CN105168507A - 一种具有改善记忆力功能的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及保健食品技术领域，公开了一种具有改善记忆力功能的组合物及其制备方法和应用。本发明所述组合物由龙眼肉、茯苓、莲子、核桃酶解提取物、磷酯酰丝氨酸和牛磺酸制成。本发明以龙眼肉为君药，辅以臣药茯苓、莲子，三药配伍协同发挥养心安神，补肾健脾之功效，再佐以具有改善脑代谢提高记忆力的核桃酶解提取物、提高细胞膜流动性增强可塑性的功能因子磷脂酰丝氨酸和改善记忆力的牛磺酸，共同达到改善记忆力的目的，各种原料均为药食同源和新资源食品，安全无毒副作用可长期作为保健食品食用。

Description

一种具有改善记忆力功能的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及保健食品技术领域，具体涉及一种具有改善记忆力功能的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着生活节奏的加快，生活压力的加大，健忘、失眠等症状的发生率越来越高，且有年轻化的趋势。导致健忘的原因很多，除了年龄的因素以外，用脑过度、压力过大、睡眠不足、不良情绪、不良嗜好等都会导致记忆力的减退。健忘是脑功能减退的重要症状，中医认为，记忆力减退是一个涉及多个脏腑，的综合性复杂病症。其病位主要在心、脾、肾，通过多脏腑的演变，最终导致邪扰心神或心神失养，心脾肾的亏损是其内在的病理基础。记忆力减退严重影响正常的工作学习，给正常生活带来诸多不便和困扰。因此，如何改善记忆力成为社会关注的热点问题之一。
目前人们常通过长期食用传统健脑益智的食物、药材等达到改善记忆力的功效。但是通过食疗改善记忆力效果并不突出，而促智药如哈伯因(石杉碱甲)等药物，临床上用于治疗良性记忆障碍及老年性痴呆，作为胆碱酯酶抑制剂，服用后可见恶心、头晕、出汗、腹痛、视力模糊等副作用，并不适用于正常长期服用。因而开发效果显著，安全、无毒副作用，可长期服用的保健食品将成为人们迫切的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有改善记忆力功能的组合物，使其具有改善记忆力功效且安全无副作用，可做保健食品长期食用，同时提供该组合物的制备方法以及其在改善记忆力保健品中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种具有改善记忆力功能的组合物，由龙眼肉、茯苓、莲子、核桃酶解提取物、磷酯酰丝氨酸和牛磺酸制成，所述核桃酶解提取物为核桃粕经碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L和复合蛋白酶Protamex水解后的水解产物。核桃蛋白为本领域中常见的以核桃或核桃粕为原料经碱溶酸沉方法获得的核桃蛋白，而所述水解产物是核桃蛋白进一步经由上述两种蛋白酶酶解后的游离氨基酸、二肽、三肽以及多肽物质。
本发明以龙眼肉为君药，根据中医复方理论，辅以具有抗衰老、抗氧化等作用的茯苓和莲子，再加上具有改善脑代谢提高记忆力的核桃酶解提取物、提高细胞膜流动性增强可塑性的功能因子磷脂酰丝氨酸和改善记忆力的牛磺酸整体调理，共同发挥最佳的保健功效，改善记忆力。同时，本发明组合物原料均为药食同源和新资源食品，安全无毒副作用可长期作为保健食品食用。
作为优选，所述组合物由龙眼肉、茯苓和莲子经水煎提取，与核桃酶解提取物、磷酯酰丝氨酸和牛磺酸混合而成。
作为优选，各原料重量份数为：
龙眼肉200～800份、莲子200～800份、茯苓200～800份、核桃酶解提取物10～150份、磷脂酰丝氨酸10～150份、牛磺酸3～50份。
在本发明的一些具体实施方式中，各原料还可以选择如下：
龙眼肉200份、莲子800份、茯苓200份、核桃酶解提取物150份、磷脂酰丝氨酸10份、牛磺酸50份；
龙眼肉800份、莲子200份、茯苓800份、核桃酶解提取物10份、磷脂酰丝氨酸150份、牛磺酸3份；
龙眼肉600份、莲子500份、茯苓600份、核桃酶解提取物80份、磷脂酰丝氨酸100份、牛磺酸40份；或
龙眼肉400份、莲子600份、茯苓500份、核桃酶解提取物50份、磷脂酰丝氨酸30份、牛磺酸10份。
本发明所述核桃酶解提取物为核桃蛋白经碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L和复合蛋白酶Protamex水解后的多肽。作为进一步的优选方案，其由以下方法制备获得：
