至HepG2细胞中。在温育过夜后，通过FACS测量LDLR水平，将PCSK9诱导的LDLR消耗的抑制百分比绘制曲线图，并使用PRISM测定EC50。在被测试的候选者中，1459D05似乎是效能最低者，且未达到最大抑制，而其他克隆均达到了对PCSK9的150-200％最大抑制(图7)。PCSK9阿德奈汀体外药理学数据的总结展示于下表12中。
Figure BDA0000786597750002001
Figure BDA0000786597750002011
Figure BDA0000786597750002021
实施例3
PCSK9阿德奈汀的体内药效学效应
人类PCSK9转基因小鼠模型
PCSK9阿德奈汀在两种不同人类转基因小鼠模型中表现了体内药效学效应。一种小鼠模型显著地过表达人PCSK9水平，因此表现高胆固醇血症(Lagace,T.A.等人，J.Clin.Invest.,116(11):2995-3005(2006))。另一小鼠模型是基因组hPCSK9转基因的(BAC转基因)，该基因在肝中以与小鼠PCSK9相似的方式被调节，且在血浆中表达接近人体正常水平的hPCSK9。为了这些研究，开发了利用物种特异性、位点特异性标记的抗体及阿德奈汀的ELISA测定法，测量血浆未结合人类PCSK9(即未与所施用的阿德奈汀复合的hPCSK9)的水平，作为靶物接合(target engagement)的指标。
以图8-9中所展示的剂量将单剂量的呈聚乙二醇化形式的PCSK9阿德奈汀经腹膜内注射至过表达者hPCSK9转基因小鼠模型中。还注射PBS或透析物试样作为对照。阿德奈汀1459D05-PEG(100mg/kg，经腹膜内)处理在4hr内将血浆总胆固醇(图8A)及LDL-C(未显示)快速降至低于基线>35％。在整个48hr测试期间内，经阿德奈汀处理的小鼠中的胆固醇水平保持低于对照水平。与此相伴随的是，在经阿德奈汀处理转基因小鼠中未结合的hPCSK9的循环水平急剧降低(图8B)。在平行研究中对第6小时取出的肝实施的Western印迹显示，经阿德奈汀处理的小鼠中的LDLR蛋白质水平增加约2倍(未图示)。在此转基因小鼠模型中的进一步的研究中，以10或60mg/kg施用ATI001114。观察到血浆胆固醇的剂量依赖性显著快速降低，伴随着未结合hPCSK9水平的剂量相关的降低(图9)。这些研究构成了PCSK9阿德奈汀在高胆固醇血人转基因PCSK9小鼠模型中作为有效胆固醇降低剂的体内概念验证。
在正常表达者hPCSK9转基因小鼠模型中实施体内研究。注射单剂量1459D05-PEG或ATI001114(5mg/kg)导致血浆中的未结合hPCSK9浓度快速且显著地降低(图10)。相比于1459D05-PEG，ATI001114对未结合hPCSK9的此药效学效应更显著；对这种更高亲和力/效能的阿德奈汀观察到的效应量值更大且持续时间更长。对剂量依赖性的进一步研究显示，在给予后3至48小时的时间点下，ATI001114的50％抑制剂量(ED50)小于0.1mg/kg，如在图11中所见。在正常表达者转基因小鼠模型中的这些发现显示，PCSK9抑制性阿德奈汀对与LDLR调节及LDL胆固醇降低相关的药效学效应终点表现出显著的亲和力依赖性且剂量依赖性的效应。
食蟹猴
在正常瘦食蟹猴中实施药效学研究。以5mg/kg将阿德奈汀ATI001114经静脉内施用食蟹猴，且按时间间隔收集血浆试样，以供LDL-C测定及药动学评估。在48小时内，单剂量ATI001114使血浆LDL-C浓度快速相对于基线(或相对于PBS对照组)降低>50％(图12)。对LDL-C的效应的持续时间持续一周以上，且在第3周前最终返回基线。抗PCSK9阿德奈汀的2支链及4支链40kDa聚乙二醇化形式二者(分别为ATI001114及ATI001211)都观察到了此效应。ATI001211是具有40kDa 4支链NOF PEG部分的ATI001081。总胆固醇显示了相似的模式，但对HDL或其他代谢参数未观察到效应(未图示)。药动学分析显示在食蟹猴中的血浆半衰期为约80-120hr，与LDL降低的药效学是一致的。这些发现表明，在食蟹猴模型中，PCSK9阿德奈汀是有效的，作用快速，且对LDL-C降低的效应快速、鲁棒、特异。
实施例4
PCSK9阿德奈汀-Fc融合蛋白质PRD460的体外及体内药理学评价
PRD460的生产
利用聚乙烯亚胺(PEI)将编码PRD460的载体转染到HEK-2936E细胞中。让细胞在37℃80％湿度和5％CO2条件下生长5天。然后离心沉淀细胞，使上清液通过0.22μm滤器，然后加载到蛋白A柱上。用PBS洗柱，用20mM甘氨酸、150mM NaCl pH 2.8洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白浓缩，并在50mM MES、100mM NaCl，pH 5.8的条件下通过superdex200柱。
通过SPR测定PRD460的KD
通过表面等离子体共振(SPR)来表征结合特性。将抗人抗体固定在
Figure BDA0000786597750002041
