CN105148270A - 单链抗体及其相关成套抗肿瘤试剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单链抗体及其相关成套抗肿瘤试剂与应用。本发明所提供的成套抗肿瘤试剂，包括单链抗体和效应细胞；单链抗体由下述甲、乙、丙和丁的蛋白质连接而成：甲、序列表中SEQ？ID？No.1的第37-161位氨基酸所示的蛋白质；乙、序列表中SEQ？ID？No.1的第177-289位氨基酸所示的蛋白质；丙、序列表中SEQ？ID？No.1的第305-424位氨基酸所示的蛋白质；丁、序列表中SEQ？ID？No.1的第440-546位氨基酸所示的蛋白质；所述效应细胞为T淋巴细胞或PMBC。实验证明，本发明的成套抗肿瘤试剂和单链抗体SCAB能诱导的T淋巴细胞来***。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中单链抗体及其相关成套抗肿瘤试剂与应用。
背景技术
恶性肿瘤的细胞免疫治疗倾向于使自体效应细胞能够重新靶向肿瘤细胞，由于T淋巴细胞在抗原特异性细胞免疫反应中的关键作用及它们具有记忆能力，从而使其成为研究的热点。人一旦患上恶性疾病，就说明其自身免疫***已经不能够针对肿瘤细胞进行及时而有效的杀灭，但是研究表明，机体的免疫***也不是毫无作为，例如T淋巴细胞在许多肿瘤组织中有浸润这种现象就是一个明证，但是遗憾的是它们常常不能对恶性瘤细胞发动攻击，虽然对恶性肿瘤缺乏免疫监控的原因目前仍不甚清楚，但是一般认为是由于大多数T淋巴细胞识别的抗原是没有变异的分化抗原，一般来讲，肿瘤细胞本身为免疫反应提供的靶位很少。综合目前的研究成果，肿瘤的出现可以从肿瘤与免疫***之间相互作用的分析中得出以下几种原因，简单地说，有瘤细胞积极的免疫逃逸机制，如肿瘤细胞的免疫原性弱及抗原调变，肿瘤细胞表面缺乏MHCI类分子，使CTL不能识别肿瘤细胞表面的抗原，以致瘤细胞得以逃脱宿主的免疫攻击；持续的但是无效的免疫反应，如肿瘤细胞表面的抗原被封闭，特异性抗体被肿瘤的游离抗原中和，肿瘤抗原变异；恶性瘤细胞的免疫忽略，如肿瘤抗原作用于处于不同阶段的特异性淋巴细胞，可以使幼稚的淋巴细胞接触肿瘤抗原后诱发免疫耐受。由于以上这些复杂的原因导致了肿瘤的出现，所以一个有效的抗癌免疫治疗必须克服上述障碍以便有效地激活T淋巴细胞去靶向攻击瘤细胞。到目前为止，大部分免疫治疗方法都是设计将效应细胞如CTLs直接靶向肿瘤细胞。然而诱导有效的抗肿瘤反应，抗体和效应细胞必须从循环中渗出浸润到肿瘤部位才能杀伤肿瘤细胞，但因为肿瘤内的高间质压，使得浸润到肿瘤部位的抗体分子和效应细胞非常少。肿瘤血管是恶性肿瘤生长及转移的基础，以肿瘤血管为治疗靶点，抑制肿瘤血管的形成或破坏已经形成的肿瘤血管，可以阻断肿瘤细胞的营养来源和迁移路径，因此抗肿瘤血管治疗成为肿瘤治疗的重要策略之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何***。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了成套抗肿瘤试剂。
本发明所提供的成套抗肿瘤试剂，为下述M或N：
M、包括单链抗体和效应细胞的成套抗肿瘤试剂；
所述单链抗体其名称为SCAB，由下述甲、乙、丙和丁的蛋白质连接而成：
甲、序列表中SEQIDNo.1的第37-161位氨基酸所示的蛋白质；
乙、序列表中SEQIDNo.1的第177-289位氨基酸所示的蛋白质；
丙、序列表中SEQIDNo.1的第305-424位氨基酸所示的蛋白质；
丁、序列表中SEQIDNo.1的第440-546位氨基酸所示的蛋白质；
所述效应细胞为T淋巴细胞或PMBC；
N、包括与所述单链抗体相关的生物材料和所述效应细胞的成套抗肿瘤试剂；
与所述SCAB相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：
B1)编码所述SCAB的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
为了使所述SCAB便于纯化，可在序列表中SEQIDNo.1的第37-546位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
所述SCAB可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述SCAB的编码基因可通过将SEQIDNo.2或SEQIDNo.2的第109-1641位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述成套抗肿瘤试剂中，B2)所述的含有编码所述SCAB的核酸分子的表达盒(SCAB基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SCAB的DNA，该DNA不但可包括启动SCAB基因转录的启动子，还可包括终止SCAB基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述SCAB基因表达盒的重组载体。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pET28a(+)中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述SCAB的编码基因(核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第109-1641位核苷酸)导入pET28a(+)中得到的重组载体pET28a-SCAB，重组载体pET28a-SCAB表达SEQIDNo.1所示的SCAB。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述转基因动物细胞系、所述转基因动物组织和所述转基因动物器官均不包括繁殖材料；所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入到大肠杆菌BL21(DE3)中得到的重组微生物。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述SCAB的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述SCAB的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述SCAB且具有SCAB活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.2的第109-1638位核苷酸序列或SEQIDNo.2的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述SCAB为下述a)或b)：
