CN105132297A - 一种可表达gfp的生防菌株fz01-gfp在靶标害虫流行病学中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可表达绿色荧光蛋白(GFP)的生防菌玫烟色拟青霉在靶标害虫流行病学中的应用。该生防菌通过原生质体转化技术，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得了一株可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP。该菌株用于靶标害虫流行病学的研究：释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本，通过质粒载体pCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析数据，确定生防菌FZ01-GFP对靶标害虫侵染的发生规律和流行趋势。解决了目前生防菌流行病学研究中靶标害虫病因鉴定困难的问题。具有步骤简单，操作方便，能有效监测和客观反映生防菌玫烟色拟青霉对靶标害虫发生发展规律等优点。

Description

一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用

技术领域

本发明涉及农作物害虫病原真菌流行病学研究领域，特别涉及一种可表达GFP的生防菌株玫烟色拟青霉FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用。

背景技术

近年来，我国对农业有害生物的生物防治给以了极大的重视。但目前关于生防菌的基础研究比较薄弱，特别是对靶标害虫病原性真菌的流行病研究还缺乏有效合理的技术手段，这严重阻碍了生防菌的利用和发展。

玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)属于半知菌纲，壳霉目、杯霉科。其地理分布广泛,昆虫寄主多样,是蚜虫、粉虱等重要害虫的致病真菌。在自然条件下，可在蔬菜、水果和园林植物等的靶标害虫种群中形成流行病。如在我国南方地区蔬菜植物上的烟粉虱种群中可大面积地持续流行、能有效地控制烟粉虱种群的危害。在国外玫烟色拟青霉已被开发为商品用于防治烟粉虱。然而，关于该生防菌对靶标害虫的侵染和流行病学研究还是空白，最主要的就是无法简便、有效进行害虫病因的鉴别，特别是针对该属中某一特定菌株的流行规律与控制评价，目前还缺乏快捷、可靠的技术进行大规模检测应用。

发明内容

本发明目的是针对目前温室害虫病原真菌流行病学研究中，现有技术无法对靶标害虫致死病因进行有效、快捷、可靠鉴别分析，特别是对生防菌某一特定菌株的流行规律和防控效果评价缺乏可实施的简单方法，提出了一种可表达GFP(绿色荧光蛋白)的FZ01-GFP生防菌株及其应用。

本发明具体的技术方案如下：

本发明提供一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP，该生防菌株为采用原生质体的遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP。

本发明还包括上述生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，具体过程包括：

释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本，通过质粒载体pCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析数据，确定靶标害虫发生规律和生防菌FZ01-GFP流行趋势。

其中，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本的具体步骤为：

每处理固定5点，每点连续调查3株，总计15株番茄，在早晨成虫不大活动时，检查每植株3片叶片的背面，每周固定同一天调查虫口情况，记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本；

优选的，在本发明中，对罹病样本进行PCR分子检测的特异引物如SEQIDNO.1-2所示：

SEQIDNO.1：5′-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3′；

SEQIDNO.2：5′-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3′。

本发明中，PCR分子检测鉴别的具体步骤包括：

(1)单头样品DNA提取；

(2)PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl10×PCR反应缓冲液，各0.5μl10μmol/L所述引物，和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min；

(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***上检测并拍照，根据扩增产物的有无和片段大小判定结果，进一步鉴定致死病因。

具体地，鉴定致死病因的标准为：特异性地扩增出417bp条带时，判断靶标害虫病因为FZ01-GFP生防菌株侵染致死，无417bp条带则判断为非FZ01-GFP生防菌侵染。

本发明的关键性技术是采用原生质体遗传转化方法，将表达载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得了一株可表达绿色荧光蛋白的菌株(FZ01-GFP)。在温室内通过特定时间进行菌株释放，经科学的采样方法，并以质粒特异引物对罹病样本病因是否由FZ01-GFP菌株侵染所致可进行大规模的PCR分子检测鉴别，结果快捷、可靠。本发明以2014年室内玫烟色拟青霉菌FZ01-GFP侵染试验所采集的烟粉虱50份罹病样本为供试材料，对害虫病因是否为FZ01-GFP菌株侵染引起进行分析，按上述PCR体系和鉴定方法，结果都能特异性地扩增出417bp目的条带，证实该方法可用于玫烟色拟青霉流行病学研究中快速可靠的检测和鉴定。