芯片上，且将PRD460(序列如SEQ ID NO:322中所述)捕获于芯片表面上。将不同浓度的hPCSK9置于流动溶液中，使用MgCl2(3M)在各循环之间再生芯片。为进行比较，将ATI-1081捕获于固定在
Figure BDA0000786597750002042
芯片上的抗His抗体上。在不同天数对PRD460实施重复实验。在25℃下实施动力学测定。在
Figure BDA0000786597750002051
评价软件上使用1:1结合算法实施动力学参数的评价。
在这些条件下，ATI-1081在25℃下以6.7nM的解离常数(KD)结合至人PCSK9，而PRD460在25℃下以3.29+/-0.55nM的解离常数(KD)结合至人PCSK9(表13)。使用此测定模式的解离速率测定可能会人为受限于被捕获的配体从固定化捕获抗体解离的速率，因此使用直接固定PCSK9的测定模式可能更准确地反映ATI-1081的解离常数(KD)。
表13
PRD460及ATI-1081针对被捕获的人PCSK9的动力学参数
ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
PRD460 3.75+/-0.7E+04 1.21+/-0.05E-04 3.29+/-0.55
ATI-1081 3.65E+04 2.45E-04 6.7
PCSK9结合FRET测定
使用两种基于荧光共振能量转移(FRET)的测定法来确定PRD460及其他阿德奈汀与hPCSK9的竞争性结合效能。PCSK9:EGFA FRET测定法利用可溶性表皮生长因子前体同源结构域-A(EGFA)肽及重组人PCSK9来测量PCSK9与LDLR的结合。PCSK9:ATI972FRET测定法测量阿德奈汀从PCSK9竞争性置换生物素化阿德奈汀ATI-972。
在PCSK9:EGFA FRET测定法(在5nM PCSK9下)中，PRD460从PCSK9结合位点完全地、并且强效地置换出了EGFA，EC50＝0.7nM(图1，左小图)。在此测定法中，PRD460比ATI-1174(EC50＝1.9nM)或ATI-1081(EC50＝3.7nM)效能更强(图14)。PRD460在此测定法中的较大的表观效能可能由阿德奈汀PRD460与PCSK9的双价结合(2:1)(理论上)来解释：与之相比，ATI-1081及ATI-1174与PCSK9是单价(1:1)结合。
使用PCSK9:ATI-972FRET测定法(在5nM人类PCSK9下)时，PRD460以EC50＝0.3nM抑制，相比之下，ATI-1114以0.8nM、ATI-1081以2.8nm抑制(图15)。这些发现表明，PRD460将生物素化阿德奈汀ATI-972从其在PCSK9上的结合位点上强效地置换出来。PRD460相对于ATI-1081及ATI-1174的更高效能与PRD460的双价结合是一致的。
在HepG2细胞中对由PCSK9诱导的LDLR消耗的抑制
人PCSK9促进HepG2细胞表面的LDLR的消耗。将PCSK9与PCSK9阿德奈汀预温育可抑制PCSK9与LDLR结合，并阻止细胞表面的LDLR的消耗。利用此测定法来测量ATI-1081、ATI-1174及PRD460抑制由PCSK9诱导的细胞表面的LDLR的消耗的效能。
在37度下将一系列稀释的PCSK9阿德奈汀与10nM人PCSK9预温育1小时，将预温育混合物添加至HepG2细胞中，且将细胞温育24小时。在此温育后，使用FACS分析来测量HepG2细胞上LDLR的水平。计算对由PCSK9诱导的LDLR消耗的百分比抑制并绘制曲线图(图15)。在此测定法中，ATI-1081、ATI-1174及PRD460以相似的EC50(分别为9nM、8nM及6nM)抑制PCSK9，但始终观察到PRD460的相应曲线的向左偏移。这些EC50表示此测定法的极限(limit)。
HepG2细胞中的PCSK9细胞进入测定法
PCSK9与肝细胞表面上的LDLR结合导致LDLR-PCSK9复合物在LDLR内吞期间共内在化，从而增强LDLR降解。建立了一种基于细胞的测定法来测量荧光PCSK9的LDLR依赖性细胞进入。使用荧光团Alexa Fluor-647(AF647)来共价标记人类PCSK9。在有或无PCSK9-阿德奈汀的条件下温育PCSK9-AF647与HepG2细胞，并通过高含量荧光显微及影像分析(Cellomics)来定量细胞内荧光。在初步实验中确证了PCSK9-AF647细胞进入对LDLR内吞的依赖性。在37度下将HepG2细胞与10nM PCSK9-AF647及不同浓度的阿德奈汀温育4小时。在此测定法中，观察到PRD460(EC50＝6nM)以及ATI-1174(EC50＝10nM)对PCSK9-AF647细胞内荧光的强效抑制(图16)。这些发现表明，在培养中的源自人类肝的细胞系中，阿德奈汀PRD460及ATI-1174有效阻断了PCSK9与细胞表面LDLR的结合，藉此降低PCSK9-AF647在LDLR内吞期间内在化。
体内转基因小鼠研究