a)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的第37-546位氨基酸的抗体；
b)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的抗体。
其中，SEQIDNo.1的第5-10位氨基酸为His-tag的氨基酸序列；SEQIDNo.1的第37-161位氨基酸为所述甲的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第177-289位氨基酸为所述乙的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第305-424位氨基酸为所述丙的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第440-546位氨基酸为所述丁的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第162-176位氨基酸、第290-304位氨基酸和第425-439位氨基酸均为连接肽的氨基酸序列。
上述成套抗肿瘤试剂中，编码所述甲的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第109-483位核苷酸；
编码所述乙的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第529-867位核苷酸；
编码所述丙的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第913-1272位氨基酸；
编码所述丁的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第1318-1638位核苷酸。
上述成套抗肿瘤试剂中，B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)或4)：
1)核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的cDNA分子或DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的第109-1638位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SCAB的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SCAB的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQIDNo.2由1647个核苷酸组成，SEQIDNo.2的第1-1641位核苷酸编码SEQIDNo.1所示的单链抗体SCAB。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.2的第109-1638位核苷酸序列或SEQIDNo.2的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述T淋巴细胞可为含有T淋巴细胞的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PMBC)。
所述外周血单个核细胞具体可按Ficoll分层液法制备。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述成套抗肿瘤试剂还包括所述SCAB识别的蛋白质。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述SCAB识别的蛋白质为下述x)或y)：
x)序列表中SEQIDNo.3的第1-559位氨基酸所示的蛋白质；
y)包含序列表中SEQIDNo.4的第13-126位氨基酸的蛋白质。
上述成套抗肿瘤试剂中，所述成套抗肿瘤试剂可只由所述SCAB和所述效应细胞组成，其名称为成套抗肿瘤试剂1；所述成套抗肿瘤试剂也可由所述SCAB、所述效应细胞和所述SCAB识别的蛋白质组成，其名称为成套抗肿瘤试剂2。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
h)所述SCAB；
i)所述生物材料；
j)含有所述SCAB的融合抗体；
k)所述SCAB诱导的T淋巴细胞；
l)所述生物材料诱导的T淋巴细胞；
m)所述融合抗体诱导的T淋巴细胞；
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
C1、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述成套抗肿瘤试剂；
C2、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述SCAB；
C3、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述生物材料；
C4、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述融合抗体；
C5、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述成套抗肿瘤试剂诱导的T淋巴细胞；
C6、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述SCAB诱导的T淋巴细胞；
C7、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述生物材料诱导的T淋巴细胞；
C8、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为所述融合抗体诱导的T淋巴细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
L1)所述成套抗肿瘤试剂在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L2)所述SCAB在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L3)所述生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L4)所述融合抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L5)所述成套抗肿瘤试剂诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L6)所述SCAB诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L7)所述生物材料诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L8)所述融合抗体诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。