本发明方法适用于玫烟色拟青霉流行病学研究中大量靶标害虫病因的快速鉴别，对于生物防治中生防菌的流行病学研究和防控效果评价具有重要的实用价值。也可应用于生防菌侵染机制、毒力效价评估、田间调查，为防治策略的制定提供科学依据。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强，可靠性高：本发明分子PCR检测引物是以转化pCT74-GFP质粒为模板，特异性强。已经对50个样本鉴定验证，结果证实所设计的两对引物特异性强，灵敏度高，样品DNA含量1pg以上即可检测出。

2、简便快速，实用性强：应用本发明方法对烟粉虱DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般100个样品整个检测过程可在4小时内完成。本方法可满足大量样品快速检测的需要。

3、适应性广、费用不高：本发明也可应用于侵染机制、毒力效价评估、田间调查等领域。

附图说明

图1玫烟色拟青霉FZ01在不同浓度潮霉素PDA生长情况；

图2玫烟色拟青霉FZ01原生质体形态；

图3玫烟色拟青霉FZ01-GFP孢子在光学显微镜(左)和荧光显微镜(右)的对照图片；

图4玫烟色拟青霉FZ01-GFP菌丝在荧光显微镜的特征图片；

图5玫烟色拟青霉FZ01-GFP转化子基因组DNA扩增图，用质粒特异引物扩增出目的片段在1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中：M为100bpDNAmarker；417bp为目的条带；

图6GFP转化后玫烟色拟青霉(FZ01-GFP)侵染烟粉虱结果；

图7单季西红柿大棚玫烟色拟青霉FZ01-GFP对靶标害虫烟粉虱的流行趋势；

图8为不同浓度样品DNA的PCR检测扩增图；其中1-6DNA浓度分别为每微升分别为10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001ng；

图9为部分烟粉虱罹病样品PCR扩增检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：玫烟色拟青霉菌株FZ01的GFP转化

1材料：

1.1菌株和质粒

玫烟色拟青霉FZ01由本研究室2013年在福州东郊从野外烟粉虱罹病体内经分离获得并保存。质粒pCT74-GFP由福建省农科院资源所惠赠，含有真菌Pyrenophoratriticireperttis的ToxA启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因(hygr)。

1.2培养基、试剂和酶

1.2.1培养基LB培养基：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15g、水1000mL、pH7.0；PDB培养基：马铃薯200g、蔗糖20g，水1000mL；PDA：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂粉15g、水1000mL；再生半固体培养基：马铃薯200g、山梨醇182g、琼脂9g、水1000mL。

1.2.2酶制剂崩溃酶(Drislase，购自Sigma公司)，溶壁酶(LysingEnzyme，购自广东微生物所)。

1.2.3稳渗剂0.8mol·L^-1NaCl，山梨醇溶液：STC，含1.2mol·L^-1山梨醇、10mmol·L^-1Tris-HCl(pH7.5)、50mmol·L^-1CaCl₂，PTC溶液：40％PEG4000、10mmol·L^-1Tris-HCl(PH7.5)、50mmol·^-1CaCl₂。

1.2.4抗生素氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，潮霉素B(hygromycinB，HmB)。

1.3菌株对潮霉素B(HmB)的敏感性测定

将菌丝分别接种到含有不同浓度(0ug·mL^-1、50ug·mL^-1、100ug·mL^-1、u、200ug·mL^-1、250ug·mL^-1)潮霉素B的PDA培养基上，28℃培养6d，观察菌丝的生长状态，以确定抗生素的最低抑菌浓度，为转化后的原生质体培养提供合适的潮霉素B浓度。

1.4质粒的提取

从LB平板中挑取活化培养24h的质粒pCT74的单菌落到含有50ug·mL^-1氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基，于37℃、300r·min^-1过夜培养。质粒DNA提取方法按PlasmidMiniKit(QIAGEN)试剂盒的操作步骤进行。