步骤1、核桃粕加水研磨获得核桃粕浆液，加碱调整pH值为8.0-9.0，离心，上清液酶法除杂，加酸沉淀，沉淀清洗后获得核桃蛋白；
步骤2、核桃蛋白用碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L和复合蛋白酶Protamex水解至水解度为8-12％，灭酶，离心后收集上清液为核桃蛋白酶解液；
步骤3、核桃蛋白酶解液通过滤布和超滤膜分离富集核桃酶解提取物。
其中，优选地，步骤1所述上清液酶法除杂为上清液加入占核桃粕总重1％的α-淀粉酶和占核桃粕总重0.5％纤维素酶进行酶法除杂。
优选地，步骤1所述碱为氢氧化钠，所述加酸沉淀为加1mol/L的HCl溶液将pH值调至4.2，搅拌30-60min，离心分离获得沉淀。
优选地，步骤1为：
按重量向1份核桃粕中加入10-15份的水，过胶体磨得到核桃粕浆液，加入NaOH溶液(1mol/L)调整核桃粕浆液pH至8.0-9.0，在40-50℃下搅拌60-90min，然后在3500r/min下离心10min，过滤得到上清液；往上清液中加入水解酶进行酶法除杂，之后加入HCl溶液(1mol/L)将pH调至4.2，搅拌30-60min，离心分离，得到沉淀物，采用一定浓度乙醇进行搅拌，并用水进行清洗，喷雾干燥，得到核桃蛋白。
优选地，步骤2为：
核桃蛋白加水搅拌，以2000-3000U/g蛋白计量加入碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L、以1200-2500U/g蛋白计量加入复合蛋白酶Protamex，于50-55℃下水解至水解度8-12％，灭酶，离心后收集上清液为核桃蛋白酶解液。
优选地，步骤3为：
将核桃蛋白酶解液过100目滤布，然后通过膜通量10000Da的超滤膜，收集透过液，再通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到核桃多肽溶液，真空浓缩至固形物30-40％，进行喷雾干燥，获得核桃酶解提取物。
同时，本发明还提供了所述组合物的制备方法，取龙眼肉、茯苓和莲子经水煎提取，提取液浓缩喷雾干燥后，加入牛磺酸、磷脂酰丝氨酸和核桃酶解提取物混合均匀，获得所述组合物。
本发明组合物按照《保健食品检验与评价规范》对组合物进行功效检测，分别以小鼠Morris水迷宫认知实验中游泳的潜伏期和游泳路程和跳台试验中潜伏期及错误次数为观察指标，评价本发明中的组合物对实验动物改善记忆能力的影响，结果显示，本发明组合物对记忆障碍具有改善作用以及益智的作用；同时，在对大鼠长期毒性试验中，本发明组合物连续90天喂食大鼠，与正常组相比，在大鼠体重、血液学指标、血液生化指标、组织病理状态等方面均无明显差异，证明本发明组合物安全性高，可以长期服用。
基于上述有益效果，本发明提供所述组合物在制备改善记忆力保健食品中的应用。作为优选，所述保健食品为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、泡腾剂、饮料、合剂或口服液。
在获得本发明组合物后，本领域技术人员可以按照常规剂型的制作要求以及辅料一般选择将组合物制成适合的剂型，这些剂型包括但不仅限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、泡腾剂、饮料、合剂或口服液，所述辅料可以选择诸如微晶纤维素、预胶化淀粉、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、乳糖、玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、甲基硅油、蔗糖、甘露醇、山梨醇、明胶、黄芪胶等。
由以上技术方案可知，本发明以龙眼肉为君药，辅以臣药茯苓、莲子，三药配伍协同发挥养心安神，补肾健脾之功效，再佐以具有改善脑代谢提高记忆力的核桃酶解提取物、提高细胞膜流动性增强可塑性的功能因子磷脂酰丝氨酸和改善记忆力的牛磺酸，共同达到改善记忆力的目的，各种原料均为药食同源和新资源食品，安全无毒副作用可长期作为保健食品食用。
具体实施方式
本发明公开了一种具有改善记忆力功能的组合物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述组合物及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种具有改善记忆力功能的组合物及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：本发明组合物
