CN105132412B - 一种arf1基因3′-UTR及其在控制基因表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程领域，提供了arf1基因3′‑UTR及其在控制基因表达中的应用，arf1基因3′UTR序列如SEQ ID NO.1所示，是将编码arf1基因3′‑UTR的核苷酸序列与报告基因GUS重组后，通过转基因技术将其整合到植物细胞中，随宿主基因组表达。带有3′‑UTR的GUS与带有Tnos的GUS相比，蛋白产物显著增加。本发明还提供了arf1基因3′‑UTR在转基因植物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及arf1基因mRNA的3′-UTR在调控基因表达中的应用。
技术背景
植物基因表达过程分为启动子的启动、转录起始、延伸及终止。基因的启动需要可诱导的强启动子，同样，基因表达的终止也需要可靠的终止子。基因工程在很大程度上有赖于基因转录的有效启动和终止。真核生物中，转录和翻译的过程在空间和时间上是分开进行的，转录过程中的调控和转录后水平的调节对基因的表达调控都是十分重要的。一个转录本的总体结构是由5′端非翻译区（5′untranslated region ，5ˊ-UTR）、编码区（openreading frame，ORF）和3ˊ端非翻译区（3ˊ-UTR）三部分组成。3ˊ端非翻译区（3ˊuntranslated region，3ˊ-UTR）是真核生物特有的序列结构之一，3′-UTR通过影响mRNA的积累、稳定性和翻译效率，在调控基因表达的转录和转录后水平中起到重要作用。目前植物基因工程中常用的终止子是Tnos，除此以外其他的终止子很少，寻找可替代Tnos的终止子对于植物基因工程技术的应用具有重要意义。
腺苷酸核糖基化作用因子arf1基因是一种编码小G蛋白，负责调控细胞内的囊泡运输，从而影响细胞的生长发育基因。是一种组成型表达基因。
发明内容
本发明的目的是提供arf1基因mRNA的3′-UTR在调控基因表达中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
所述arf1基因3′UTR，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
为了实现本发明的目的，其是将编码arf1的3′-UTR的核苷酸序列与报告基因gusGUS序列重组，获得gusGUS-arf1 3′-UTR的重组基因，然后整合至宿主基因组中，并随宿主基因组表达。具体为：依据arf1基因mRNA 3’-UTR的DNA序列设计特异性引物，引物序列F：5’TTCGAGCTCTTGAAGCATCTTGGCC 3 ’R：5’TTGGAATTCGATATGACCAAACGGATT 3’，以“日本晴”DNA为模板，PCR扩增目的条带，回收纯化后，与载体PMD-18T连接测序。载体pCUbi-GUS -Tnos用EcoRⅠ和SacⅠ双酶切，将arf1基因3’-UTR片段替换Tnos形成重组质粒pCUbi-GUS-arf13’-UTR，酶切鉴定。将正确的重组质粒导入农杆菌LBA4404，用于农杆菌转化。农杆菌转化过程包括：
1）种子消毒和愈伤诱导；
2）农杆菌pUbi-OsSUT2/LBA4404制备；
3）侵染及共培养；
4）抗性愈伤筛选；
5）抗性愈伤分化、幼苗生根。
转基因小苗移栽、检测、筛选出超表达的转基因植株，通过自交重组，获得转基因纯合株系。
种植T1代水稻，分别取花期根、茎、叶、花器官以及成熟种子。部分用于组织化学法检测样品GUS 蛋白(Jefferson1987)；部分用于提取蛋白测定总蛋白含量和GUS酶活性。
所述宿主为水稻。
所述编码arf1的3′-UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.1，以及该序列替换、缺失或添加若干个核苷酸形成的具有与arf1的3′-UTR同等功能的核苷酸序列。
本发明的优点在于：本发明提供的arf1的3′-UTR片段可替代Tnos，作为基因表达调控序列，可应用于植物基因工程。特别是水稻的基因工程修饰，利用来源于水稻自身的序列培育转基因水稻，能够避免使用外源调控序列带来的安全性隐患。
附图说明
图1 arf1基因3′-UTR核苷酸序列连接在GUS表达载体pCUbi-GUS-arf1 3′-UTR上的表达框示意图。
图2 转基因水稻不同组织器官GUS组织化学染色图。其中A、B、C、D、E分别为根、茎、叶、花和种子。U7为转pCUbi-GUS-arf1 3′-UTR载体水稻；UT为转pCUbi-GUS-Tnos水稻，作为阳性对照；CK为非转基因水稻，为阴性对照。
