CN105154500B - 一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，该培养基配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6；本发明还包括基于上述培养基利用毕赤酵母产人胰岛素原的发酵方法，利用本方法，人胰岛素原表达量可提高43％，并且大幅减少发酵时间24～42小时，获得了比常规方法更高的产率。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体而言，本发明涉及一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基以及利用该培养基生产人胰岛素原的方法。
背景技术
胰岛素是最为有效的糖尿病治疗药物，生产人胰岛素的方法分为化学合成法和基因重组法，基因重组法先生产人胰岛素原，再进行后续工艺转变为人胰岛素或人胰岛素类似物。基因重组法主要使用两种方法生产人胰岛素原，一种方法使用原核生物大肠杆菌，另一种方法使用真核生物酿酒酵母。
毕赤酵母既具有类似原核生物大肠杆菌的繁殖快、易培养、便于遗传操作的特性，又具有真核生物酿酒酵母的蛋白可翻译后修饰、蛋白正确折叠的特性，应用十分广泛，毕赤酵母已成为多种蛋白的理想表达体系(Lin Cereghino GP,Lin Cereghino J,Ilgen C,Cregg J M(2002)Production of recombinant proteins in fermenter cultures oftheyeast Pichia pastoris.Curr Opin Biotechnol 13:329–332)。
在毕赤酵母表达外源蛋白需要利用培养基中的营养成分，培养基除了必须含有菌体生长代谢所必需的物质和元素外，还必须含有构成外源蛋白所需要的物质和元素，如，碳源、氮源、无机盐等；碳源对酵母生长代谢的作用主要是提供细胞及产物的碳骨架，提供细胞生命活动所需的能量，碳源可以分为无机碳源物质和有机碳源物质，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素等糖类，还包括有机酸，氨基酸，醇类，醛，酚等含碳化合物；毕赤酵母常利用的碳源一般为甘油、葡萄糖、甲醇等。氮源为酵母细胞提供构成蛋白质、核酸及其他氮元素化合物的材料，氮源可以分为无机氮源和有机氮源，无机氮源包括铵盐、硝酸盐等，有机氮源包括牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蝉蛹粉、豆(饼)粉、花生(饼)粉等。
毕赤酵母发酵产人胰岛素原可以采用多种培养基，一般为BSM培养基及BSM基础上改进的培养基。BSM(基础盐)培养基是Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵常规使用的培养基，其配方为：85％磷酸26.7ml/L，二水硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L；董鹏等使用BSM培养基进行发酵罐培养产人胰岛素原，诱导温度30℃，诱导pH为5.5～6.0，诱导96h，表达量256mg/L(董鹏等，表达胰岛素的毕赤酵母生长动力学及诱导策略。北京化工大学学报，2006,33(3)：37～41)；País-Chanfrau等在BSM培养基中分别添加酪蛋白水解物、酵母提取物、蛋白胨及硫酸铵用于表达胰岛素原，诱导温度22℃，诱导pH 6.3，诱导120h后表达量达到0.3g/L(País-Chanfrau JM,et al.Improving the expression ofmini-proinsulin inPichiapastoris.BiotechnolLett.,2004,26(16):1269-1272)；Gurramkonda等将BSM培养基中的二水硫酸钙0.93g/L换为二水合氯化钙0.28g/L，将磷酸和氢氧化钾换为磷酸二氢钾9.4g/L，甘油含量增为95.2g/L，并添加了15.7g/L的硫酸铵，利用此培养基进行人胰岛素前体的发酵，诱导温度30℃，诱导pH为5.5，诱导表达120h，表达量达到3-4g/L(Gurramkonda etal.Application of simple fed-batch technique to high-level secretoryproduction ofinsulin precursor using Pichia pastoris with subsequentpurification and conversion to human insulin.Microbial Cell Factories 2010,9:31～41)。
上述培养基或者表达量不高，或者诱导培养时间过长，导致生产效率不高，并且，有研究表明BSM培养基盐浓度高，使得培养基渗透压过高，导致菌体死亡率增加，不仅影响表达量的提高，释放出脂类物质还增加了下游纯化工艺的难度(Brady C P,Shimp RL,MilesAR,et al.High-level production and purification of P30P2MSP1(19),animportant vaccine antigen for malaria,expressed in the methylotropic yeastPichia pastoris.Prot Expres Purif.2001,23,468–475)，因此，有必要对培养基进行改进，提供一种既能缩短培养时间，又能得到高表达量的人胰岛素原的培养基，以提高工业化生产的效率。
发明内容
本发明为解决利用毕赤酵母发酵常规使用的BSM培养基发酵产人胰岛素原表达量不高、诱导培养时间过长等导致生产效率不高的问题，提供了一种适于毕赤酵母发酵产人胰岛素原的培养基，并在此基础上，本发明还提供了一种进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法。
本发明的目的通过以下方案实现：
一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，该培养基配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6。
优选地，培养基配方为：蛋白胨10g/L，黄豆粉5g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵8g/L，氢氧化钾2g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
优选地，培养基配方为：蛋白胨20g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁7g/L，硫酸铵6g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
所述蛋白胨为微生物来源或者酵母蛋白胨。本发明按照Invitrogen lifetechnologies公司《Pichia fermentation process guidelines》中的调控方法进行毕赤酵母的发酵培养。所述的毕赤酵母指以巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115作为表达宿主的基因重组菌，所述的发酵为在发酵罐中利用毕赤酵母进行甲醇诱导表达外源蛋白人胰岛素原。
一种基于本发明所述培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，具体包含以下步骤：
(1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100ml YPD培养基的500ml摇瓶，30℃，250rpm摇床培养19～20h，作为种子液；
(2)分批培养发酵：1L种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为30℃，pH 5.0，转速300rpm，通气量0.5m3/h。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧20～30％，培养19～21h；
(3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，以10ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的50％甘油5～6h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；
(4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，控制温度为25～28℃，pH为3.0～5.0，以3.6ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇5～6h后，增大甲醇补料速率为10ml/h/L，直至发酵结束。诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；