在正常表达者hPCSK9转基因小鼠模型中实施体内研究。预计阿德奈汀与血浆中的PCSK9的结合可导致未结合(游离)循环PCSK9的测量量降低。未结合PCSK9的降低是导致PCSK9-LDLR相互作用的抑制及LDL胆固醇的降低的初始药效学事件。向转基因小鼠施用单剂量PRD460(腹膜内剂量，0.6mg/kg至18mg/kg)使血浆未结合hPCSK9水平快速且显著地降低(图17)。在3小时时间点观察到未结合PCSK9的剂量依赖性降低，且ED50<0.6mg/kg。正常表达者人类PCSK9转基因小鼠模型中的这些发现显示，PRD460在体内与循环hPCSK9强力且有效地结合。
食蟹猴中的体内药效学
在正常瘦食蟹猴中评价PCSK9阿德奈汀PRD460的药效学效应。通过以15mg/kg经静脉内给药将PRD460施用给猴，且经4周按照一定的时间间隔收集血浆试样，以用于测定LDL-C及游离PCSK9水平。单个剂量的PRD460快速降低了猴的血浆LDL-C水平，在给予后第3天之前达到基线LDL-C的2％的平均最大效应(58％降低；n＝3只猴)(图18)。在此剂量下LDL-C水平被降低50％或更多达一周，保持显著低于基线达3周，到4周返回基线。总胆固醇显示相似的模式，但观察到对HDL无效应(未图示)。用PRD460处理导致未结合的游离形式的血浆PCSK9立即下降至接近零(低于定量下限)(图18)。游离PCSK9水平保持接近检测下限达数天，随后到4周末逐渐返回基线水平，这与同血浆LDL-C的因/果关系是一致的。数据表明，血浆LDL的降低反映游离PCSK9水平的下降，这与在用PRD460体内处理后PCSK9抑制调节LDLR功能是一致的。药动学分析显示，在此食蟹猴研究中，阿德奈汀PRD460的血浆半衰期为约70小时。这些发现表明，在食蟹猴模型中，PCSK9阿德奈汀-Fc融合蛋白质的作用高效且快速，且对LDL-C降低的效应鲁棒、特异且长效。
未经修饰PCSK9阿德奈汀ATI-1081的体内药理学评价
除含有PK部分的经修饰阿德奈汀(例如，聚乙二醇化及Fc-融合阿德奈汀)外，亦可施用未经修饰(“裸露”)的PCSK9阿德奈汀。未经修饰的PCSK9阿德奈汀处理的策略包括更频繁地给药以适应较短的PK半衰期、或使用延长释放皮下制剂来增加吸收期的长度并延长药效学效应。可想到许多这些制剂，包括(作为简单实例)丙二醇/PBS溶液，其用以延迟吸收速率并增加对循环中的阿德奈汀的暴露时间。
以10mg/kg将存在于PBS媒介中的未经修饰的阿德奈汀ATI-1081经静脉内施用食蟹猴。还以1mg/kg施用存在于PBS中的ATI-1114(相同阿德奈汀的聚乙二醇化形式)作为比较。ATI-1081引发了未结合的循环PCSK9水平的快速短暂抑制。在30分钟内，初始抑制程度接近100％(低于定量限)，随后在数小时后返回基线(图19)。同时，在用ATI-1081处理的猴中观察到，在前24小时内LDL-C水平有降低的趋势(图20)。
还将存在于简单延长释放皮下制剂中的未经修饰的阿德奈汀ATI-1081施用给正常表达者hPCSK9转基因小鼠，该制剂使用50:50的丙二醇:PBS(PG媒介)，与PBS媒介进行比较。此制剂预期可适度延迟阿德奈汀吸收速率并延长对循环中的ATI-1081的暴露时间，从而改善药效学应答。以1mg/kg施用(经腹膜内)存在于PBS媒介中的ATI-1081使得未结合的血浆PCSK9在3小时时降低约50％，相比之下，以0.3mg/kg施用ATI-1114使未结合血浆PCSK9降低>85％(图21)。在该转基因小鼠的第二项实验中，通过经皮下注射施用存在于PG媒介中的ATI-1081几乎与ATI-1174相等地减少了未结合LDL，且效应持续时间改善，覆盖该研究的最初6个小时(图22)。这些发现表明，当在简单延长释放媒介中经皮下施用时，未经修饰的PCSK9阿德奈汀ATI-1081结合至体内的目标人PCSK9并引发初始药效学应答。应答的时间依赖性与延长释放增加PCSK9阿德奈汀的效应持续时间是一致的。
实施例5
结合血清白蛋白的阿德奈汀(SABA)
实施例5A.候选的结合血清白蛋白的AdnectinTM的筛选及选择
概述
对DNA文库应用称为PROfusion的选择技术(例如，参见Roberts及Szostak,ProcNatl Acad Sci U S A.94(23):12297-302,1997及WO2008/066752)，所述DNA文库中将可变区域设计到10Fn3的BC、DE及FG环中。自此设计创建了一个具有大于1013个分子的随机文库，并对HSA的生物素化形式施加选择压力，以分离具有期望的结合性质的候选的结合血清白蛋白的阿德奈汀(SABA)。
高通量蛋白质生产(HTTP)方法
使用高通量蛋白质生产方法(HTPP)纯化各种结合HSA的阿德奈汀。将选定的结合物克隆至含有HIS6标签的pET9d载体中并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中。将经转化的细胞以24孔模式接种于含有50μg/mL卡那霉素的5ml LB培养基中并在37℃下生长过夜。通过吸取200μl过夜培养物并将其分配于合适孔中来制备5ml新鲜LB培养基(50μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达。使培养物在37℃下生长直至A600为0.6至0.9。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃下再生长4小时并通过在4℃下以3220×g离心10分钟来收获。细胞离心沉淀在80℃下冷冻。