1.5原生质体制备

从培养皿上挑取孢子制成浓度约为1×10⁷cfu·L^-1孢子悬浮液，取1-2mL到PDB培养基三角瓶中，28℃、150r·min^-1摇床培养24-36h。培养液经3层擦镜纸过滤收集菌丝，0.8mol·L^-1NaCl充分洗涤。取200-400mg菌丝体加5-10mL裂解液(包含20mg·mL^-1崩溃酶和20mg·mL^-1溶壁酶，酶液用冷的的NaCl配置，28℃、轻微振动溶解30min，用0.22pm的微孔过滤器过滤)，28℃消化2-3h。用3层擦镜纸集滤液，室温3000r·min^-1离心10min，弃上清液加10mLSTC溶液5000r·min^-1离心10min，弃上清用1mLSTC溶解转入2mL离心管中，室温3500r·min^-1重复离心10min，调整原生质体浓度为10⁷个·mL^-1。

1.6原生质体的转化

取5ug质粒DNA与200uL原生质体在离心管中混匀，室温静置20min，加入1mL40％PTC，轻轻混匀，室温放置20min。然后加入到100mL冷却至50℃左右的含0.9％琼脂再生半固体培养基中平板上(培养基中含50ug·mL^-1Amp和150ug·mL^-1HmB)，28℃倒置培养3-5d后获得转化子。

1.7转化子的荧光稳定性分析及PCR检测

接种第一代转化子的少量菌丝于普通PDA培养基上培养3d后，挑取边缘菌丝重复转接3-5代，再接种到含200ug·mL^-1潮霉素B的PDA培养基上，以不加潮霉素B的为对照，观察菌落生长，并保存性状稳定的转化子。随机选取15个性状稳定转化子，以野生菌株为对照，采用真菌提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，采用引物SEQIDNO.1-2扩增，产物片段大小417bp。PCR扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸45s，35个循环；最后于72℃延伸7min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶图像分析***观察。

2检测结果:

2.1菌株FZ01在潮霉素B浓度高于150ug·mL^-1的PDA培养(见图1)

2.2原生质体制备与转化

采用10mL裂解液左右所得到的原生质体大小不一、圆球形，符合转化要求的原生质体可达90％以上(图2)。采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化，每微克质粒可获得4-6个转化子。

2.3转化子的荧光稳定性分析及PCR检测

通过荧光显微镜观察了菌丝、产胞细胞及分生孢子的荧光强度，均发光良好(图3-4)，说明该gfp基因已经转入。

继代培养后的转化子基因组DNA采用引物SEQIDNO.1-2进行PCR扩增，结果表明转化子均扩增出1条417bp目的片段(图5)。

实施例2：蔬菜温室害虫流行病学研究中生防菌FZ01-GFP释放和样本的调查采集方法

1材料：

1.1试验药剂生防菌株玫烟色拟青霉FZ01-GFP孢子悬浮液(10⁷个·mL^-1)。

1.2试验地基本情况:福建农科院植保所抗性圃塑料大棚西红柿保护地栽培，处理区选择连续排列2个大棚，(1处理，1重复)，对照区(1对照)相隔300m，每个大棚面积200m²，参试面积计600m²。

1.3试验处理试验处理安排如表1所列

1.4施药方法2014年3-4月大棚种植间期，处理区采用手动喷雾器均匀喷雾每周一次，共3次，每m²药液量15ml,，对照区清水喷雾。

1.5调查内容与方法

1.5.1调查时间安排在温室靶标害虫烟粉虱活动季节(6-8月)，每周调查一次，共进行12次调查。

1.5.2调查方法每处理固定5点，每点连续调查3株，总计15株番茄，在早晨成虫不大活动时，检查每植株3片叶片的背面。每周固定同一天调查虫口情况，记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本。

1.5.3检测与统计学方法通过质粒载体pCT74-GFP的一对特异引物SEQIDNO.1-2对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，致病率＝(虫口PCR检出数/虫口总数)x100％；使用SPSS15.0软件对数据进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

根据每次虫口调查数据和真菌PCR检查结果，对生防菌致病率进行统计，得到单季生产期间西红柿蔬菜大棚中生防菌玫烟色拟青霉对靶标害虫烟粉虱的流行趋势(见图7)

