CN105132522A

CN105132522A - Dna三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶dna糖基化酶的高灵敏检测

Info

Publication number: CN105132522A
Application number: CN201510566342.4A
Authority: CN
Inventors: 姜玮; 王磊; 朱静
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CN105132522B

Abstract

本发明涉及DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测。本发明以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了发夹重构的识别机制，将DNA修饰酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建。该器件能够用于DNA修饰酶(尤其是UDG)的高灵敏检测和抑制剂筛选，具有潜在的应用价值。

Description

DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测

技术领域

本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测。

背景技术

在过去十几年里，DNA因其具有严格的碱基配对原则而成为一种有趣的组装元素用于可控的、程序化的设计和组装DNA纳米材料。通过合理的序列设计和DNA自组装过程，一系列的动态DNA纳米器件被成功组装，如纳米机器、逻辑门、催化放大器等，它们大多是基于Toehold介导的链置换反应。DNA纳米器件通常是通过pH的调节、核酸杂交以及金属离子与碱基的反应引发的。然而，一般的设计仅仅将一种目标物转化为信号输出，这大大限制了目标物响应的DNA纳米器件的多样化设计。

典型的DNA三向节是由三条单独的DNA互相杂交形成，它作为一种新型的DNA纳米组装构筑单元被应用于DNA动态自组装中。多臂结构为组装目标物响应的DNA纳米器件提供了更多的可能性。对Toehold介导的链置换反应而言，在不同的三向节臂上安置Toehold和链迁移序列是至关重要的，原因为该种设计可使组装更加灵活，反应更易调节。在DNA三向节活化策略中，最初Toehold序列和链迁移序列是不可接近的，当进行识别反应后，通过某种信号转导机制的引入，即可将该识别事件转化为三向节的活化过程。最近，DNA三向节活化策略被成功用于目标物诱导的DNA环路和逻辑门中。然而，在该类设计中仍存在诸多限制，Toehold和链迁移序列通过一段完整的适体链连接或被劈开成两条DNA链，这就只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件，如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合等。因此，构建功能先进且能识别多种目标物的DNA纳米器件仍是个巨大的挑战。

核酸酶，如DNA修饰酶，在调节基因表达和维持基因完整性上起重要作用。DNA修饰酶的异常表达可能干扰基因形式的遗传外重新编程进而影响核染色质结构，引起许多疾病，如癌症、亨廷顿疾病或精神异常等。然而，DNA修饰酶作用的底物为一段DNA序列或特定的碱基位点，利用DNA修饰酶构建DNA纳米器件的最大障碍即为缺少有效的识别机制，如何将该类酶的作用转化为DNA三向节活化过程，是本领域技术人员面临的难题。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，发明人通过引入新的酶识别机制，可以实现将不同种目标物转化为同一种信号输出的一般性纳米器件的构建。以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了DNA三向节活化中的发夹重构机制，将DNA修饰酶(UDG)对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建。该器件能够用于DNA糖基化酶UDG的高灵敏检测和抑制剂筛选，证明了该方法具有潜在的应用价值。

本发明涉及以下技术方案：

1、一种杂交链式反应方法，包括由DNA修饰酶参与的DNA三向节活化形成DNA三向节触发链，进而引发发卡结构H1、H2的杂交链式反应，其特征在于，DNA修饰酶识别探针与DNA修饰酶作用，识别探针发生发夹重构，继而形成DNA三向节触发链。

本发明所述的发卡重构是指，DNA修饰酶识别探针是包括toehold、DNA修饰酶的识别序列、链迁移部分、位于DNA修饰酶识别序列两端的两段互补的辅助序列且链迁移部分与识别序列杂交的发卡结构，DNA修饰酶与识别探针结合使得链迁移部分与识别序列的杂交变得极其不稳定，继而探针中两段互补的辅助序列发生配对杂交，原来的发夹结构发生重构，toehold和链迁移部分拉近，形成一个三向节触发链，体系中加入H1和H2时，三向节结构打开H1的发夹，进而形成H1和H2交替组装的双链结构。

本领域技术人员明了，不同类型的DNA修饰酶可以通过不同的方式使得识别序列发生碱基变化，即而引发识别探针的发卡重构，优选的，识别探针设计为，加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)后，识别序列中的U被移除，生成无碱基位点(APsite)，使链迁移部分与UDG识别序列的杂交变得极其不稳定，这时，两端互补的辅助序列杂交，使原来的发夹发生重构。