通过使细胞离心沉淀(呈24孔模式)重悬于450μl裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5MNaCl，1×完全白酶抑制剂混合剂(不含EDTA)(Roche)，1mM PMSF，10mM CHAPS，40mM咪唑，1mg/ml溶菌酶，30μg/ml DNA酶，2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中来使其裂解并在室温下振荡1小时。将裂解物澄清，并通过将其转移至装配有96孔1.2ml捕捉板(catch plate)的96孔Whatman GF/D
Figure BDA0000786597750002091
中而重排为96孔模式，200x g离心5分钟。将澄清的裂解物转移至已用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，10mM CHAPS，40mM咪唑，pH 8.0)平衡的96孔Ni-螯合板中并温育5min。去除未结合材料。用1号洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5mM CHAPS，40mM咪唑，pH 8.0)以2×0.3ml/孔洗涤树脂。接下来，用PBS以3×0.3ml/孔洗涤树脂。在洗脱前，用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)洗涤各孔，将其温育5min并通过真空弃去此次洗涤液。通过向各孔中施加额外的100μl洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。在室温下温育30分钟后，以200x g将各板离心5分钟并将洗脱蛋白质收集于贴在Ni-板底部的、含有5μl0.5M MgCl2的96孔捕捉板中。使用BCA蛋白质测定法利用SGE(对照阿德奈汀)作为蛋白质标准来定量洗脱的蛋白质。SGE阿德奈汀是一种野生型10Fn3结构域(SEQ ID NO:1)，其中已用SGE替代整联蛋白结合结构域(第78至80位的氨基酸RGD)。
HSA、RhSA及MuSA直接结合ELISA
为了测定HSA的直接结合物，在4℃下用存在于PBS中的10μg/mL HSA(Sigma,St.Louis,MO)包被MaxiSorpTM板(Nunc International,Rochester,NY)过夜，随后在室温下在酪蛋白封闭缓冲液(Thermo Scientific,Rockford,IL)中封闭1至3小时。为了进行单点筛选测定，将经纯化的HTPP阿德奈汀以1:20稀释于酪蛋白封闭缓冲液中，并让其在室温下结合至各孔中的HSA 1小时。为了进行剂量应答测定，使用0.1nM至最多1μM的范围的浓度。在PBST中洗涤以去除未结合阿德奈汀后，在室温下将以1:2500稀释于酪蛋白封闭缓冲液中的抗His单抗-HRP偶联物(R&D Systems,MN)添加至经结合带His-标签的阿德奈汀中并保持1小时。通过用PBST洗涤来去除过量的缀合物并根据厂商说明书使用TMB检测试剂(BDBiosciences)检测结合的阿德奈汀。
通过分析型大小排阻层析实施聚集测量
对自HTPP获得的SABA实施大小排阻层析(SEC)。在Agilent 1100或1200HPLC***上使用Superdex 2005/150或Superdex 755/150柱(GE Healthcare)对自HTPP获得的材料实施SEC，在A214nm及A280nm下进行UV检测，并且进行荧光检测(激发＝280nm，发射＝350nm)。采用100mM硫酸钠、100mM磷酸钠、150mM氯化钠的缓冲液(pH 6.8)，其流速为SEC柱的合适流速。使用凝胶过滤标准品(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行分子量校正。
对HTPP纯化SABA进行SEC的结果显示主要为单体，且相对于球状凝胶过滤标准品(BioRad)在约10kDa范围内洗脱。
候选的结合血清白蛋白的阿德奈汀(SABA)的鉴定
作为针对HSA/RhSA/MuSA结合及生物物理学标准进行筛选的结果，鉴定并选择了4种独特的结合血清白蛋白的阿德奈汀(SABA)以在小鼠中评价其半衰期。为了进行体外及体内表征，对4种SABA实施了中等规模生产。表6提供26个自PROfusion鉴定的独特SABA核心序列的序列(命名为SABA1-26)。SABA4具有一个支架突变，其是在中等规模生产之前确定的(fixed)。SABA4的支架完好形式为SABA5。SABA4和SABA5的BC、DE及FG环具有相同的序列。
实施例5B.