所述SCAB的制备方法，也属于本发明的保护范围。
本发明中，所述肿瘤可为实体肿瘤。所述实体肿瘤具体可为恶性肿瘤。所述恶性肿瘤可为肺癌、非小细胞肺癌、***、***癌、胰腺癌、肠癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、乳腺癌或子宫内膜癌，具体可为人肺癌细胞系A549引发的肿瘤。所述肿瘤细胞可为引发所述肿瘤的细胞，如A549。
实验证明，本发明的单链抗体SCAB能刺激T淋巴细胞增殖，也能高效地诱导人T淋巴细胞杀伤表达CD105的293T-HE细胞，并且该杀伤作用随效靶比的增加而增强。
实验证明，本发明的单链抗体SCAB对肿瘤的生长具有抑制作用，且治疗作用随SCAB剂量的增加而增强：在治疗第30天，100μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠未见肿瘤生长；10μg/100μl的SCAB+PBMC和1μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积分别为BscAbxCD3+PBMC治疗小鼠的肿瘤体积的0.0281倍和0.4687倍。
本发明的成套抗肿瘤试剂1对肿瘤的生长具有抑制作用，且治疗作用随SCAB剂量的增加而增强：在治疗第30天，100μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠未见肿瘤生长；10μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积的分别为SCAB、PBMC和PBS治疗小鼠的肿瘤体积的0.0277倍、0.0279倍和0.0273倍；1μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积的分别为SCAB、PBMC和PBS治疗小鼠的肿瘤体积的0.4609倍、0.4654倍和0.4551倍。
本发明的成套抗肿瘤试剂2对肿瘤也具有治疗作用：在治疗第30天，SCAB-CD105+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积分别为SCAB、PBMC和PBS治疗小鼠的肿瘤体积的0.4559倍、0.4604倍和0.4502倍。
实验证明，本发明的成套抗肿瘤试剂1和单链抗体SCAB能诱导的T淋巴细胞来***，治疗具有靶向性且治疗效果随SCAB浓度的增加而增强。
附图说明
图1为SCAB的纯化图谱。
图2为纯化后的SCAB的SDS-PAGE电泳图。
图3为纯化后的SCAB的WesternBlot检测结果。其中，泳道Ladder为蛋白分子量标准。
图4为SCAB与293T和293T-HE的结合流式分析图。其中SCAB浓度单位为μg/mL。
图5为SCAB与CD4、CD8结合流式分析图。
图6为SCAB特异性刺激人T淋巴细胞增殖实验结果。
图7为不同浓度SCAB和不同效靶比诱导人T淋巴细胞细胞毒实验结果。其中，A为不同浓度SCAB诱导人T细胞细胞毒实验结果；B为不同效靶比诱导人T淋巴细胞细胞毒实验结果图。
图8为SCAB对肿瘤的治疗作用。其中，A为不同浓度的SCAB***后的肿瘤体积；B为不同物质***后的肿瘤体积。
图9为HE染色法检测SCAB***后体内重要器官的结果图(400×)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pET28a(+)为南京金斯瑞生物科技有限公司产品。
下述实施例中的大肠杆菌BL21(DE3)为南京金斯瑞生物科技有限公司产品。
下述实施例中的6M、4M、2M、1M、50mM、0M复性溶液分别为向去离子水中加入尿素和A液得到的尿素浓度分别为6M、4M、2M、1M、50mM和0M，A液的体积百分比浓度均为10％的无菌溶液，6M、4M、2M、1M、50mM、0M复性溶液的pH均为8.0。A液由溶质和溶剂组成，pH为8.0，其中，溶剂为去离子水，溶质及其浓度分别为50mMTris-Cl、200mMNaCl、1mMEDTA、5％(体积百分比浓度)甘油、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽和1mmol/L还原型谷胱甘肽。
下述实施例中的293T细胞不表达人CD105，293T细胞为ATCC公司产品，产品目录号为CRL-3216TM。
下述实施例中的293T-HE为表达人CD105的稳转株，293T-HE为南京金斯瑞生物科技有限公司产品。
下述实施例中的CFSE为eBioscience公司产品，产品目录号为65-0850。
下述实施例中的OKT3是美国Ortho公司生产的OKT(OrthoKungTcellOKT)系列中的一种抗人T淋巴细胞分化抗原CD3的单克隆抗体，货号为NDC:59676-101。
下述实施例中的BscAbxCD3为对照的双特异性单链抗体，BscAbxCD3为南京金斯瑞生物科技有限公司产品，产品目录号为7107614-1。
下述实施例中的人肺癌细胞系A549为ATCC公司产品，产品目录号为v-054279。
下述实施例中的NOD/SCID小鼠为北京联通利华信息技术有限公司产品，NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrlVr，产品目录号为406。
下述实施例中的CD105为重组人CD105胞外段，其氨基酸序列为序列表中SEQIDNo.3的第1-559位，CD105为RD公司产品，产品目录号为1097-EN。
下述实施例中的Anti-6XHis-PerCP抗体为abcam公司产品，货号为ab17496，Anti-6XHis-PerCP标记有荧光物质PerCP。
实施例1、单链抗体和成套抗肿瘤试剂的制备
本发明所提供的成套抗肿瘤试剂，为成套抗肿瘤试剂1和成套抗肿瘤试剂2。
成套抗肿瘤试剂1由单链抗体和PMBC组成；单链抗体名称为SCAB，由下述甲、乙、丙和丁的蛋白质连接而成：
甲、序列表中SEQIDNo.1的第37-161位氨基酸所示的蛋白质；
乙、序列表中SEQIDNo.1的第177-289位氨基酸所示的蛋白质；
丙、序列表中SEQIDNo.1的第305-424位氨基酸所示的蛋白质；
丁、序列表中SEQIDNo.1的第440-546位氨基酸所示的蛋白质；
SCAB的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示，其编码序列为SEQIDNo.2的第1-1641位核苷酸。