图3 转基因水稻GUS蛋白酶活性检测法验证arf1 3′-UTR在转基因水稻上的功能。其中GUS-arf1 3′-UTR为转pCUbi-GUS-arf1 3′-UTR载体水稻；CK为转pCUbi-GUS-Tnos水稻作为阳性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。这些实施例仅用于说明本发明而不限于本发明的范围。
实施例1 arf1基因mRNA的3’UTR的克隆及序列分析
以“日本晴”水稻为材料，采用改进的CTAB法（Sambrook et al，1989）提取基因组DNA的提取。以“日本晴”水稻DNA为模板，依据arf1基因mRNA 3′-UTR对应的DNA序列用Primer5.0设计特异性引物，引物序列为F: 5' TTCGAGCTCTTGAAGCATCTTGGCC 3' 、R：5'TTGGAATTCGATATGACCA
AACGGATT 3'。用Golden DNA Polymerase扩增目的片段，PCR反应体系（50ul）为：“日本晴”水稻DNA 2uL，F和R引物各1uL，Golden DNA Polymerase（2.5U/uL）1uL，2xReaction Mix 25uL，最后用灭菌的ddH2O补齐至50uL，目的片段大小595bp，电泳检测扩增条带，正确后用1%琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收3′-UTR片段，与载体PMD-18T连接转化后送生物公司测序，序列如SEQ ID NO.1所示。序列分析显示arf1基因mRNA的3′-UTR含有8个多聚信号元件和4个UE。
实施例2 pCUbi-GUS-arf1 3’-UTR植物表达载体的构建及其转基因水稻获得
用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ将载体骨架pCXGUS-P（genebank ID: FJ905224）（Chen S. et al., 2009）酶切回收，与Ubiquitin启动子片段连接，构建重组质粒pCUbi-GUS-Tnos。再用限制性内切酶EcoRⅠ和SacⅠ双酶切重组质粒pCUbi-GUS-Tnos，用arf1 3′-UTR片段替换pCUbi-GUS-Tnos中的Tnos，所构建的质粒命名为pCUbi-GUS-arf1 3′-UTR，将该质粒电击到农杆菌LBA4404菌株，鉴定正确后，用于转化水稻，鉴定arf1 3′-UTR的功能。所构载体的表达框示意图见图1 。
将pCUbi-GUS-arf1 3’UTR重组质粒通过农杆菌介导法导入“日本晴”水稻，所获转化植株经30mg/L 潮霉素筛选、PCR检测鉴定为转基因植株后，种植于温室中，T0代水稻自交授粉后，收获T1代种子。
实施例3 GUS组织化学染色法验证arf1 3’UTR在转基因水稻上的功能
选T1代纯合株系水稻，于开花期分别取根、茎、叶、花器官，成熟期取种子纵切，保留完整的胚和胚乳。采用组织化学法检测样品GUS 蛋白(Jefferson, 1987) 表达。具体步骤如下：将待测样品侵入GUS反应液中，37℃保温数小时，然后用无水乙醇、75%乙醇和50%乙醇对叶片组织进行梯度脱色处理，拍照记录GUS组织化学染色结果，结果见图2。结果显示：转pCUbi-GUS-arf1 3′-UTR载体的水稻其GUS蛋白表达量明显高于转pCUbi-GUS-Tnos的水稻，且在植株的不同部位均有较强表达。
实施例4 GUS蛋白酶活性检测法验证arf1 3′-UTR在转基因水稻上的功能
选T1代纯合株系，于开花期分别取根、茎、叶、花器官，成熟期取种子纵切，保留完整的胚和胚乳，提取总蛋白。每个克隆取3株作为混合样。用Bradford法（1976）测定总蛋白含量。用荧光法测定GUS酶活性。具体步骤为：取一块96微孔板预冷，每孔加入50ul的待测样品后，迅速加入50ul预冷的GUS essay buffer，密封。于37℃保温反应45分钟，之后迅速加入900ul 0.2M的Carbonate stop buffer终止反应。用Thermo Scientific公司的荧光测量仪，选择激发波长为355nm、发射波长为460nm的滤光片组，扫描方式为终点测定，收集记录荧光强度，空白阴性对照为不加任何样品的空白孔。将机器扫描获得的数据结合样品总蛋白测定数据计算GUS酶活性。GUS酶活力单位定义为单位时间内单位质量的GUS酶蛋白催化产生的具有荧光活性的4-MU的摩尔数，具体为每分钟每毫克GUS酶蛋白催化所产生的4-MU的皮摩尔数（即pmol/mg/min）。所有材料的GUS酶活性数据换算成标准的酶活力单位，根据不同的酶活力单位来判断GUS基因在组织中的表达水平,结果见图3。检测结果显示：转pCUbi-GUS-arf1 3′-UTR载体的水稻其GUS蛋白酶活性明显高于转pCUbi-GUS-Tnos的水稻，且在植株的根、茎、叶、花器官以及成熟种子中均有较强表达。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 一种arf1基因3′-UTR及其在控制基因表达中的应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> arf1的3′-UTR的核苷酸序列