(5)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每3～12小时取发酵液样品一次，3000～12000rpm离心5～10min，测定上清液中人胰岛素原表达量，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。
步骤(1)的YPD培养基由以下方法制备：酵母粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，121℃灭菌20min。
步骤(4)的温度优选为25℃。
步骤(4)的pH优选为3.25。
本发明相对于现有技术具有以下优点和有益效果：
本发明提供的培养基，用于毕赤酵母发酵产人胰岛素原，相对于毕赤酵母发酵常规使用的BSM培养基及现有技术提供的其他培养基，能够更有效地进行毕赤酵母发酵生产人胰岛素原。基于本发明提供的培养基，使用本发明提供的毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，人胰岛素原表达量大大提高，可达43％，并大幅减少培养时间24～42h，从而提高了生产效率。
附图说明
图1为实施例1对照实验中人胰岛素原表达量随诱导时间变化的曲线图。
图2为实施例2中人胰岛素原表达量随诱导时间变化的曲线图。
图3为实施例8中人胰岛素原表达量随诱导时间变化的曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步阐释本发明，实施例仅用于说明本发明而不限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：对照实验
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为BSM培养基，配方为：85％磷酸26.7ml/L，二水硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，用氢氧化钾和磷酸调节pH为5.5。
使用Invitrogen life technologies公司《Pichia fermentation processguidelines》中提供的毕赤酵母发酵的常规技术，按照如下步骤进行毕赤酵母发酵生产人胰岛素原：
(1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100ml YPD培养基的500ml摇瓶，30℃，250rpm摇瓶培养20h，作为种子液。
(2)分批培养发酵：1L种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为30℃，pH 5.0，转速300rpm，通气量0.5m3/h。随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧20～30％，培养20h。
(3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，以10ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的50％甘油5～6h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％。
(4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，诱导温度降为25℃，诱导pH为3.25，以3.6ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇6h后，增大甲醇补料速率为10ml/h/L，直至发酵结束。诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％。
(5)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每12小时取发酵液样品一次，待诱导表达84h后每3～6h取样一次，12000rpm离心5min，测定上清液中人胰岛素原表达量，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵。
检测结果表明，诱导96h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值2571mg/L(图1)。
实施例2
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨1g/L，黄豆粉1g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.3g/L，七水硫酸镁7.0g/L，硫酸铵6g/L，氢氧化钾1.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.0，步骤(5)中取样时间为诱导表达48h后每3～6h取样一次，其他同实施例1。检测结果表明，诱导57h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值2682mg/L(图2)，和对照实验相比，培养时间减少39h，表达量提高4.3％。
实施例3
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨10g/L，黄豆粉1g/L，85％磷酸13.3ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁8.0g/L，硫酸铵6.0g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为28℃，诱导pH为5.0，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导54h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值2580mg/L，和对照实验相比，培养时间减少42h，表达量提高0.3％。
实施例4
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨10g/L，黄豆粉1g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.3g/L，七水硫酸镁7.0g/L，硫酸铵6.0g/L，氢氧化钾1.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为26℃，诱导pH为3.25，步骤(5)同实施例1。检测结果表明，诱导60h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3278mg/L，和对照实验相比，培养时间减少36h，表达量提高27.4％。
实施例5
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨1g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁7.0g/L，硫酸铵10.0g/L，氢氧化钾1.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为27℃，诱导pH为5.0，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导55h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值2808mg/L，和对照实验相比，培养时间减少41h，表达量提高9.2％。
实施例6
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨1g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.3g/L，七水硫酸镁8.0g/L，硫酸铵10.0g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.25，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导57h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3137mg/L，和对照实验相比，培养时间减少39h，表达量提高22％。
实施例7
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨10g/L，黄豆粉5g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵10.0g/L，氢氧化钾2.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为26℃，诱导pH为4，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导60h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3390mg/L，和对照实验相比，培养时间减少36h，表达量提高31.8％。
实施例8