成套抗肿瘤试剂2由单链抗体SCAB、PMBC和CD105组成，CD105的氨基酸序列为序列表中SEQIDNo.3的第1-559位。
1、表达SCAB的重组菌的制备
将pET28a(+)的EcoRI和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQIDNo.2的第109-1641位核苷酸所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28a-SCAB，pET28a-SCAB和pET28a(+)的差别仅在于将pET28a(+)的EcoRI和XhoI识别序列间的DNA片段替换为SEQIDNo.2的第109-1641位核苷酸所示的DNA分子。重组载体pET28a-SCAB表达SEQIDNo.1所示的单链抗体SCAB。将pET28a-SCAB导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-pET28a-SCAB。
其中，SEQIDNo.2的第1-1641位核苷酸编码SEQIDNo.1所示的单链抗体SCAB。SEQIDNo.1的第5-10位氨基酸为His-tag的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第37-161位氨基酸为甲的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第177-289位氨基酸为乙的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第305-424位氨基酸为丙的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第440-546位氨基酸为丁的氨基酸序列，SEQIDNo.1的第162-176位氨基酸、第290-304位氨基酸和第425-439位氨基酸均为连接肽的氨基酸序列。
2、SCAB的表达与纯化
(1)将步骤1的BL21-pET28a-SCAB在固体培养基(该固体培养基为向LB培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为50mg/L的固体培养基)中于37℃下过夜培养；
(2)挑取步骤(1)得到的阳性单克隆接种至50ml液体培养基(该液体培养基为向LB培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为50mg/L的液体培养基)中于37℃摇床中200rpm/min下过夜培养；
(3)取步骤(2)得到的过夜培养的培养液10ml接种至1L液体培养基(该液体培养基为向LB培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为50mg/L的液体培养基)中于37℃摇床中200rpm/min下培养3h，至OD600为0.6；
(4)向步骤(3)得到的培养基中加IPTG，使其浓度为0.2mM，于37℃摇床中200rpm/min诱导培养4h；
(5)将步骤(4)得到的菌液于7000rpm/min、4℃下离心5min，弃上清，收集菌体；
(6)用10mM的Tris-HCl重悬步骤(5)得到的菌体，超声20min，超声条件为：200W、200次，每次4s，间隔6s；
(7)将步骤(6)超声后的液体于12000rpm/min、4℃下离心10min，弃上清，沉淀用10mM的Tris-HCl洗涤5次；
(8)向步骤(7)Tris-HCl洗涤5次后的沉淀中加入7500mlLE裂解液(LE裂解液由水和溶质组成，溶质及其浓度分别为100mMNaH2PO4、10mMTris-Cl和8M尿素)，室温放置45min，中间间隔振荡；
(9)将步骤(8)得到的液体于13000rpm/min、4℃离心30min，弃沉淀，用0.45uM滤膜过滤上清；
(10)将步骤(9)得到的过滤后的蛋白用pure蛋白质层析纯化***(GE，通用电气医疗集团)通过镍柱纯化，得到纯化后的蛋白溶液，纯化图谱见图1，纯化后的蛋白的SDS-PAGE电泳图见图2，结果表明，该实验得到的SCAB纯度高，只有单一条带；
(11)透析复性：将步骤(10)得到的纯化后的蛋白溶液装入透析袋，用透析夹将两端封口，保证每个透析袋留有20％以上容量。将透析袋依次放入盛有6M、4M、2M、1M、50mM、0M复性溶液的烧杯中，在4℃下磁力搅拌器上透析3小时，得到透析复性后的蛋白溶液；
(12)对透析后的蛋白溶液中的蛋白质进行WesternBlot鉴定，鉴定过程中用到的一抗为Anti-6×His抗体(abcam公司产品，货号ab1187)，结果显示，透析后的蛋白溶液中含有目的蛋白SCAB(图3)，即重组菌BL21-pET28a-SCAB表达目的蛋白SCAB。
3、SCAB与抗原结合活性的鉴定
3.1SCAB与CD105的结合活性检测
将步骤2得到的含有SCAB单链抗体的透析后的蛋白溶液与1×106个293T细胞或表达人CD105的稳转株293T-HE细胞4℃共同孵育30min，1000r/min4℃离心5min，PBS洗3次。加入20μlAnti-6XHis-PerCP抗体，4℃避光孵育30min，1000r/min4℃离心5min，PBS洗3次，上流式细胞仪检测，结果显示SCAB单链抗体具有结合CD105抗原的能力(图4中A和B)。
3.2SCAB与CD3的结合活性检测
外周血PBMC中的T细胞都表达CD3，而CD3+的T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两类，采用CD4和CD8抗体分别验证SCAB与CD4+T细胞和CD8+T细胞的结合活性，具体步骤如下：
将步骤2得到的含有SCAB单链抗体的透析后的蛋白溶液与外周血PBMC4℃共同孵育30min，让其与T细胞上的CD3抗原结合，1000r/min4℃离心5min，PBS洗3次。加入20μlAnti-6XHis-PerCP抗体、5μlAntihumanCD4-FITC(eBiosceince公司产品，货号为11-0048)，4℃避光孵育30min，1000r/min4℃离心5min，PBS洗3次，上流式检测SCAB与CD4+T细胞的结合活性。
按照上述方法，将AntihumanCD4-FITC替换为AntihumanCD8-PE(eBiosceince公司产品，货号15-0088)，其他步骤均不变，上流式检测SCAB与CD8+T细胞的结合活性。
结果显示(图5中A和B)，SCAB与CD4+T细胞及CD8+T细胞上的CD3抗原都能结合，具有特异结合CD3抗原的特性。
实施例2、SCAB诱导人T淋巴细胞的增殖