1、原料
龙眼肉400份、莲子600份、茯苓500份、核桃酶解提取物50份、磷脂酰丝氨酸30份、牛磺酸10份。
2、制备方法
(1)核桃酶解提取物的制备
按重量向1份核桃粕中加入10-15份的水，过胶体磨得到核桃粕浆液，加入NaOH溶液(1mol/L)调整核桃粕浆液pH至8.0-9.0，在40-50℃下搅拌60-90min，然后在3500r/min下离心10min，过滤得到上清液；往上清液加入占核桃粕总重1％的α-淀粉酶和占核桃粕总重0.5％纤维素酶进行进行酶法除杂，之后加入HCl溶液(1mol/L)将pH调至4.2，搅拌30-60min，离心分离，得到沉淀物，采用一定浓度乙醇进行搅拌，并用水进行清洗，喷雾干燥，得到核桃蛋白。
核桃蛋白加水搅拌，以2000-3000U/g蛋白计量加入碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L(购于诺维信)、以1200-2500U/g蛋白计量加入复合蛋白酶Protamex(购于诺维信)，于50-55℃下水解至水解度8-12％，灭酶，离心后收集上清液为核桃蛋白酶解液。
将核桃蛋白酶解液过100目滤布，然后通过膜通量10000Da的超滤膜，收集透过液，再通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到核桃多肽溶液，真空浓缩至固形物30-40％，进行喷雾干燥，获得核桃酶解提取物。
(2)将原料药龙眼肉、茯苓、莲子经水煮提取浓缩喷雾干燥后，加入牛磺酸、磷脂酰丝氨酸和核桃酶解提取物混合均匀，获得所述组合物。
实施例2：本发明中药组合物
1、原料
龙眼肉600份、莲子500份、茯苓600份、核桃酶解提取物80份、磷脂酰丝氨酸100份、牛磺酸40份。
2、制备方法
同实施例1。
实施例3：本发明中药组合物
1、原料
女龙眼肉200份、莲子800份、茯苓200份、核桃酶解提取物150份、磷脂酰丝氨酸10份、牛磺酸50份。
2、制备方法
同实施例1。
实施例4：本发明中药组合物
1、原料
龙眼肉800份、莲子200份、茯苓800份、核桃酶解提取物10份、磷脂酰丝氨酸150份、牛磺酸3份。
2、制备方法
同实施例1。
实施例5：本发明所述组合物对大鼠长期毒性实验研究
1、受试样品：实施例1组合物；
2、受试动物：SPF级wistar大鼠，体重：100-150g，140只，雌雄各半，由广州中山大学实验动物中心提供；
3、实验设计依据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》(2003版)中“食品安全性毒理学评价程序规定”进行；
4、剂量设计及分组设空白对照组，AS1322-02保健食品低、中、高剂量组。取检疫合格的动物称重，每组20只，雌雄各半。具体剂量为(1.33g·kg-1、4.0g·kg-1、8.0g·kg-1)，相当于人推荐用量的(10倍、30倍、60倍)。
5、给药方法受试样品以蒸馏水溶解并稀释至设定剂量浓度，经口灌胃喂食。每日同一时段灌胃喂食1次，灌胃体积为2ml每100g体重。试验期间，每周称体重1次，按体重调整灌胃体积，连续喂食90天。末次喂食后各组动物空腹15h，第二天取材。
6、组合物对大鼠一般状态及体重的影响
各组雌性和雄性动物的精神状态均良好，毛色光洁，活动自如，呼吸均匀，摄食量及粪便未见明显异常，口鼻内无异常分泌物。与空白对照组比较，各受试样品组动物体重无显著差异(P均>0.05)，增重均匀，详见表1。
表1组合物对大鼠体重的影响(g，n＝20，)
注：组间比较无显著性差异。
7、组合物对大鼠脏器系数的影响
如表2所示，与空白对照组比较，受试品各剂量组大鼠的心脏、肝、脾脏、肺、脑、肾脏系数无显著差异(P均>0.05)。
表2组合物对大鼠脏器系数的影响(n＝20，)
组别 心脏 肝 脾脏 肺 脑 肾脏
空白对照 3.03±0.33 32.56±4.32 2.54±0.39 5.42±0.81 3.32±0.18 6.65±0.70
低剂量组 2.90±0.08 28.18±3.79 2.33±0.22 5.81±0.85 3.57±0.41 6.56±0.58
中剂量组 3.16±0.21 31.47±4.97 3.16±0.79 5.47±0.53 3.49±0.43 6.21±0.44
