CN105154508A - 一种抗菌肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌肽的制备方法。该方法包括如下步骤:(1)取牛血,进行血细胞破碎后加入菠萝蛋白酶进行酶解;(2)向酶解液中加入乙酸浸提,离心取上清,调节pH至6.0±0.5,获得牛血抗菌肽粗提物;(3)牛血抗菌肽粗提物纯化;(4)冷冻干燥。其制备方法条件温和、无污染、效率高、成本低,为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法,可应用于大规模地从新鲜牛血中分离纯化抗菌肽的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种抗菌肽的制备方法。
背景技术
目前,随着传统抗生素的滥用,细菌耐药性问题和药物残留问题已日趋严重,甚至出现超级细菌,而这些问题也直接威胁着人类健康乃至整个生物圈的生态平衡,已引起世界极高度的关注,而寻求一种取代传统抗生素的无残留、无耐药性的新型抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽具有高效的抑菌效果和广泛而稳定的生物学活性,已经广泛引起人们的兴趣和关注。抗菌肽不仅具有广谱、高效的抗微生物活性,而因其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性,在机体内无残留,具广阔的开发应用前景,抗菌肽的应用必将带来一场抗生素新的革命。
我国作为世界养牛业大国,牛血来源丰富、开发不充分、价格低廉,可以满足大规模深化加工的需求,具有很强的开发应用及推广价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌肽的制备方法,其制备方法条件温和、无污染、效率高。为了实现上述目的,本发明提出如下技术方案:
一种抗菌肽的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)取牛血,进行血细胞破碎(目的是释放血红蛋白)后加入菠萝蛋白酶进行酶解;
(2)向酶解液中加入乙酸浸提,离心取上清,调节pH至6.0±0.5(如6.0),获得牛血抗菌肽粗提物;
(3)将所述牛血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱,采用洗脱液进行洗脱,收集具有抗菌活性的洗脱峰;
(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG-25凝胶柱,采用洗脱液进行洗脱,收集洗脱峰,获得牛血抗菌肽溶液;
(5)将步骤(4)收集的牛血抗菌溶液冷冻干燥。
在所述方法的步骤(1)中,所述菠萝蛋白酶与所述牛血的配比可为750-35000U:100ml(如1750-3500U:100ml,具体如3500U:100mL);所述酶解的温度可为70~90℃(如70℃),时间可为4~6h(如4h)。另外,在本发明中,所述进行血细胞破碎具体通过采用组织捣碎机搅拌所述牛血实现的。
在本发明中,所述菠萝蛋白酶的酶活为3500U/mg。相应的,所述菠萝蛋白酶与所述牛血的配比可为0.5-10mg:100ml(如0.5-1mg:100ml,具体如1mg:100mL)。
在所述方法的步骤(2)中,所述向酶解液中加入乙酸具体可为:向所述酶解液中加入等体积的5%(体积百分含量)的乙酸水溶液;所述浸提具体可为:4~37℃(如4℃~10℃,再如4℃)震荡16-20h(如16h);所述离心为:6600g-10000g(如10000g)4~10℃(如4℃)离心20min~30min(如20min)。
在所述方法的步骤(3)中,所述洗脱液具体可为:pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液;所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm2·h。
在本发明的一个实施例中,步骤(3)的洗脱过程中共产生两个洗脱峰,所述具有抗菌活性的洗脱峰实际为第二个洗脱峰。所述抗菌活性具体体现为抗如下细菌中的至少一种:大肠杆菌(如ACTT25922)、绿脓杆菌(如ACTT27853)、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。
在所述方法的步骤(4)中,所述洗脱液具体可为:pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液;所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm2·h。
在本发明的一个实施例中,步骤(4)的洗脱过程中只产生一个洗脱峰,该洗脱峰即为纯化后的牛血抗菌肽样品。
在所述方法的步骤(3)中,SephadexG-100凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言,本发明中所采用的SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品,其产品目录号为17-0061-02)。所述上样的上样量为10ml;所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。
在所述方法的步骤(4)中,SephadexG-25凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言,本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品,其产品目录号为17-0033-1。所述上样的上样量为10ml;所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。
在上述方法中,所述牛血即可为新鲜的牛血,也可以为经冷冻后融化的牛血。
利用如上所述方法提取得到的牛血抗菌肽也属于本发明的保护范围。
具体而言,本发明具有以下优点:
1、本发明方法实现了从牛血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质,为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。
2、采用本发明方法提取的抗菌肽,属于天然提取物,具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌、抗病毒、促生长和调节免疫等广泛而稳定的功能特点。
3、与同类方法相比,本发明方法操作方便,设备简单,提取周期短,而且分离提取率高。