实验原理：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)是一种用于标记活体细胞的绿色荧光染料。CFSE与胞内蛋白共价结合，在细胞增殖时，随着细胞的有丝***被平均分配至两个子代细胞，被488nm-500nm激发后释放出绿色荧光，可通过流式细胞仪检测出。在一个对数生长期的细胞群中，各子代细胞以荧光强度的2倍递减为特征。利用这一原理，用CFSE检测细胞增殖情况，实验重复三次，每次重复试验的具体步骤如下：
1、取正常健康人(排除白血病等血液学疾病及乙肝、艾滋、梅毒等传染性疾病))全血，用Ficoll分离液法分离出全血中PBMC，该PBMC包含T淋巴细胞；
2、向步骤1得到的PBMC中加入浓度为5μmoL/L的CFSE溶液1mL，充分混匀，在37℃孵育8min，间隔2min振摇一次；
3、加入1mL胎牛血清终止反应1min。用7mL完全培养基，1200rpm下离心6min，重复该洗涤过程三次，得到细胞悬浮液；
4、细胞计数，用完全培养基将步骤3得到的细胞悬浮液中细胞浓度调整至5×106细胞/mL，加至96孔板中，每孔0.2ml细胞悬浮液(该0.2ml细胞悬浮液含有1×106个PBMC)，而后向每孔中分别加入下述五组中的物质刺激淋巴细胞，每孔只含有一组的物质，每组三个复孔，同时设置母代细胞孔(细胞用4％多聚甲醛固定后4℃避光保存)：
组①：100μl液体A，液体A为向92μlPBS中加入8μl实施例1步骤2的透析复性后的蛋白溶液得到的液体，液体A中SCAB的浓度为10μg/ml；
组②：100μl液体B，液体B为向91μlPBS中加入8μl实施例1步骤2的透析复性后的蛋白溶液和1μlBSA溶液(BSA溶液为向PBS中加入BSA得到的溶液)得到的液体，液体B中SCAB和BSA的浓度分别为10μg/ml和10μg/ml；
组③：100μl液体C，液体C为向91μlPBS中加入8μl实施例1步骤2的透析复性后的蛋白溶液和1μlCD105溶液(CD105溶液为向PBS中加入CD105得到的溶液)得到的液体，液体C中SCAB和CD105的浓度分别为10μg/ml和10μg/ml；
组④：100μl液体D，液体D为向91μlPBS中加入8μlBscAbxCD3溶液(BscAbxCD3溶液为向PBS中加入BscAbxCD3得到的溶液)和1μlCD105溶液(CD105溶液为向PBS中加入CD105得到的溶液)得到的液体，液体D中BscAbxCD3和CD105的浓度分别为10μg/ml和10μg/ml；
组⑤：100μl液体E，液体E为向99μlPBS中加入1μlOKT3溶液(OKT3溶液为向PBS中加入OKT3得到的溶液)得到的液体，液体E中OKT3的浓度为10μg/ml；
5、将步骤4得到的加入各组物质及PBMC的96孔板于37℃，5％CO2培养箱中培养3天后收集各组细胞，用流式细胞仪分析各组细胞增殖情况，由ModFitLT软件分析(BeckmanCoulter,USA)T淋巴细胞增殖指数。
组①T淋巴细胞的增殖指数为1.09；组②T淋巴细胞的增殖指数为1.27；组③T淋巴细胞的增殖指数为6.99；组④T淋巴细胞的增殖指数为1.25；组⑤T淋巴细胞的增殖指数为8.71。结果表明，SCAB单链抗体只有与CD105结合才能刺激T淋巴细胞增殖(图6)，说明SCAB可以激活T淋巴细胞并且该过程具有抗原特异性。
实施例3、SCAB诱导的人T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
实验重复三次，每次重复试验的具体步骤如下：
1、将293T-HE细胞用溶液甲(溶液甲为PBS中加入BSA得到的BSA的质量百分体积为0.1％的液体)洗一次，1200rpm离心6min，弃上清，用1ml溶液甲重悬细胞后，加入溶液乙(溶液乙为向500μl溶液甲中加入1μlPKH-26得到的液体)混匀，室温孵育4分钟，得到细胞悬浮液；
2、向步骤1得到的细胞悬浮液中加入1ml血清，混匀后静置1min，用5-7ml完全培养基洗3次，1200rpm离心6min，洗第二次时，完全培养基加至细胞中后37℃下水浴5min，1200rpm离心6min；而后用5-10ml溶液甲重悬细胞，得到靶细胞悬浮液，对靶细胞悬浮液进行计数；
3、将实施例2步骤1得到的PBMC用溶液甲重悬，得到效应细胞悬浮液，对效应细胞悬浮液进行计数；
4、将步骤2的含有5×105个靶细胞的靶细胞悬浮液和步骤3的含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液(即效靶比为20:1)铺板，加入含有SCAB的实施例1的透析后的蛋白溶液或0M复性溶液，SCAB共设置7个浓度，分别为0μg/ml、10-3μg/ml、10-2μg/ml、10-1μg/ml、100μg/ml、101μg/ml和102μg/ml，37℃下孵育5小时，收集细胞，此步骤须避光；
5、用PBS洗上述细胞一次，1200rpm离心6min，弃上清，每管细胞用50μl孵育液(Roche公司产品，货号为11988549001)重悬，而后向每管加入PI1μl、Annexin-Ⅴ2μl染色，室温避光作用15min；而后向每管加入500μlPBS上流式细胞仪检测PI阳性的细胞数，观察不同浓度的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为20：1时对293T-HE的杀伤作用(图7中A)。
按照上述方法，将293T-HE替换为293T，其他步骤均不变，得到不同浓度的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为20：1时对293T的杀伤作用(图7中A)。
按照上述方法，将步骤3的含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液替换为溶液甲(即效靶比为0：1)，并将SCAB浓度设为0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml，其他步骤均不变，得到0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为0：1时对293T-HE的杀伤作用(图7中B)。
按照上述方法，将步骤3的含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液替换为含有1.25×106个效应细胞的效应细胞悬浮液(即效靶比为2.5：1)，并将SCAB浓度设为0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml，其他步骤均不变，得到0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为2.5：1时对293T-HE的杀伤作用(图7中B)。