高剂量组 3.18±0.19 35.15±2.28 2.44±0.36 5.22±0.46 3.36±0.39 6.71±0.90
注：组间比较无显著性差异。
8、组合物对大鼠血常规的影响
如表3所示，与空白对照组比较，受试品各剂量组的红细胞计数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、血小板计数(PLT)、(BA)、白细胞计数(WBC)、淋巴细胞相对计数(LY)、单核细胞相对计数(MO)、中性粒细胞相对计数(NE)、嗜酸性粒细胞(EO)无显著差异(P均>0.05)。
表3组合物对大鼠血常规的影响
注：组间比较无显著性差异。
9、组合物对大鼠血生化的影响
如表4所示，与空白对照组比较，受试品各剂量组的碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总蛋白质(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(CHOL)无显著差异(P均>0.05)。
表4对大鼠血生化的影响
组别 ALP GLU BUN CREA ALT
空白对照组 140.23±12.01 4.09±0.76 8.29±0.91 140.72±32.63 85.77±14.25
低剂量组 121.56±19.81 4.71±0.72 8.03±1.04 133.12±12.82 74.10±5.79
中剂量组 128.50±42.52 4.62±0.64 7.74±0.89 132.29±13.75 69.66±23.27
高剂量组 115.81±41.41 4.90±0.79 7.59±0.74 166.38±45.48 68.82±25.14
组别 AST TBIL TP ALB CHOL
空白对照组 126.53±39.38 43.87±12.70 80.06±3.26 44.65±3.02 1.66±0.23
低剂量组 137.67±36.34 41.21±9.93 81.94±4.70 42.52±1.21 1.48±0.26
中剂量组 118.13±44.55 50.81±11.35 82.81±2.46 42.62±3.29 1.49±0.09
高剂量组 114.29±20.16 38.44±18.97 79.52±6.66 43.08±3.42 1.63±0.49
注：组间比较无显著性差异。
综合上述结果，在本实验条件及剂量范围内，长期给予本发明组合物未影响实受试大鼠的一般状态及体重，未对主要脏器、及血液***造成明显的毒性，导致任何毒性反应，提示按推荐剂量长期服用组合物的安全性较高。
实施例6：本发明所述组合物对记忆障碍的保护作用动物实验
1、动物分组
小鼠随机均分为5组，即正常对照组、模型组、低剂量组、高剂量组、阳性对照药哈伯因组(石杉碱甲，0.1mg/kg)。每天灌胃给药一次(0.2mL/10g)，连续30d后，除正常对照组外，采用东莨菪碱分别复制小鼠记忆获得障碍模型，用Morris水迷宫(东莨菪碱所致定位航行以及空间记忆实验)测试测定小鼠学习成绩。
2、受试物制备
根据临床拟用日用量，按照《保健食品检验与评价技术规范》等技术要求，通过体表面积折算得。每个样品对小鼠喂食均设低、高剂量约分别相当于成人拟日用量的10、20倍，口服。即为：低剂量组(1.3g/kg)、高剂量组(2.6g/kg)。
阳性对照药哈伯因，临床成人用量约为0.4mg/天，通过体表面积换算得小鼠剂量为0.06mg/kg，本实验采用0.1mg/kg。
每天灌胃给药一次(0.2mL/10g)，连续30d后，除正常对照组外，采用东莨菪碱分别复制小鼠记忆获得障碍模型，用Morris水迷宫(东莨菪碱所致定位航行以及空间记忆实验)测试测定小鼠学习成绩。
3、检测指标
Morris水迷宫实验参照文献方法进行，从第25天开始进行定位航行实验，连续测试4d，记录小鼠在90s内寻找到平台的时间即逃避潜伏期、游泳路程，在原平台所在象限的游泳时间比例、跨原平台所在位置的次数(即穿梭次数)和第一次到达原平台的时间。
4、实验方法
对记忆障碍的保护作用研究实验-水迷宫实验
小鼠随机均分为5组，即正常对照组，模型组，低剂量组(1.3g/kg)、高剂量组(2.6g/kg)、阳性对照药哈伯因组(石杉碱甲，0.1mg/kg)。每天灌胃给药一次(0.2mL/10g)，连续30d后，除正常对照组外，采用东莨菪碱分别复制小鼠记忆获得障碍模型，用Morris水迷宫(东莨菪碱所致定位航行以及空间记忆实验)测试测定小鼠学习成绩。