4、本发明所开发产品的原料来源丰富,生产成本低,可以使牛血得到高值化利用。因此本发明的应用不仅可以带来良好的经济效益,而且还具有良好的生态效益,进而还具有重要的公共卫生学意义,符合构建节约环保型社会的理念。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
1、从牛屠宰场收集新鲜牛血,组织捣碎机搅拌均匀(同样可以将采集的牛血冷冻待用时融化后再按上步骤进行),此步骤的目的是破碎血细胞,释放血红蛋白,冻融之后效果更佳。
2、向步骤1处理过的牛血中加入菠萝蛋白酶,菠萝蛋白酶与牛血的配比为1mg木瓜蛋白酶/100ml牛血原液,混匀,在70℃条件下酶解4h,以得到酶解液。
3、向步骤2的酶解液加入等体积的5%乙酸(体积百分含量,溶剂为水),4℃震荡浸提16h,8000r/min(相当于10000g)4℃离心20min,留取上清,调其pH值至6.0,即为牛血抗菌肽的粗提物。
4、4℃下将牛血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱(柱长与内径比为
8:1,SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品,其产品目录号为17-0061-02)进行层析,上样量为10ml,洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液,洗脱的速度为10.0mL/cm2·h,洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测,自动收集器收集后,记录仪记录。
牛血粗提物经SephadexG-100凝胶柱层析后出现2个洗脱峰。将洗脱峰各收集管的组分取20μL进行抑菌试验。采用琼脂糖弥散方法(检测菌在琼脂平板上
的终浓度为106CFU/ml)对收集的洗脱液进行检测,检测收集液对大肠杆菌ACTT25922株的抗菌作用,以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽作为阳性对照,以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽作为阴性对照。收集具有抑菌作用的洗脱液。
5、将步骤4获得的有效的抗菌肽(合并的具有抑菌作用的洗脱液,即经SephadexG-100凝胶柱层析后收集的第9-16管)浓缩之后进一步用SephadexG-25凝胶柱(柱长与内径比为8:1,本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品,其产品目录号为17-0033-1)进行层析,上样量为10ml,洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液,洗脱的速度为10.0mL/cm2·h,洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测,自动收集器收集后,记录仪记录。收集具有抑菌作用的洗脱液,将其置于-20℃条件下保存。
6、将步骤5获得的有效的抗菌肽溶液冷冻干燥。
实施例1获得的牛血抗菌肽的抗菌试验
采用琼脂糖弥散法,对实施例1从牛血中提取的牛血抗菌肽进行抗菌活性检测,测定抑菌圈直径大小,具体操作同实施例1步骤4中相关描述。供试细菌有:大肠杆菌ACTT25922、绿脓杆菌ACTT27853株、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。针对每个供试细菌均同时以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽,以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽的阴性对照。
实验重复三次,结果取平均值。
结果表明,实施例1从牛血中提取的牛血抗菌肽对各供试菌株均有明显的抑制作用,而阴性对照均无抗菌活性。
Claims (5)
1.一种抗菌肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)取牛血,进行血细胞破碎后加入菠萝蛋白酶进行酶解;
(2)向酶解液中加入乙酸浸提,离心取上清,调节pH至6.0±0.5,获得牛血抗菌肽的粗提物;
(3)将所述牛血抗菌肽的粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱,采用洗脱液进行洗脱,收集具有抗菌活性的洗脱峰;
(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG-25凝胶柱,采用洗脱液进行洗脱,收集洗脱峰,获得所述牛血抗菌肽溶液;
(5)将步骤(4)收集的牛血抗菌肽溶液冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述菠萝蛋白酶与所述牛血的质量配比为1750-35000U:100ml;和/或步骤(1)中,所述酶解的温度为70~90℃,时间为4~6h。
3.根据根据权利要求1所述的一种抗菌肽的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述向酶解液中加入乙酸为:向所述酶解液中加入等体积的体积百分含量为5%的乙酸水溶液;和/或步骤(2)中,所述浸提为4~37℃震荡16-20h;和/或步骤(2)中,所述离心为6600~10000g4℃离心20~30min。
4.根据根据权利要求1中所述的一种抗菌肽的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液;和/或所述洗脱的速度为10.0mL/cm2·h。
5.根据权利要求1中所述的一种抗菌肽的制备方法,其特征在于:步骤(4)中,所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液;和/或所述洗脱的速度为10.0mL/cm2·h。
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CN106148463A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-11-23 | 柳州市柳南区安顺养殖协会 | 一种驼牛血抗菌肽的制备方法 |
CN107488224A (zh) * | 2017-09-15 | 2017-12-19 | 吴光 | 一种用动物组织提取蛋白的方法 |
CN112521444A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-03-19 | 广东鑫皇冠新材料有限公司 | 一种抗菌肽的提取方法 |
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