按照上述方法，将步骤3的含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液替换为含有2.5×106个效应细胞的效应细胞悬浮液(即效靶比为5：1)，并将SCAB浓度设为0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml，其他步骤均不变，得到0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为5：1时对293T-HE的杀伤作用(图7中B)。
按照上述方法，将步骤3的含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液替换为含有5×106个效应细胞的效应细胞悬浮液(即效靶比为10：1)，并将SCAB浓度设为0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml，其他步骤均不变，得到0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为10：1时对293T-HE的杀伤作用(图7中B)。
按照上述方法，将步骤3的含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液替换为含有1×107个效应细胞的效应细胞悬浮液(即效靶比为20：1)，并将SCAB浓度设为0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml，其他步骤均不变，得到0μg/ml、0.1μg/ml和10μg/ml的SCAB诱导的人T淋巴细胞在效靶比为20：1时对293T-HE的杀伤作用(图7中B)。
实验结果表明SCAB能高效地诱导人T淋巴细胞杀伤表达CD105的293T-HE细胞，并且该杀伤作用随效靶比的增加而增强。
实施例4、SCAB对肿瘤的治疗作用
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下(下述步骤1和步骤2同步进行)：
1、SCAB和PBMC对肿瘤的治疗作用浓度梯度
将实施例1得到的含有SCAB的透析后的蛋白溶液用超滤管进行超滤，使SCAB处于PBS溶液中，得到SCAB注射液，调整SCAB注射液的浓度得到浓度分别为1μg/100μl、10μg/100μl、100μg/100μl和200μg/100μl的SCAB注射液。将实施例2步骤1得到的PBMC悬浮在PBS中，得到PBMC细胞悬浮液，该PBMC细胞悬浮液中PBMC的含量为6×107个/100μl。
将3×106个人肺癌细胞A549(即靶细胞)与实施例2步骤1的6×107个PBMC细胞(即效应细胞)在PBS中混合，得到总体积为0.2ml的A549-PBMC混合细胞悬浮液，该细胞悬浮液中效靶比为20:1。取24只4-5周龄的NOD/SCID小鼠，在每只NOD/SCID小鼠的右肋皮下注射0.2ml的A549-PBMC混合细胞悬浮液，得到人异种移植模型小鼠，24只人异种移植模型小鼠。
在A549-PBMC混合细胞悬浮液注射NOD/SCID小鼠的当天，将6只人异种移植模型小鼠的每只小鼠的尾静脉中注射100μl浓度为1μg/100μl的SCAB注射液进行治疗，将第一次注射记为治疗第0天，分别在治疗第1天、第2天、第3天和第4天均注射100μl上述浓度为1μg/100μl的SCAB注射液，在治疗第5天、第10天、第15天、第20天、第25天和第30天用游标卡尺以两个垂直方向每周三次测量皮下生长的A549肿瘤，并按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝[(宽度2×长度)/2]，得到1μg/100μl的SCAB对荷瘤小鼠的肿瘤的治疗结果，结果如图8中A和表2所示。
按照上述方法，将浓度为1μg/100μl的SCAB注射液分别替换为上述浓度为10μg/100μl的SCAB注射液、浓度为100μg/100μl的SCAB注射液、浓度为200μg/100μl的SCAB注射液、PBS，其他步骤均不变，分别得到10μg/100μl的SCAB、100μg/100μl的SCAB、200μg/100μl的SCAB和PBMC治疗的人异种移植模型小鼠及它们对荷瘤小鼠的肿瘤的治疗结果，肿瘤体积如图8中A和表2所示。
另取6只4-5周龄的NOD/SCID小鼠注射A549细胞悬液，在A549细胞悬液注射NOD/SCID小鼠的当天，将6只人异种移植模型小鼠的每只小鼠的尾静脉中注射100μlPBS进行治疗，其他步骤不变，得到PBS治疗的人异种移植模型小鼠及其对荷瘤小鼠的肿瘤的治疗结果，肿瘤体积如图8中A和表2所示。
表2、SCAB和PBMC***后的肿瘤体积(mm3)
2、SCAB对肿瘤的治疗作用
将实施例1得到的含有SCAB的透析后的蛋白溶液用超滤管进行超滤，使SCAB处于PBS溶液中，得到SCAB注射液。调整SCAB注射液的浓度得到浓度为10μg/100μl的SCAB注射液；向SCAB注射液中加入CD105得到SCAB浓度为10μg/100μl、CD105浓度为10μg/100μl的SCAB-CD105注射液。将BscAbxCD3溶于PBS中，得到浓度为10μg/100μl的BscAbxCD3注射液。
2.1将3×106个人肺癌细胞A549悬浮在PBS中，得到总体积为0.2ml的A549细胞悬浮液。将实施例2步骤1的6×107个PBMC细胞悬浮在A549悬液中，得到A549-PBMC混合细胞悬浮液，该细胞悬浮液中效靶比为20:1。取24只4-5周龄的NOD/SCID小鼠，在每只NOD/SCID小鼠的右肋皮下注射0.2ml的A549-PBMC混合细胞悬浮液，得到荷瘤小鼠。共处理24只NOD/SCID小鼠，即共得到24只荷瘤小鼠。在A549-PBMC混合细胞悬浮液注射NOD/SCID小鼠的当天，向6只荷瘤小鼠的每只小鼠的静脉中注射100μl浓度为10μg/100μl的SCAB注射液进行治疗，将第一次注射记为治疗第0天，分别在治疗第1天、第2天、第3天和第4天均注射100μL上述浓度为10μg/100μl的SCAB注射液，在治疗第5天、第10天、第15天、第20天、第25天和第30天用游标卡尺以两个垂直方向每周三次测量皮下生长的A549肿瘤，并按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝[(宽度2×长度)/2]，得到SCAB+PBMC对肿瘤的治疗结果(同步骤1中1μg/100μl的SCAB对肿瘤的治疗结果)，结果如图8中B和表3所示。
按照上述方法，将浓度为10μg/100μl的SCAB注射液分别替换为上述SCAB-CD105注射液、BscAbxCD3注射液、步骤1的PBMC细胞悬浮液和PBS，其他步骤均不变，分别得到SCAB-CD105+PBMC对荷瘤小鼠的肿瘤的治疗结果、BscAbxCD3+PBMC对荷瘤小鼠的肿瘤的治疗结果和PBMC(同步骤1中PBMC对肿瘤的治疗结果)对荷瘤小鼠的肿瘤的治疗结果(图8中B和表3)。