5、统计学分析
所有实验数据均以表示，采用方差分析，先进行方差齐性检验，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
6、结果判定
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，根据以下标准判定受试样品具有改善记忆障碍的作用。
本发明组合物对记忆障碍的保护作用研究实验结果具有统计学意义，结果如下表5-表7中所示：
表5对小鼠水迷宫游泳潜伏期(s)的影响(定位航行试验)(n＝12)
组别 第1天 第2天 第3天 第4天
正常组 67.2±16.3 60.3±12.3 52.1±10.3 36.5±6.8
模型组 68.4±14.5 64.2±10.2 60.2±9.8△ 55.6±11.3△△
低剂量组 67.2±15.5 61.9±8.6 55.0±8.5 49.1±6.5
高剂量组 67.3±17.2 62.0±11.6 56.1±9.9 47.2±7.2
哈伯因 68.3±15.6 59.1±13.8 56.3±13.1 48.8±11.1
注：与正常对照组相比，△p<0.05，△△p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。
表6对小鼠水迷宫游泳路程(cm)的影响(定位航行试验)(n＝12)
组别 第1天 第2天 第3天 第4天
正常组 864.5±131.1 743.7±159.7 586.0±130.1 493.0±146.0
模型组 890.6±126.6 774.6±125.0 740.±128.8△△ 702.2±139.7△△
AS1322-02低 870.3±170.1 778.9±151.9 736.8±93.9 677.2±97.8
AS1322-02高 882.3±133.5 755.3±179.3 720.6±121.5 675.6±108.9
哈伯因 892.9±226.6 747.2±93.5 683.3±112.8 669.6±128.3
注：与正常对照组相比，△p<0.05，△△p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。
由表5、6可以看出，在为期4天的认知训练中，随着训练时间的延长，各组小鼠的游泳潜伏期和游泳路程均逐渐缩短，说明小鼠记忆障碍模型成功建立。与模型组相比，产品各剂量组小鼠的潜伏期均有缩短，但未见统计学差异。
表7对氢溴酸东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响(空间探索试验)(n＝12)
注：与正常对照组相比，△p<0.05，△△p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。
由表7可以得出，与正常对照组小鼠相比，模型对照组小鼠在原平台所在象限的游泳时间明显缩短(p<0.05)，第1次达平台的时间明显延长(p<0.01)，小鼠穿越原平台所在位置的次数明显减少(p<0.01)。与模型对照组相比，产品低、高剂量组小鼠在原平台所在象限的游泳时间有延长的趋势(p>0.05)；产品低、高剂量组小鼠第1次达平台的时间明显缩短(p<0.05)；小鼠穿越原平台的次数明显增加(p>0.05)。阳性药哈伯因组则能使小鼠第1次达平台的时间明显延长(p<0.05)，小鼠穿越原平台所在位置的次数明显减少(p<0.05)。提示东莨菪碱损伤了小鼠的空间记忆能力，而产品可翻转东莨菪碱对小鼠空间记忆功能的损伤。说明本实验中检测样品对东莨菪碱模型小鼠的记忆障碍均有一定的改善作用，实验组动物给药剂量与中毒存活时间呈现剂量-效应关系，高剂量组存活时间升高显著。
在本实施例中，各组动物适应性喂养3d后，灌胃给药，正常对照组和模型对照组分别灌胃给予等体积0.5％CMCNA，每日给药1次，灌胃体积0.2mL/10g体重，连续给药30天。Morris水迷宫实验参照文献方法进行，从第25天开始进行定位航行实验，连续测试4d，记录小鼠在90s内寻找到平台的时间即逃避潜伏期、游泳路程，在原平台所在象限的游泳时间比例、跨原平台所在位置的次数(即穿梭次数)和第一次到达原平台的时间。各组有显著性差异，呈现较明显的剂量-效应关系，且以高剂量组效果显著。
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，本动物实验研究结论为受试样品具有改善记忆的作用。