候选SABA的生产及配制
SABA的中等规模蛋白质生产
将实施例5A中所述的选定SABA及随后His6标签克隆至pET 9d载体中，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞中表达(关于每种带His-标签的SABA序列(命名为SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1及SABA5.1)，参见表6)。使用20ml的接种培养物(自单一铺板菌落产生)接种1升含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基。使培养物在37℃下生长直至A600为0.6至1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃下再生长4小时并通过在4℃下以≥10,000x g离心30分钟来收获。细胞离心沉淀在80℃下冷冻。在冰上使用Ultra-turrax均质器(IKA works)将细胞沉淀重悬于25mL裂解缓冲液(20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，1×完全蛋白酶抑制剂混合剂(不含EDTA)(Roche)，pH7.4)中。通过使用M-110S
Figure BDA0000786597750002111
(Microfluidics)进行高压均质化(≥18,000psi)。通过在4℃下以23,300×g离心30分钟来分离可溶级分。经由0.45μm过滤器使上清液澄清。将澄清后的裂解物加载至用20mM NaH2PO4、0.5M NaCl(pH 7.4)预平衡的
Figure BDA0000786597750002112
柱(GE)上。然后用25柱体积的20mM NaH2PO4、0.5M NaCl(pH 7.4)、然后20柱体积的20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、25mM咪唑(pH 7.4)，及随后35柱体积的20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mM咪唑(pH 7.4)洗涤柱。用15柱体积的20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、500mM咪唑(pH 7.4)洗脱蛋白质，根据A280下的吸光度汇集各个级分，并针对1x PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH4.5)进行透析。通过以0.22μm过滤去除任何沉淀。
中等规模表达及纯化获得了高纯度的活性阿德奈汀，它们以可溶形式表达，并且从细菌细胞质液的可溶级分纯化。用Superdex
Figure BDA0000786597750002113
或
Figure BDA0000786597750002114
7510/30GL(GEHealthcare)以流动相(100mM NaPO4、100mM NaSO4、150mM NaCl，pH 6.8)进行SEC分析显示，主要为单体阿德奈汀。
SABA1.2的配制
选择一种特定SABA，即SABA1.2(SEQ ID NO:411))，进行初步制剂筛选。SABA1.2在10Fn3的”核心1”序列上包含(ED)5延伸(参见表6中的SEQ ID NO:421)。对于SABA1.2，确定了一种稳定制剂：10mM琥珀酸、8％山梨糖醇、5％甘氨酸(pH 6.0)，且产物浓度为5mg/mL。在此制剂中，通过差示扫描量热法(DSC)使用1.25mg/mL的蛋白质浓度所测得的蛋白质熔解温度为75℃。该制剂在4℃及25℃下提供令人满意的物理及化学稳定性，最初的聚集体水平为1.2％。在稳定一个月后，聚集水平极低(在4℃下为1.6％，在25℃下为3.8％)。在5次自-80℃及-20℃转变为环境温度的冷冻-解冻循环后，此制剂中的蛋白质亦稳定。另外，在此制剂中，在4℃及环境温度下，SABA1.2可在至少20mg/mL蛋白质水平下溶解，而无沉淀或聚集增加。
实施例5C.候选SABA的生物物理学表征
大小排阻层析
对通过中等规模过程获得的候选SABA实施标准大小排阻层析(SEC)。在Agilent1100或1200HPLC***上使用
Figure BDA0000786597750002122
20010/30或
Figure BDA0000786597750002123
7510/30柱(GEHealthcare)对中等规模生产的材料实施SEC，其中在A214nm及A280nm下进行UV检测，且进行荧光检测(激发＝280nm，发射＝350nm)。采用100mM硫酸钠、100mM磷酸钠、150mM氯化钠的缓冲液(pH 6.8)，其流速为SEC柱的合适流速下。使用凝胶过滤标准品(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)进行分子量校正。
对中等规模纯化的SABA进行SEC的结果显示主要是单体Adnectin，且洗脱物相对于所示球状凝胶过滤标准品(BioRad)在约10kDa范围内。
热稳定性
对中等规模生产的SABA实施差示扫描量热法(DSC)分析以确定其相应的Tm。在N-DSC II热量计(Calorimetry Sciences公司)中通过在3个大气压力下使温度以1度/分钟的速率自5℃斜升至95℃来扫描1mg/ml溶液。相对于以合适缓冲液运行的对照，利用Orgin软件(OrginLab公司)使用最优拟合分析数据。SEC及DSC分析结果概述于表14中。
表14.