2.2取6只4-5周龄的NOD/SCID小鼠，在每只NOD/SCID小鼠的右肋皮下注射0.2ml上述A549细胞悬液，得到荷瘤小鼠。在A549细胞悬浮液注射NOD/SCID小鼠的当天，向6只荷瘤小鼠的每只小鼠的静脉中注射100μl浓度为10μg/100μl的SCAB注射液进行治疗，将第一次注射记为治疗第0天，分别在治疗第1天、第2天、第3天和第4天均注射100μL上述浓度为10μg/100μl的SCAB注射液，在治疗第5天、第10天、第15天、第20天、第25天和第30天用游标卡尺以两个垂直方向每周三次测量皮下生长的A549肿瘤，并按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝[(宽度2×长度)/2]，得到SCAB对肿瘤的治疗结果，结果如图8中B和表3所示。
按照上述方法，将浓度为10μg/100μl的SCAB注射液替换为PBS，其他步骤均不变，得到PBS对肿瘤的治疗结果(同步骤1中PBS对肿瘤的治疗结果)，结果如图8中B和表3所示。
表3、SCAB***后的肿瘤体积(mm3)
实验证明，本发明的单链抗体SCAB对肿瘤的生长具有抑制作用，且治疗作用随SCAB剂量的增加而增强：在治疗第30天，100μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠未见肿瘤生长；10μg/100μl的SCAB+PBMC和1μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积分别为BscAbxCD3+PBMC治疗小鼠的肿瘤体积的0.0281倍和0.4687倍。
本发明的成套抗肿瘤试剂1对肿瘤的生长具有抑制作用，且治疗作用随SCAB剂量的增加而增强：在治疗第30天，100μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠未见肿瘤生长；10μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积的分别为SCAB、PBMC和PBS治疗小鼠的肿瘤体积的0.0277倍、0.0279倍和0.0273倍；1μg/100μl的SCAB+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积的分别为SCAB、PBMC和PBS治疗小鼠的肿瘤体积的0.4609倍、0.4654倍和0.4551倍。
本发明的成套抗肿瘤试剂2对肿瘤也具有治疗作用：在治疗第30天，SCAB-CD105+PBMC治疗的小鼠的肿瘤体积分别为SCAB、PBMC和PBS治疗小鼠的肿瘤体积的0.4559倍、0.4604倍和0.4502倍。
实验证明，本发明的成套抗肿瘤试剂和单链抗体SCAB能诱导的T淋巴细胞来***，治疗具有靶向性且治疗效果随SCAB浓度的增加而增强。
3、SCAB的体内毒性实验
在步骤1的200μg/100μl的SCAB注射液+PBMC治疗人异种移植模型小鼠的第30天，HE染色法观察小鼠的心脏、肝脏、脾、肺和肾脏组织，用NOD/SCID小鼠的相应组织作为正常对照，结果显示(图9)，SCAB治疗的小鼠的主要组织器官没有实质性损害，组织局部无炎症细胞浸润，表明SCAB的副作用很小或无副作用。
Claims (10)
1.成套抗肿瘤试剂，为下述M或N：
M、包括单链抗体和效应细胞的成套抗肿瘤试剂；
所述单链抗体由下述甲、乙、丙和丁的蛋白质连接而成：
甲、序列表中SEQIDNo.1的第37-161位氨基酸所示的蛋白质；
乙、序列表中SEQIDNo.1的第177-289位氨基酸所示的蛋白质；
丙、序列表中SEQIDNo.1的第305-424位氨基酸所示的蛋白质；
丁、序列表中SEQIDNo.1的第440-546位氨基酸所示的蛋白质；
所述效应细胞为T淋巴细胞或PMBC；
N、包括与所述单链抗体相关的生物材料和所述效应细胞的成套抗肿瘤试剂；
所述与所述单链抗体相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：
B1)编码所述单链抗体的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
2.根据权利要求1所述的成套抗肿瘤试剂，其特征在于：所述单链抗体为下述a)或b)：
a)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的第37-546位氨基酸的抗体；
b)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的成套抗肿瘤试剂，其特征在于：编码权利要求1所述甲的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第109-483位核苷酸；
编码权利要求1所述乙的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第529-867位核苷酸；
编码权利要求1所述丙的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第913-1272位氨基酸；
编码权利要求1所述丁的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2的第1318-1638位核苷酸。
4.根据权利要求1或2或3所述的成套抗肿瘤试剂，其特征在于：B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)或4)：
1)核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的cDNA分子或DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的第109-1638位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2或3所述单链抗体的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2或3所述单链抗体的cDNA分子或基因组DNA分子。
5.根据权利要求1-4中任一所述的成套抗肿瘤试剂，其特征在于：所述成套抗肿瘤试剂还包括权利要求1或2或3所述单链抗体识别的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的成套抗肿瘤试剂，其特征在于：所述蛋白质为下述x)或y)：
x)序列表中SEQIDNo.3的第1-559位氨基酸所示的蛋白质；
y)包含序列表中SEQIDNo.4的第13-126位氨基酸的蛋白质。
7.下述任一产品：
h)权利要求1或2或3所述的单链抗体；