实施例7：本发明所述组合物对记忆获得的保护作用动物实验
记忆力减退的主要症状是学习记忆障碍，现代研究常借助学习记忆障碍动物模型，并通过益智学指标测定检验一种药物治疗记忆力减退的效果。
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，对实验动物进行记忆获得障碍模型，跳台法测定其学习成绩。各组之间结果具有显著性差异，判定受试样品具有改善记忆力的功效。
本发明组合物的两个剂量组在小鼠跳台实验中各组指标有显著性差异，呈现较明显的剂量-效应关系，且以高剂量组效果显著。本动物实验研究结论为受试样品具有改善记忆的功效。
1、动物分组
小鼠随机均分为5组，即正常对照组，模型组，低剂量组、高剂量组、阳性对照药哈伯因组(石杉碱甲，0.1mg/kg)。每天灌胃给药一次(0.2mL/10g)，连续30d后，除正常对照组外，采用5mg/kg的氢溴酸东莨菪碱分别复制小鼠记忆获得障碍模型，跳台法测定小鼠学习成绩。
2、受试物制备
根据临床拟用日用量，按照《保健食品检验与评价技术规范》等技术要求，通过体表面积折算得。每个样品对小鼠喂食均设低、高剂量约分别相当于成人拟日用量的10、20倍，口服。即为：低剂量组(1.3g/kg)、高剂量组(2.6g/kg)。
阳性对照药哈伯因，临床成人用量约为0.4mg/天，通过体表面积换算得小鼠剂量为0.06mg/kg，本实验采用0.1mg/kg。
3、检测指标
以跳台仪测试记录小鼠第一次跳下时间(即潜伏期)及小鼠5min内跳下次数(即错误次数)，以潜伏期及错误次数作为该实验的考察指标。
4、实验方法
经筛选过的健康成年昆明小鼠60只，体重(20-24)g，雄性，每组12只。小鼠随机均分为5组，即正常对照组(C)，模型组(M)，低剂量组(1.3g/kg)、高剂量组(2.6g/kg)、阳性对照药哈伯因组(石杉碱甲，0.1mg/kg)。除正常对照及模型组灌胃给予0.5％CMCNA(0.2mL/10g)，其他各组给与相应的药物，每天灌胃给药一次，连续30d后，于第30天上午给药后1h开始训练。除正常对照组外，在训练前20min采用2mg/kg氢溴酸东莨菪碱分别复制小鼠记忆获得障碍模型，各组平行给药，跳台法测定小鼠学习成绩。
小鼠跳台试验训练方法及观察指标如下：
小鼠跳台实验装置为一方形盒子底部为(10cm×10cm)电栅栏(电压36V)，高30cm，内有高3.2cm，直径4.2cm的平台，实验主要分为以下几个阶段：
(1)适应期：把动物放在平台上，此时电栅栏不通电，记录跳下平台的潜伏期，动物跳下平台后在测试箱内自由探索10s后放回笼中。
(2)训练：训练时先将跳台仪与可调变压器相连，电压控制在36V。于训练时将第一批的5-6只小鼠分别放入跳台仪的相应的格子内的平台上，当动物跳下平台后即给予36V的电刺激，持续2-3s，然后将其放回笼中。
(3)测试：学***台上，同时开动秒表，记录小鼠第一次跳下时间(即潜伏期)及小鼠5min内跳下次数(即错误次数)，以潜伏期及错误次数作为该实验的考察指标，潜伏期延长或(和)错误次数减少表明动物学习记忆能力增强。试验中如果5分钟小鼠仍未跳下橡胶圆台，则潜伏期计为300s。
24h后测验小鼠学习成绩。以跳台仪测试记录小鼠第一次跳下时间(即潜伏期)及小鼠5min内跳下次数(即错误次数)，以潜伏期及错误次数作为该实验的考察指标。
5、统计学分析所有实验数据均以表示，采用方差分析，先进行方差齐性检验，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
6、结果判定
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，根据以下标准判定受试样品改善记忆的功效。
对记忆获得的保护作用研究实验结果具有统计学意义；
对记忆获得的保护作用研究实验，结果显示与正常对照组相比，给予5mg/kg氢溴酸东莨菪碱后模型组小鼠跳台的潜伏期明显缩短(p<0.01)，错误次数明显增加(p<0.01)。各产品组的学习成绩均优于模型组，其中高剂量组的潜伏期明显延长(p<0.05)。阳性对照药哈伯因则错误次数明显减少(p<0.05)，潜伏期明显延长(p<0.05)。提示，本产品对氢溴酸东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍有明显的改善作用，见表8。