对候选SABA进行SEC及DSC分析的概述
Figure BDA0000786597750002121
实施例5D.结合至血清白蛋白的候选SABA1的表征
对于自实施例5A及5B中所述的HTPP及/或中等规模扩增材料纯化的选定SABA克隆，通过下述方式确定其动力学：在Biasensor CM5芯片表面上捕获相应的血清白蛋白(HSA/RhSA/MuSA)，并使一系列浓度的SABA流过参照流动池与被捕获的白蛋白。另外，在pH5.5至pH 7.4的范围内的各种pH条件下进行与白蛋白的结合。结合HSA的阿德奈汀SABA2.1、SABA3.1、SABA4.1及SABA1.1与RhSA交叉反应，但不与MuSA交叉反应。SABA2及SABA4结合对pH敏感，而克隆SABA3显示与HSA的结合具有低至pH 6.0的pH抗性。SABA1.1在低至pH 5.5时符合pH抗性及亲和力/动力学的生物化学标准。
通过
Figure BDA0000786597750002132
来进行结构域定位。通过下述方式确定从HTPP及/或中等规模扩增材料纯化的选定SABA克隆：在Biasensor CM5芯片表面上捕获HSA或仅由HSA-结构域I和II、或HSA-结构域III组成的构建体，并使一系列浓度的SABA流过参照流动池与被捕获的白蛋白。克隆SABA2及SABA1结合至HSA及HSA-结构域I-II构建体，而非HSA-结构域III构建体。克隆SABA3及SABA4结合至HSA，而非HSA-结构域I-II或HSA-结构域III构建体。结果概述于表15中。
表15.
候选SABA(SABA1.1、2.1、3.1及4.1)的结合亲和力及动力学
Figure BDA0000786597750002131
实施例5E.候选SABA的体内t1/2的检查
测定HSA在小鼠中的半衰期以便于在小鼠中评价结合HSA的阿德奈汀，这是因为结合HSA的阿德奈汀不与MuSA交叉反应。以20mg/kg(图23A)及50mg/kg剂量(图23B)将HSA注射至约6周龄Ncr雌性裸小鼠的尾静脉中，并通过ELISA测定注射后以一定时间间隔采取的血样中HSA的浓度。测得以20mg/kg及50mg/kg注射至小鼠中的HSA的t1/2分别为约24小时及约20小时。
SABA1-4在小鼠中的半衰期测定
制备结合HSA的克隆SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1及SABA4.1的1升大肠杆菌生长物，将其纯化并去除内毒素。将各SABA变体注射至小鼠的尾静脉中，并通过ELISA测定在注射后以一定时间间隔采取的血样中的浓度。
比较在约6周龄的Ncr雌性裸小鼠中存在或不存在HSA时各SABA的药动学特征。对于共注射HSA的小鼠，将HAS与各种SABA预混合(HSA以3至4倍摩尔过量)，因为结合性克隆对HSA及RhSA具有选择性，且不结合小鼠血清白蛋白。SABA1.1(克隆1318H04)在小鼠血浆中的半衰期为0.56小时，而与HSA共注射的SABA1.1的半衰期为5.6小时，半衰期增加约10倍(图24A)。SABA2.1在小鼠血浆中的半衰期为0.24小时，而与HSA共注射的SABA2.1的半衰期为2.8小时，半衰期增加约12倍(图24B)。SABA3.1(克隆1245H07)在小鼠血浆中的半衰期为0.28小时，而与HSA共注射的SABA3.1的半衰期为0.53小时，半衰期增加约2倍(图24C)。SABA4.1在小鼠血浆中的半衰期为0.66小时，而与HSA共注射的SABA4的半衰期为4.6小时，半衰期增加约7倍(图24D)。本实施例的总结展示于图25中。表16总结了SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1及SABA5.1的相似数据；在可能的情况下与其在食蟹猴中的半衰期进行了比较。
表16.