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨10g/L，黄豆粉5g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵8.0g/L，氢氧化钾2.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.25，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导63h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3678mg/L(图3)，和对照实验相比，培养时间减少33h，表达量提高43％。
实施例9
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨10g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵6.0g/L，氢氧化钾2.0g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.5，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导66h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3435mg/L，和对照实验相比，培养时间减少30h，表达量提高33％。
实施例10
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨20g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁7.0g/L，硫酸铵6.0g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.25，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导72h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3544mg/L，和对照实验相比，培养时间减少24h，表达量提高37％。
实施例11
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨20g/L，黄豆粉1g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁7.0g/L，硫酸铵6.0g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.25，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导69h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3253mg/L，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量提高26.5％。
实施例12
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨20g/L，黄豆粉1g/L，85％磷酸13.3ml/L，碳酸钙0.3g/L，七水硫酸镁8.0g/L，硫酸铵10.0g/L，氢氧化钾1.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为25℃，诱导pH为3.25，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导69h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3499mg/L，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量提高36％。
实施例13
本实施例的产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基为：蛋白胨20g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁8.0g/L，硫酸铵10.0g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
毕赤酵母发酵生产人胰岛素原的步骤(1)～(3)同实施例1，步骤(4)中诱导温度降为28℃，诱导pH为5.0，步骤(5)同实施例2。检测结果表明，诱导69h时，发酵上清液中人胰岛素原的表达量达到最大值3054mg/L，和对照实验相比，培养时间减少27h，表达量提高18.7％。
表1为各实施例及对照实验中的培养基配方及表达量结果。表中的结果表明：本发明中提供的培养基，相对于常规使用的BSM培养基，通过改变无机盐组分或浓度，降低培养基中的总盐含量，并添加毕赤酵母发酵所需的氮源，既缩短了培养时间，又能得到高表达量的人胰岛素原，提高了生产的效率。
表一各实施例及对照实验中的培养基配方及表达量结果对比
Claims (6)
1.一种利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100ml YPD培养基的500ml摇瓶，30℃，250rpm摇床培养19～20h，作为种子液；
(2)分批培养发酵：1L种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为30℃，pH 5.0，转速300rpm，通气量0.5m3/h，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧20～30％，培养19～21h；
(3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，以10ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的50％甘油5～6h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；
(4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，诱导温度降为25～28℃，诱导pH调为3.25，以3.6ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇5～6h后，增大甲醇补料速率为10ml/h/L，直至发酵结束，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；
(5)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每3～12小时取发酵液样品一次，3000～12000rpm离心5～10min，测定上清液中人胰岛素原表达量，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵；
所述发酵培养基的配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6。
2.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：蛋白胨10g/L，黄豆粉5g/L，85％磷酸13ml/L，碳酸钙0.33g/L，七水硫酸镁7.4g/L，硫酸铵8g/L，氢氧化钾2g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
3.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：蛋白胨20g/L，黄豆粉10g/L，85％磷酸14ml/L，碳酸钙0.4g/L，七水硫酸镁7g/L，硫酸铵6g/L，氢氧化钾2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5.5。
4.根据权利要求1-3任一项所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，所述蛋白胨为微生物蛋白胨或酵母蛋白胨。
5.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，步骤(4)中诱导温度为25℃。
6.根据权利要求1所述的利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，毕赤酵母以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为表达宿主的基因重组菌，所述的发酵为在发酵罐中利用毕赤酵母进行甲醇诱导表达外源蛋白人胰岛素原。
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| 《表达胰岛素的毕赤酵母生长动力学及诱导策略》;董鹏等;《北京化工大学学报》;20060331;第33卷(第3期);全文 |
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