2、一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的尿嘧啶DNA糖基化酶检测方法，其特征在于，

(1)制备UDG识别探针、H1、H2，其中UDG识别探针是包括toehold、UDG酶识别序列、链迁移部分、位于UDG酶识别序列两端的两段互补的辅助序列且链迁移部分与识别序列杂交的发卡结构，识别探针与UDG酶结合可使得链迁移部分与识别序列的杂交变得极其不稳定，继而探针中两段互补的辅助序列发生配对杂交，原来的发夹结构发生重构，toehold和链迁移部分拉近，形成一个三向节触发链；

(2)加入UDG酶，进行杂交链式反应；

(3)对反应结果进行信号检测。

优选的，上述检测方法在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)与识别探针作用前，进行DNA的退火，包括UDG识别探针、杂交链式反应的H1和H2的退火，使UDG酶识别探针、H1和H2均形成稳定的非活化状态发夹结构。

优选的，杂交链式反应中形成的双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构，作为信号报告元件，通过加入荧光染料NMM进行信号检测。

优选的，识别探针的序列为CTTGCAATTGTGAUTUTGTCTCACTTACAAAAACGTTACC，H1的序列为ACAACGAACACGTTACCGGGTAGGGCGTTAGGAGGTAACGTGTTCGTTGTAATTGCAAGG，H2的序列为TGGGTTCCTAACGCCCTACCCGGTAACGTGTTCGTTGTGCAATTACAACGAACACGTTACCGGTAGGCGGG。

优选的，识别探针的浓度为250nM，H1的浓度为500nM，H2的浓度为550nM；杂交链式反应的组装时间采取120min。

3、一种利用上述检测方法进行尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于：在步骤(2)中，额外加入不同浓度的候选抑制剂后，进行杂交链式反应。

4、一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的尿嘧啶DNA糖基化酶检测试剂盒，其特征在于，包括UDG酶识别探针、H1和H2，信号检测试剂，所述UDG识别探针是包括toehold、UDG酶识别序列、链迁移部分、位于UDG酶识别序列两端的两段互补的辅助序列且链迁移部分与识别序列杂交的发卡结构，识别探针与UDG酶结合可使得链迁移部分与识别序列的杂交变得极其不稳定，继而探针中两段互补的辅助序列发生配对杂交，原来的发夹结构发生重构，toehold和链迁移部分拉近，形成一个三向节触发链。

本发明取得了以下技术效果：

(1)本发明引入新的酶识别机制，提供了新的DNA三向节活化策略。

(2)本发明所述的DNA三向节活化策略，克服了现有技术中只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件的限制(如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合)。

(3)本发明以DNA糖基化酶UDG为模型，开发了发夹重构机制，将DNA修饰酶酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，引起DNA的自组装过程，实现了一类酶底物的通用性DNA纳米器件的构建。

(4)本发明所述方法针对尿嘧啶DNA糖基化酶实现了高灵敏检测，其中UDG的检测下限达到0.000043U/Ml,与已报道的荧光信号扩增检测UDG活性方法相比，本发明的检测限低了至少一个数量级。

(5)本发明所述检测方法经试验验证具有良好的特异性。

附图说明

图1DNA三向节活化为基础的杂交链式反应检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理。

图2聚丙烯酰胺凝胶电泳验证UDG响应的DNA三向节活化的杂交链式反应的可行性。

图3荧光光谱实验验证UDG响应的DNA三向节活化的杂交链式反应的可行性。

图4体系实验条件的优化：(A)UDG识别探针浓度的变化对体系荧光强度的影响；(B)H1浓度的变化对体系荧光强度的影响；(C)H2浓度的变化对体系荧光强度的影响；(D)组合Toehold介导的杂交链式反应时间对体系荧光强度的影响。

图5(A)不同浓度的UDG下的荧光图谱；(2)荧光净信号与UDG浓度之间的线性关系。

图6DNA三向节活化为基础的杂交链式反应检测UDG酶活性的特异性考察。

图7抑制剂UGI对DNA糖基化酶UDG的抑制作用。

图8抑制剂5-FU对DNA糖基化酶UDG的抑制作用。

具体实施方式

仪器装置

荧光分光光度计(F-7000，日本Hitachi)；电热恒稳培养箱(DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司)；恒温循环水槽(HX-105，北京长流科学仪器有限公司)；电子天平(ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司)。K30型干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司，杭州)。DYY-8C型双稳定时电泳仪电源(北京市六一仪器厂，北京)；JY-SCZ9型双垂直电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，北京)。