Figure BDA0000786597750002141
Figure BDA0000786597750002151
SABA1.1及SABA5.1在食蟹猴中的半衰期测定
在食蟹猴中进行SABA1.1(图26A)及SABA5.1(图26B)的3周单剂量概念验证性研究，以评估在2只食蟹猴中经静脉内给予1mg/kg(mpk)剂量的药动学。使用一种开发用来检测血浆试样中的阿德奈汀的基于定量ELISA的测定法来评价药动学。SABA1.1的半衰期在96至137小时的范围内(图26A及表17A)。SABA5.1的半衰期为约12小时，且在ELISA中仅在最长120小时内可测量到(图26B)。表17A总结SABA1.1的数据；表17B总结SABA5.1的数据。
表17A：SABA1.1
Figure BDA0000786597750002152
表17B：SABA5.1
Figure BDA0000786597750002153
实施例5F.结合血清白蛋白的SABA1的表征
SABA1.1及1.2结合HSA及RhSA
SABA1.2，一种包含(ED)5延伸的”核心1”10Fn3(表6中的SEQ ID NO:421)，在中性pH及25℃下结合至人类血清白蛋白(HSA)，其平均缔合速率常数(ka)为8.21E+03M-1s-1，且平均解离速率常数(kd)为4.43E-04s-1，所计算的平均Kd为55.3nM(表18)。对于恒河猴血清白蛋白(RhSA)而言，所测得的平均缔合速率常数为6.6E+03M-1s-1，且解离速率常数为3.78E-03s-1，算得的平均Kd为580nM。在高达1μM下，在SABA1.2与小鼠或大鼠血清白蛋白之间未观测到可测量的相互作用(表18及图27)。在37℃下，ka及kd增加2至5倍，导致与HSA的亲和力增加约2倍，与RhSA的亲和力增加1/2(表18)。
表18
在HBS-P缓冲液中结合至白蛋白的SABA1.2的动力学参数。
Figure BDA0000786597750002161
另外，实施量热滴定以确定SABA1与HSA间的化学计量比。对于此研究，使用SABA1.1，一种包含His6延伸的”核心1”10Fn3(表6中的SEQ ID NO:420)。将HSA(10μl/每注射115μM蛋白质溶液)注射至含有8.1μM的浓度的SABA1.1的量热池中。实验在37℃下在PBS缓冲液(pH 7.4)中实施。图28显示SABA1.1以1:1的化学计量比结合HSA。
SABA1.2在低pH下强效结合HSA
白蛋白的长半衰期(例如，HSA的t1/2为19天)主要是由于以下事实：它们在核内体内的低pH条件下结合新生Fc受体FcRn，从而自内吞途径中被再循环。如表19中所示的，在核内体pH为5.5时，SABA1.2可强力结合HSA，表明SABA1一旦在结合至HSA后其t1/2亦将受益于FcRn再循环机制。
表19
在MES缓冲液中比较在pH 7.4与5.5下白蛋白的结合动力学
Figure BDA0000786597750002171
SABA1.2结合HSA的结构域I及II，而非结构域III
使用重组HSA片段将SABA1.2在白蛋白上的结合位点定位于N末端结构域I或II，且SABA1.2对结构域III无可检测的结合(图29)。由于结构域III是HSA中主要与FcRn相互作用的结构域，因此SABA1.2与FcRn竞争结合HSA的可能性较低，这也提高了充分地利用再循环机制以延长半衰期的可能性。
实施例5G.SABA1.2的体内药理学
在食蟹猴中进行SABA1.2的一项4周单剂量毒理学前研究以评估在两种不同剂量水平下的药动学及免疫原性。还在一项3周单剂量毒理学前研究中评价药动学及免疫原性，该研究包括静脉内施用臂与皮下施用臂。另外，在两项不同的单剂量毒理学前研究中，使用一种开发用来检测血浆试样中的SABA1.2的基于定量ELISA的测定评价了SABA1.2在食蟹猴中的药动学。
将SABA1.2以1mpk及10mpk经静脉内施用给猴。使用WinNonlin软件实施非隔室分析来评价药动学参数。如图30及下文所述的参数所示的，在此研究中，根据浓度-时间曲线下面积(AUC)评估确定，SABA1.2表现了剂量依赖性药动学。SABA1.2在10mpk的清除率(CL)为0.15ml/hr/kg，β相半衰期(t1/2)为143小时，分布体积(Vz)为30mL/kg，且总药物暴露量(AUC总)为5,609,457小时*nmol/L(表20)。SABA1.2在1mpk下的清除率(CL)为0.4ml/hr/kg，半衰期(t1/2)为124小时，分布体积(Vz)为72mL/kg，且总药物暴露量(AUC总)为214,636小时*nmol/L(表20)。
在经皮下或经静脉内施用SABA1.2后，β相药动学特征相似(图31)。SABA1.2在静脉内1mpk条件下的清除率(CL)为0.22ml/hr/kg，β相半衰期(t1/2)为125小时，分布体积(Vz)为40mL/kg，且总药物暴露量(AUC总)为357,993小时*nmol/L(表20)。SABA1.2在皮下1mpk条件下的清除率(CL)为0.32ml/hr/kg，β相半衰期(t1/2)为134小时，分布体积(Vz)为62mL/kg，且总药物暴露量(AUC总)为251,339小时*nmol/L(表20)。与静脉内相比，皮下相对生物利用度(F)为0.7。
表20
SABA1.2在猴中的药动学参数
Figure BDA0000786597750002181

Claims (27)

1.一种多肽，其包含纤连蛋白III型第10结构域(10Fn3)，其中该10Fn3具有BC、DE及FG环，且