实施例3：引物的灵敏性检测

1.DNA浓度稀释：提取由FZ01-GFP菌株侵染的烟粉虱样本基因组DNA，经Thermo紫外分光光度计测定浓度后，六个样品采用系列浓度(10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001ng/μl)稀释。

2.检测结果：如图8所示，在20μl反应体系中，六个样品烟粉虱基因组DNA除第6样品无明显扩增目的带外，其余样品均扩增出明显的目的条带，检测灵敏度可达1pg。

实施例4：质粒引物对单头罹病烟粉虱样本的特异性扩增

材料：本发明以2014年室内玫烟色拟青霉菌FZ01-GFP侵染试验所采集的烟粉虱50份罹病样本为供试材料，对害虫病因是否为FZ01-GFP侵染引起进行分析。

1.烟粉虱罹病样品单只DNA提取

将单头烟粉虱样品小心置入PCR管底部，利用自制电动研磨器具(自制研磨棒+小型电转)，研磨棒头粘少许DNA提取液(1％SDS，10mmol/LTris-HCl，pH8.0，25mmol/LNaCl，5mmol/LEDTA)，置于PCR管底部与样品接触，研磨15秒后，每管中加入40ul提取液和2ul蛋白酶K液，混匀备用；将研磨混匀后的样品在58℃下水浴20min，然后加入预冷的无水乙醇80u1，轻轻混匀，-20℃沉淀10min；沉淀后的样品在12000r/min离心3min，弃上清液，自然或通风晾干，加入TE溶液(40μl)，保存备用即可。

2.烟粉虱罹病样品病因PCR检测鉴别

PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl10×PCR反应缓冲液(含2.0mmol/LMg²⁺、0.5μl10μmol/L4×dNTPs，0.2μl5UTaqDNA聚合酶)，10μmol/L各0.5μlSEQIDNO.1-2所示的引物和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min。

SEQIDNO.1：5′-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3′；

SEQIDNO.2：5′-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3′。

将3μlPCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***上检测并拍照，根据扩增产物的有无和片段大小判定结果。

3.检测结果

检测的特异性：可特异扩增出417bp条带为FZ01-GFP菌株侵染；而非FZ01-GFP侵染则无特异条带，具有很强的特异性(图9)。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，其特征在于，采用原生质体的遗传转化方法，将带有绿色荧光蛋白标记的表达质粒载体pCT74-GFP转入玫烟色拟青霉菌株FZ01基因组中，获得可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP；

所述FZ01-GFP生防菌株应用于靶标害虫流行病学中的具体过程为：释放所述FZ01-GFP生防菌株，定时定点采集、记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本，通过质粒载体pCT74-GFP的一对特异引物对罹病样本进行PCR分子检测鉴别，分析数据，确定生防菌FZ01-GFP对靶标害虫侵染的发生规律和流行趋势。

2.根据权利要求1所述可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，其特征在于，定时定点采集、记录靶标害虫数量，并收集罹病害虫样本的具体步骤为：

每处理固定5点，每点连续调查3株，总计15株，在早晨成虫活动不活跃时，检查每植株3片叶片的背面，每周固定同一天调查虫口情况，记录靶标害虫数量，收集罹病害虫样本。

3.根据权利要求1所述可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，其特征在于，所述对罹病样本进行PCR分子检测的特异引物如SEQIDNO.1-2所示：

SEQIDNO.1：5′-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3′；

SEQIDNO.2：5′-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3′。

4.根据权利要求1所述可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，其特征在于，所述PCR分子检测鉴别的具体步骤包括：

(1)单头样品DNA提取；

(2)PCR扩增：PCR反应体系20μl，包括2.0μl10×PCR反应缓冲液，各0.5μl10μmol/L所述引物，和2μl模板DNA，ddH₂O补足20μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸40sec，共33个循环；72℃延伸5min；

(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***上检测，根据扩增产物的有无和片段大小判定结果，进一步鉴定致死病因。

5.根据权利要求1所述可表达GFP的生防菌株FZ01-GFP在靶标害虫流行病学中的应用，其特征在于，鉴定致死病因的标准为：特异性地扩增出417bp条带时，判断靶标害虫死亡病因为生防菌株FZ01-GFP侵染致死，无417bp条带则判断为非FZ01-GFP生防菌侵染。