<400> 1
cttgaagcat cttggccggg cttaaatgaa aggaagacat ggcggatatc cctgagtgaa 60
cgctgccttt ttacgtatcg aaactatata gtcatgacag ataatgatgt ggatgttttg 120
ggaagataaa gctctttagg ttccaccacc aaaggagcta gctatcagat tgtttttcgt 180
ggggtgttaa aaaatcgtgc gtgtttcagt ttggttttta atcgaaaggc ttacggtgcc 240
tgacttttgt acctctgtac tcgccacaga tgttgtagta ttgacttgtc ttgggcatag 300
cgtattgtta cgtaatcctg ttctgtgcag ccacccccaa tatccttacc agtttatccc 360
ccgttgcctt cctggccagc attctgctgc ctttcttctt ggatggcact tcattccttt 420
tcagtagctt tccgtatgtt tatattgaag taagcgcttg taacgtcagc ctgaaaattg 480
caaaccgatc atttcctgtg ggctgtaagg gtttcttgga acataagaat tttacaggaa 540
tgggttttga tctcaatgaa atccgtttgg tcatatc 577
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcgagctct tgaagcatct tggcc 25
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttggaattcg atatgaccaa acggatt 27
Claims (4)
1.一种arf1基因3′UTR在转基因植物中控制基因表达的应用，所述arf1基因3′UTR基因序列如SEQ ID NO.1所示；具体步骤为：依据arf1基因3’-UTR的DNA序列设计特异性引物，引物序列F：5’TTCGAGCTCTTGAAGCATCTTGGCC 3 ’，R：5’TTGGAATTCGATATGACCAAACGGATT 3’，以水稻 DNA为模板，PCR扩增目的条带，回收纯化后，与载体PMD-18T连接测序；载体pCUbi-GUS -Tnos用EcoRⅠ和SacⅠ双酶切，用将arf1基因3’-UTR片段替换Tnos形成重组质粒pCUbi-GUS-arf13’-UTR，酶切鉴定；将正确的重组质粒导入农杆菌LBA4404，用于农杆菌转化；
所述转基因植物为转基因水稻。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所编码的arf1基因3′-UTR的核苷酸序列整合到宿主基因组中，随宿主基因组表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：其是将编码arf1基因3′-UTR的核苷酸序列整合在宿主基因组中目的基因的3′端。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述宿主为水稻。
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Citations (2)
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Non-Patent Citations (3)
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| Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:J013092P04, full insert sequence;Kikuchi,S et al.;《Genbank Datebase》;20081204;全文 * |
| 烟草根特异NtR19基因终止子的克隆及功能分析;蔡翠雅等;《分子植物育种》;20141231;第12卷(第3期);466-471页 * |
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