其中所述BC环包含SEQ ID NO:112，所述DE环包含SEQ ID NO:138，且所述FG环包含SEQID NO:156，
且其中该多肽结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)。
2.一种包含10Fn3结构域的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:209的His6标签任选缺失，或者该氨基酸序列任选地在对应于SEQ ID NO:1的T94的位置处被截短且任选地具有一个或多个E或D残基的C-末端延伸，且其中所述多肽结合PCSK9。
3.权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽以小于500nM的KD结合PCSK9。
4.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽进一步包含一个或多个选自下组的药动学(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白、及血清免疫球蛋白结合蛋白。
5.一种可药用的组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的多肽。
6.包含纤连蛋白III型第10结构域(10Fn3)的多肽在制备用于治疗受试者中的高胆固醇血症的药物中的用途，其中该10Fn3具有BC、DE及FG环，且
其中所述BC环包含SEQ ID NO:112，所述DE环包含SEQ ID NO:138，且所述FG环包含SEQID NO:156，
且其中该多肽结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)。
7.权利要求6的用途，其中所述多肽包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:209的His6任选缺失，或者该氨基酸序列任选地在对应于SEQ ID NO:1的T94的位置处被截短且任选地具有一个或多个E或D残基的C-末端延伸，且其中所述多肽结合PCSK9。
8.权利要求6或7的用途，其中所述受试者具有动脉粥样硬化。
9.权利要求6或7的用途，其中所述多肽还包含聚乙二醇。
10.权利要求6或7的用途，其中所述多肽还包含唾液酸。
11.权利要求6或7的用途，其中所述多肽还包含Fc或Fc片段。
12.权利要求6或7的用途，其中所述多肽还包含转铁蛋白。
13.权利要求6或7的用途，其中所述多肽还包含血清白蛋白或血清白蛋白结合蛋白。
14.权利要求6或7的用途，其中所述多肽还包含血清免疫球蛋白结合蛋白。
15.权利要求6或7的用途，其中所述药物是用于皮下施用的。
16.权利要求6或7的用途，其中所述药物是用于静脉内施用的。
17.权利要求16的用途，其中所述静脉内施用是通过推注进行的。
18.权利要求16的用途，其中所述静脉内施用是通过连续输注进行的。
19.一种多肽，其包含纤连蛋白III型第10结构域(10Fn3)，其中该10Fn3的选自环BC、DE及FG的至少一个环具有相对于人10Fn3结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列，其中该多肽结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)，其中所述10Fn3具有与SEQ ID NO:209至少80％相同的氨基酸序列，且其中所述多肽具有BC、DE和FG环，且
所述BC环包含SEQ ID NO:112，所述DE环包含SEQ ID NO:138，且所述FG环包含SEQ IDNO:156。
20.权利要求4的多肽，其中所述多肽还包含聚乙二醇部分或唾液酸部分。
21.权利要求4的多肽，其中所述多肽还包含Fc或Fc片段部分。
22.权利要求4的多肽，其中所述多肽还包含转铁蛋白部分。
23.权利要求4的多肽，其中所述多肽还包含血清白蛋白部分。
24.权利要求4的多肽，其中所述多肽还包含血清白蛋白结合蛋白。
25.权利要求4的多肽，其中所述多肽还包含血清免疫球蛋白结合蛋白。
26.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列，其中所述多肽不含His6标签。
27.权利要求19的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列，其中所述多肽不含His6标签。
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Application publication date: 20151223

Assignee: Haisen Bio-Pharmaceutical Co.,Ltd.

Assignor: Lib therapy Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024990000131

Denomination of invention: Fibronectin based scaffold domain protein combined with PCSK9

Granted publication date: 20230117

License type: Exclusive License

Record date: 20240409