表8对氢溴酸东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍的影响()
注：与正常对照相比，△p<0.01，△△p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。
在本实施例中，采用记忆缺失的动物模型，不但有助于评定药物的作用，且可初步分析药物的作用机制。东莨菪碱是M胆碱受体拮抗剂,可阻断大脑皮质、隔区及海马结构中的M胆碱受体引起胆碱能***功能障碍，从而产生学习记忆能力减退。本实验也证明了东莨菪碱可明显降低大鼠的学习记忆能力。给予5mg/kg氢溴酸东莨菪碱后模型组小鼠跳台的潜伏期明显缩短(p<0.01)，错误次数明显增加(p<0.01)；而给予一定剂量本产品样品对氢溴酸东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍有明显的改善作用。
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，本动物实验研究结论为受试样品具有改善记忆的功效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有改善记忆力功能的组合物，其特征在于，由龙眼肉、茯苓、莲子、核桃酶解提取物、磷酯酰丝氨酸和牛磺酸制成，所述核桃酶解提取物为核桃粕经碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L和复合蛋白酶Protamex水解后的水解产物。
2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，由龙眼肉、茯苓和莲子经水煎提取，与核桃酶解提取物、磷酯酰丝氨酸和牛磺酸混合而成。
3.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，各原料重量份数为：
龙眼肉200～800份、莲子200～800份、茯苓200～800份、核桃酶解提取物10～150份、磷脂酰丝氨酸10～150份、牛磺酸3～50份。
4.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述核桃酶解提取物由以下方法制备获得：
步骤1、核桃粕加水研磨获得核桃粕浆液，加碱调整pH值为8.0-9.0，离心，上清液酶法除杂，加酸沉淀，沉淀清洗后获得核桃蛋白；
步骤2、核桃蛋白用碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L和复合蛋白酶Protamex水解至水解度为8-12％，灭酶，离心后收集上清液为核桃蛋白酶解液；
步骤3、核桃蛋白酶解液通过滤布和超滤膜分离富集核桃酶解提取物。
5.根据权利要求4所述组合物，其特征在于，步骤1所述上清液酶法除杂为上清液加入占核桃粕总重1％的α-淀粉酶和占核桃粕总重0.5％纤维素酶进行酶法除杂。
6.根据权利要求4所述组合物，其特征在于，步骤2为：
核桃蛋白加水搅拌，以2000-3000U/g蛋白计量加入碱性内切蛋白酶Alcalase2.4L、以1200-2500U/g蛋白计量加入复合蛋白酶Protamex，于50-55℃下水解至水解度8-12％，灭酶，离心后收集上清液为核桃蛋白酶解液。
7.根据权利要求4所述组合物，其特征在于，步骤3为：
将核桃蛋白酶解液过100目滤布，然后通过膜通量10000Da的超滤膜，收集透过液，再通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到核桃多肽溶液，真空浓缩至固形物30-40％，进行喷雾干燥，获得核桃酶解提取物。
8.权利要求1-7任意一项所述组合物在制备改善记忆力保健食品中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述保健食品为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、泡腾剂、饮料、合剂或口服液。
10.权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于，取龙眼肉、茯苓和莲子经水煎提取，提取液浓缩喷雾干燥后，加入牛磺酸、磷脂酰丝氨酸和核桃酶解提取物混合均匀，获得所述组合物。
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