材料与试剂

所有的DNA序列均由上海生物工程有限公司合成和纯化(上海，中国)。40％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)和溴化乙锭(EB)均由上海生物工程有限公司购得(中国)。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)及其抑制剂(UGI)和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)均购于NewEnglandBiolabs(Ipswitch，MA)。外切酶I(ExoI)和外切酶III(ExoIII)均购于ThermoFisherScientificLtd.(中国)。5-氟尿嘧啶购于MedChemExpress(USA)。所有的试剂均为分析纯，所用水为超纯水(>18.25MΩ)。

实施例一、实验方法

UDG与其识别序列作用

在10μL反应体系中分别加入退火后的UDG识别序列、不同浓度的UDG酶、UDG作用缓冲液和超纯水，涡旋混匀后反应45min。

杂交链式反应的进行

UDG与其识别序列反应后，发生发夹的构象转变，原本封闭在发夹刚性结构中的toehold和链迁移部分得到靠近，形成完整的杂交链式反应引发链。在以上体系中，加入1×TNaK缓冲液，H1，H2和超纯水，涡旋混匀后反应2h。

染料的加入以及荧光测定

上述杂交链式反应完成后，在反应体系中加入NMM，KCl和超纯水，使其体积增加到50μL。涡旋混匀后，避光反应1h。

所有的荧光强度测定都是通过日本HitachiFL-7000荧光分光光度计上进行，然后建立UDG活性浓度与绝对荧光强度的关系曲线。

UDG酶抑制剂的筛选

选取两种对UDG酶活性抑制的蛋白或药物，分别为UGI、5-氟尿嘧啶。筛选抑制剂的实验步骤与UDG活性检测步骤类似，一点不同的是在第一步UDG与识别序列作用中加入不同浓度的抑制剂，后续进行相同的杂交链式反应和荧光强度的测定。然后根据荧光强度与抑制剂的浓度建立关系曲线。

实施例二、基于DNA三向节活化的杂交链式反应用于尿嘧啶DNA糖基化酶的高灵敏检测

DNA三向节活化为基础的杂交链式反应检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理

本发明设计了UDG酶诱导的发夹重构策略，并结合杂交链式反应的等温放大功能，对其进行特异性识别和高灵敏的检测。具体原理如下：设计了UDG识别探针(RUP)，其中包括UDG的识别序列，toehold，链迁移部分以及两段互补的辅助序列。当体系中加入UDG酶后，识别探针上的U被移除，生成无碱基位点(APsite)，使链迁移部分与UDG识别序列的杂交变得极其不稳定。这时，两端互补的辅助序列杂交，使原来的发夹发生重构，将toehold和链迁移部分拉近，形成一个三向节触发链。当体系中加入H1和H2时，三向节结构打开H1的发夹，进而形成H1和H2交替组装的双链结构。该双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构。作为信号报告元件，加入荧光染料NMM，即可发出增强的荧光信号。我们利用不同浓度下产生的荧光强度测定UDG酶的活性。

DNA三向节活化为基础的杂交链式反应检测UDG活性的可行性分析

首先进行电泳验证。如图2所示，lane5为模拟UDG识别探针构象转变后链(MRP)的条带，lane6为H1链的条带，lane7为H2链的条带，lane8为H1和H2共同存在的条带，lane9为加入MRP，H1和H2三种序列反应后的条带。从以上结果可以看出，lane9上方的宽亮条带即为不同长度的H1和H2组装产物，即能证明DNA三向节活化的杂交链式反应是可以进行的。此外，lane2为UDG酶识别序列(RUP)的条带，lane3为RUP，H1和H2三种序列共同存在下的条带，lane4为UDG酶，RUP，H1和H2共同存在下的条带。以上结果可以看出，当体系中不存在UDG酶时，只能看见少量的杂交链式反应产物，即lane3上方模糊的宽长条带。但体系中加入UDG酶后，有明显的杂交链式反应产物出现，即为lane4上方宽长亮的条带。说明，在UDG与RUP作用后，探针发生了构象转变，并使toehold与链迁移部分发生了靠近，有效地引发了杂交链式反应，证明了本发明设计的反应原理的可行性。

另外，利用荧光光谱法进一步证明了反应的可行性，设计了两条UDG识别探针，其中一条不包含toehold部分(RUP-NT)，另一条不包含链置换的悬垂部分(RUP-NB)。如图3所示，当体系中加入RUP，H1和H2时，有较小的荧光信号出现，我们把该信号定义为背景信号。而当体系中加入UDG酶后，荧光强度得到了极大的提高。证明是UDG酶的作用触发了整个体系的反应。另外，UDG酶存在体系中时，加入RUP-NT或RUP-NB，与H1和H2共同反应后，得到的荧光强度比背景信号还低。说明识别探针中只有toehold部分和链迁移部分同时存在，才能产生完整的杂交链式反应触发链，该体系才能进行后续反应。因此，凝胶电泳实验和荧光实验均证明了该方法原理的合理性以及操作的可行性。

实验条件的优化

为了得到最优的传感性能，本发明对几个实验参数进行了考察：UDG识别探针浓度、H1和H2的浓度以及HCR的反应时间。采用F-F₀作为纵坐标对以上条件进行优化，其中F为体系加入UDG时产生的阳性信号，F₀为体系中不加UDG产生的背景信号。

UDG识别探针的浓度同时影响体系的背景信号与AHCR的组装效率。当其浓度较低时，一定浓度的UDG能够将识别探针上U碱基全部移除，发生构象转变，引发AHCR反应。此时，背景信号较低，但由于其本身浓度低，因此引发AHCR组装产物有限，因此整个体系的荧光强度较弱。随着识别探针浓度的增加，发生构象转变的探针数量也在不断增加，因此体系的荧光强度呈现逐渐增加的趋势。当识别探针浓度从100nM增加到250nM时，体系的荧光强度达到最大。继续增加到350nM，体系的荧光强度达到平台，几乎无变化(图4A)。在接下来的实验中采取的UDG识别探针的浓度为250nM。

H1和H2的浓度决定AHCR的组装效率，直接与产生G-四倍体的数量有关，因此它们的浓度直接影响着AHCR的信号放大能力。首先，现有技术的杂交链式反应中已报到的H2的浓度，选择500nM作为固定值，变化H1的浓度。我们选择250nM到600nM作为优化范围，从图4B可以看出，浓度达到500nM时荧光强度达到最大，继续增加H1的浓度，体系的荧光强度已经达到平台。因此，在接下来的实验中，选择H1的浓度为500nM。然后，选择最优的H1浓度作为固定值，变化H2的浓度。如图4C所示，选择350nM到650nM作为优化范围，体系在H2的浓度达到550nM时达到最大。继续增加H2的浓度，荧光强度不再增加。因此，在接下来的实验中，选择H2的浓度为550nM。

AHCR反应是基于toehold介导的链置换反应的动力学进行的，因此，杂交组装的时间对AHCR产物组装的长度与数量至关重要。因此，选择了从20min到160min的时间段对其进行优化。如图4D所示，荧光强度从20min到120min呈现逐渐增加的趋势，到120min时达到最大。继续增加其组装时间，荧光强度几乎不再变化，说明AHCR在120min时组装达到饱和。因此，在接下来的实验中，AHCR的组装时间采取120min。

DNA三向节活化为基础的杂交链式反应用于检测UDG活性

灵敏度

确定体系的最优反应条件后，通过测定不同浓度的UDG与荧光强度的变化关系，对本方法的灵敏度进行了考察。如图5所示，A图为不同浓度的目标UDG的荧光光谱图。从图中可看出，随着UDG浓度的增加，荧光强度呈逐渐增加的趋势。浓度超过0.05U/mL后，荧光强度基本达到饱和，说明0.05U/mL的UDG已经可以将体系中所有识别探针中的U碱基移除掉，进而发生构象转变，引发级联的杂交链反应，产生饱和的荧光信号。B图为荧光强度与目标UDG的线性关系曲线，从图中可以看出，UDG浓度与净荧光强度在0.00050U/mL-0.010U/mL范围内呈线性关系。经估算本方法的检测下限达到0.000043U/mL。与已报道的荧光信号扩增检测UDG活性方法相比，本方法的检测限低了至少一个数量级。推测本方法的高灵敏度主要归功于三个方面：(1)进行灵敏度测定实验中，采用的UDG识别探针只含有1个U碱基。等量的UDG作用于含有不同U碱基的探针时，U碱基越少，获得构象转变的探针数量越多，因而在检测中测得的灵敏度越高。该因素为方法高灵敏度的主要因素。(2)级联的杂交链式反应的组装能力使得每一次组装都可获得带有N个G-四倍体的长链DNA，从而实现1个目标物产生N个信号的放大能力。(3)G-四倍体与NMM结合的特异性保证了该方法的低背景信号，这样增加了低浓度UDG测定时的区分度，从而提高了检测灵敏度。

特异性考察

为了考察本方法对UDG酶活性检测的特异性，本发明选择了三种核酸酶作为对照，其中还包括人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、核酸外切酶I(ExoI)、核酸外切酶III(ExoIII)。如图6所示，hOGG1、ExoI和ExoIII作为目标物加入体系中时，只产生了近似背景的荧光信号。而UDG酶作为目标物时产生明显的荧光增强。说明该方法对UDG酶的检测展现了良好的特异性。

抑制剂筛选

为了考察本方法对UDG酶抑制剂的筛选能力，本发明选择UGI和5-FU(5-氟尿嘧啶)作为抑制剂模型。据报道，UGI可与UDG等摩尔量的结合形成不可逆的复合物，进而抑制UDG的活性。如图7所示，当体系仅存在5U/mLUDG酶时，会产生明显的荧光信号。而体系中加入等量的UDG和UGI时(浓度均为5U/mL)，荧光强度大大降低。说明，UGI与UDG紧密结合，并有效的抑制了其碱基移除的活性。利用该方法对不同浓度5-FU的抑制作用进行了考察，结果如图8所示。随着5-FU浓度的增加，UDG碱基移除的活性逐渐降低，最后逐渐达到平衡。以UDG的相对活性为纵坐标，5-FU的浓度变化作为横坐标作图，得到5-FU的IC₅₀值为2.5mM。

本发明提供了一种核酸酶响应的DNA三向节活化方式，以DNA修饰酶(DNA糖基化酶UDG)为模型，构建了一种通用型的杂交链式反应用于DNA修饰酶活性的高灵敏、特异性检测以及抑制剂筛选。通过引入构象转变机制，将DNA修饰酶的识别事件转化为同一个DNA组装的引发链，进而引发相同的杂交链式反应。本发明的一般化设计原理可使其微小的改变识别部分即可实现更多种核酸酶的检测和抑制剂筛选。

Claims

1.一种杂交链式反应方法，包括由DNA修饰酶参与的DNA三向节活化形成DNA三向节触发链，进而引发发卡结构H1、H2的杂交链式反应，其特征在于，DNA修饰酶识别探针与DNA修饰酶作用，识别探针发生发夹重构，继而形成DNA三向节触发链。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA修饰酶为尿嘧啶DNA糖基化酶。

3.一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的尿嘧啶DNA糖基化酶检测方法，其特征在于，

(2)加入UDG酶，进行杂交链式反应；

(3)对反应结果进行信号检测。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)与识别探针作用前，进行DNA的退火，包括UDG识别探针、杂交链式反应的H1和H2的退火，使UDG酶识别探针、H1和H2均形成稳定的非活化状态发夹结构。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，杂交链式反应中形成的双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构，作为信号报告元件，通过加入荧光染料NMM进行信号检测。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，识别探针的序列为CTTGCAATTGTGAUTUTGTCTCACTTACAAAAACGTTACC，H1的序列为ACAACGAACACGTTACCGGGTAGGGCGTTAGGAGGTAACGTGTTCGTTGTAATTGCAAGG，H2的序列为TGGGTTCCTAACGCCCTACCCGGTAACGTGTTCGTTGTGCAATTACAACGAACACGTTACCGGTAGGCGGG。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，识别探针的浓度为250nM，H1的浓度为500nM，H2的浓度为550nM；杂交链式反应的组装时间采取120min。

8.一种利用权利要求3-7任一项所述方法进行尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于：在步骤(2)中，额外加入不同浓度的候选抑制剂后，进行杂交链式反应。

9.一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的尿嘧啶DNA糖基化酶检测试剂盒，其特征在于，包括UDG酶识别探针、H1和H2，信号检测试剂，所述识别探针的序列为CTTGCAATTGTGAUTUTGTCTCACTTACAAAAACGTTACC，H1的序列为ACAACGAACACGTTACCGGGTAGGGCGTTAGGAGGTAACGTGTTCGTTGTAATTGCAAGG，H2的序列为TGGGTTCCTAACGCCCTACCCGGTAACGTGTTCGTTGTGCAATTACAACGAACACGTTACCGGTAGGCGGG。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，识别探针的浓度为250nM，H1的浓度为500nM，H2的浓度为550nM；杂交链式反应的组装时间采取120min。