i)权利要求1-4中任一所述的与所述单链抗体相关的生物材料；
j)含有权利要求1或2或3所述单链抗体的融合抗体；
k)权利要求1或2或3所述的单链抗体诱导的T淋巴细胞；
l)权利要求1-4中任一所述的与所述单链抗体相关的生物材料诱导的T淋巴细胞；
m)权利要求1或2或3所述单链抗体的融合抗体诱导的T淋巴细胞。
8.下述任一产品：
C1、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1-6中任一所述的成套抗肿瘤试剂；
C2、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1或2或3所述的单链抗体；
C3、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的与所述单链抗体相关的生物材料；
C4、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为含有权利要求1或2或3所述单链抗体的融合抗体；
C5、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1-6中任一所述的成套抗肿瘤试剂诱导的T淋巴细胞；
C6、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1或2或3所述的单链抗体诱导的T淋巴细胞；
C7、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的与所述单链抗体相关的生物材料诱导的T淋巴细胞；
C8、治疗和/或预防肿瘤的产品，其活性成分为含有权利要求1或2或3所述单链抗体的融合抗体诱导的T淋巴细胞。
9.下述任一应用：
L1)权利要求1-6中任一所述的成套抗肿瘤试剂在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L2)权利要求1或2或3所述的单链抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L3)权利要求1-4中任一所述的与所述单链抗体相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L4)含有权利要求1或2或3所述单链抗体的融合抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L5)权利要求1-6中任一所述的成套抗肿瘤试剂诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L6)权利要求1或2或3所述的单链抗体诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L7)权利要求1-4中任一所述的与所述单链抗体相关的生物材料诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；
L8)含有权利要求1或2或3所述单链抗体的融合抗体诱导的T淋巴细胞在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。
10.根据权利要求1-6中任一所述的成套抗肿瘤试剂、或权利要求8所述的产品、或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肺癌、非小细胞肺癌、***、***癌、胰腺癌、肠癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、乳腺癌或子宫内膜癌。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105754990A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-07-13 | 深圳精准医疗科技有限公司 | 一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013132268A1 (en) * | 2012-03-09 | 2013-09-12 | Ucl Business Plc | Chemical modification of antibodies |
| CN103517921A (zh) * | 2010-12-21 | 2014-01-15 | Abbvie公司 | IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
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2015
- 2015-06-03 CN CN201510299305.1A patent/CN105148270A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103517921A (zh) * | 2010-12-21 | 2014-01-15 | Abbvie公司 | IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
| WO2013132268A1 (en) * | 2012-03-09 | 2013-09-12 | Ucl Business Plc | Chemical modification of antibodies |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KORN ET AL: "Bispecific Single-Chain Diabody-Mediated killing of Endoglin-positive Endothelial Cells by Cytotoxic T Lymphocytes", 《JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY》 * |
| NCBI GENBANK: "Locus No:NP_000724", 《NCBI》 * |
| NCBI GENBANK: "Locus No:NP_001108225", 《NCBI》 * |
| 尹志伊 等: "肺癌组织中CD105与Nestin的表达", 《齐鲁医学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105754990A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-07-13 | 深圳精准医疗科技有限公司 | 一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |