CN105122065B - 多层荧光纳米颗粒及其制备和使用方法 - Google Patents

多层荧光纳米颗粒及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

一种多层的含荧光响应材料(FRM)的纳米颗粒以及包含此类纳米颗粒的组合物。所述纳米颗粒可以使用逐层沉积的方法制备。所述纳米颗粒可以用于成像方法，例如细胞成像方法。

Description

多层荧光纳米颗粒及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月20日提交的美国临时专利申请号61/767,066的优先权，其公开的内容通过引用并入本申请。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在由美国国土***提供的合同号为2009-ST-108-LR0004的政府支持下进行。政府享有本发明的一些权益。
发明领域
本公开通常地涉及分层的含荧光响应材料的纳米颗粒。更特别地，本公开涉及多层的含荧光响应材料的二氧化硅纳米颗粒。
背景技术
药物发现、药物筛选、基因表达和作为疫苗靶点的蛋白鉴定基于进行涉及大量分子的高通量筛选(HTS)测定。这需要筛选针对特定靶分子(如蛋白、抗体、核苷酸或肽)的较大的化合物库。筛选较大的库或生物多重测定(biological multiplexing)加速了用于治疗和诊断应用的工具的开发。生物多重测定涉及同时进行多项测定，而不损失敏感性和特异性。推行小型化的HTS导致每天筛选数以千计的化合物。从上到下的二维阵列制造技术导致了DNA芯片、微阵列和bioMEMS的发展。基于模式识别的位置编码进一步有助于鉴定特定的分子指纹。这些技术的一些主要缺点是它们就设备设置和试剂而言是昂贵的，且就样品制备和阵列制造而言是复杂的。而且，由于交叉反应性和重现性所导致的测量的变化性使得这些方法难以用于大规模分析。
此前已对使用基于颜色分配的珠粒技术进行多重编码的可能性进行了探索。使用两种有机染料在用于多重测定的8种不同的强度水平下对5.5μm聚苯乙烯珠粒编码。通过在适宜溶剂混合物中溶胀聚合物，合成了在6种不同的强度水平下以不同比例使用6种光谱可区分的CdSe/ZnS核-壳量子点纳米颗粒编码的1.2μm聚苯乙烯珠粒。在上述情况中的荧光物质均被物理地掺入微米尺寸的聚苯乙烯颗粒，并且由于其具有较大的尺寸，因而无法容易地用于体内多重或细胞内生物成像。基于可用反应位点的数量，通过使用不同比例的两种有机荧光团精确地标记DL-DNA，开发了基于树枝状大分子样DNA(DL-DNA)的荧光纳米条码。为了增强来自这些纳米条码的荧光信号，再次使用微珠作为成像和分子检测的载体。类似地，合成以不同染料比例将染料编码的70nm的基于荧光共振能量转移(FRET)的二氧化硅纳米颗粒，并将其负载于10μm的链霉亲和素涂覆的微球上。通过开发以不同染料比例将染料编码的>100nm的基于(FRET)的二氧化硅颗粒(随后将所述二氧化硅颗粒负载于作为多重测定底物的10μm聚苯乙烯微球上)，将这项工作推广并应用于在组合化学中的光学编码。基于加入反应混合物中的染料并假定掺入所有的染料，从而量化在这些基于FRET的颗粒中编码的染料比例。由于最终珠粒的较大的尺寸(>1μm)，这些情况均未显示出细胞内成像。
因而，需要制备多重编码的颗粒，其中FRET被抑制以获得所需水平的颗粒亮度，并且因此获得所需的信噪比，所述颗粒的尺寸为约100nm或更小，并且由于尺寸低于100nm的颗粒特别适用于细胞摄取，因此所述颗粒能够用于体内和体外应用，并且因此是细胞内成像应用所需的。
发明概述
本文公开了具有任选的表面PEG涂层(用于使用不同的部分(如蛋白、核酸、小分子)官能化)的多色荧光二氧化硅纳米颗粒(在本文中也称为多层的含荧光响应材料(FRM)的纳米颗粒、mcC点和三色C点以及多色C点)。可以将多色荧光二氧化硅纳米颗粒称为亮多色荧光二氧化硅纳米颗粒。例如，含有在两个、三个或更多个不同强度水平下的两种、三种或更多种光谱不同的染料的纳米颗粒具有低于100nm的尺寸。所述多色荧光二氧化硅纳米颗粒可以用于例如细胞内生物成像、高通量筛选和医学诊断。
在一个实施方式中，所述二氧化硅纳米颗粒含有染料N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACm(蓝色))、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMRm(绿色))和Cy5-马来酰亚胺(Cy5m(红色))。这些染料以每种染料三个强度水平(无染料、低染料或高染料)而被包含。对颗粒构造进行设计，以控制每种颜色的染料数量，并且使得染料之间的能量转移最小化以获得最大亮度。三种染料在三个强度水平的这种组合使得基于波长和荧光强度合成了26种可区分的颗粒。与游离染料相比，所述纳米颗粒具有1至3个数量级的荧光亮度增强。具有高染料负载的纳米颗粒的亮度是具有中等染料负载的颗粒的～3.5-4倍。在该体系中，通过掺入额外的二氧化硅壳由中等染料负载移至高染料负载不会减少所述纳米颗粒的相对荧光发射。
进行制备多色荧光二氧化硅纳米颗粒的方法，使得例如染料以逐层的方式加入掺杂染料的颗粒的核，并且每种光谱不同的染料由纯的二氧化硅壳空间分隔，以降低染料之间的能量转移。
在一个实施方式中，合成所述纳米颗粒，使得三种染料以逐层的方式加入，其中绿色在核中，然后是在内壳中的红色，然后蓝色作为最后的染料层加入。但是，在不影响所述纳米颗粒性能的情况下，可以进行任意顺序的染料加入。染料层由足够厚的二氧化硅壳空间分隔，以有效抑制染料层之间的能量转移。因此，每个单独的颗粒均具有洋葱型结构，所述洋葱型结构具有例如在染料核周围的多达24个不同的层。
附图简述
图1：(a)将三种染料TMRm(绿色)、Cy5m(红色)和DACm(蓝色)掺入二氧化硅纳米颗粒(中心)的逐层方法以及基于每种染料的包封水平(分别为0、5、20个染料)的可能组合的示意图。简言之，具有中等染料负载(～5个染料/颗粒，浅色)和高染料负载(～20个染料/颗粒，深色)的颗粒以浅色/深色的绿色、红色和蓝色显示。(b)拍摄的在水中的26个合成的核-壳多色荧光纳米颗粒的照片，所述26个合成的核-壳多色荧光纳米颗粒以不同的行排列为无TMRm的颗粒(无绿色，下面一行)、具有～5TMRm的颗粒(较低的绿色染料负载，中间一行)和在核中的具有～20TMRm染料的颗粒(高的绿色染料负载，上面一行)。注意最下面一行(左侧)的第27个比色皿显示了无任何染料(即具有颜色组合0,0,0)的纯二氧化硅颗粒的溶液。(c)图1b中显示的纳米颗粒的要点。空白表示作为对照的无任何染料的纯二氧化硅颗粒。TMRm(绿色)、Cy5m(红色)和DACm(蓝色)。
图2：多色C点(mcC点)合成的示意图：(a)对具有不同的每个颗粒的平均染料数的合成批次的泊松分布之间的重叠进行比较的图，参见图例。曲线的顺序从左至右为：5、10、15、20个染料/颗粒。(b)三种染料TMRm(1)、Cy5m(2)和DACm(3)的马来酰亚胺衍生物与(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷反应以获得分别的染料-硅烷缀合物的通用反应示意图。(c-e)单色C点的逐层染料添加：TMRm颗粒(G)、Cy5m颗粒(R)和DACm颗粒(B)，随后加入5k摩尔质量的聚乙二醇硅烷(PEG-硅烷)作为最后的层；(f-h)由G和R单色C点起始的具有不同亮度水平的双色mcC点((f)为G和R组合、(g)为G和B组合，且(h)为R和B组合)的逐层方法，随后使用PEG-硅烷封端；和(i)由含有双色C点的G和R起始的使用PEG-硅烷封端的三色C点的逐层方法。
图3：单色C点的表征。图(a-c)对中等和高染料负载的纳米颗粒与(a)TMRm、(b)Cy5m和(c)DACm的母体游离染料的吸光度和荧光光谱进行比较。游离染料的溶液和颗粒的溶液在这些测量之前是吸光度匹配的。图(d-f)对在溶液中的游离染料(实线)的FCS自相关曲线与中等(空心圈)和高(实心圈)染料负载的纳米颗粒：(d)TMRm、(e)Cy5m和(f)DACm的FCS自相关曲线进行比较。图(g-i)对(g)TMRm体系、(h)Cy5m体系和(i)DACm体系的如由FCS检测器数据集测得的每种荧光物质的亮度(染料vs颗粒)进行比较。
图4：mcC点的表征。(a)在溶液中的获得三色C点的特定颗粒中间体的代表性FCS曲线，其覆盖了从中等/高TMRm染料负载的单色C点(mG，绿色空心圈/hG，绿色实心圈)起始，经由中等/高Cy5m染料负载的双色C点(hGmR，红色空心圈/hGhR，红色实心圈)，至具有中等/高DACm染料负载的最终三色C点(hGhRmB，蓝色空心圈/hGhRhB，蓝色实心圈)的整个合成路线。蓝色(左侧曲线)、绿色(中间曲线)、红色(右侧曲线)。(b)由蓝色(左)、绿色(中)和红色(右)激发获得的三色C点的代表性荧光发射光谱。(c)由稳态荧光发射光谱测定的26个荧光二氧化硅纳米颗粒中的每一个的实验强度性质的总结。绿色柱表示来自TMRm的发射、红色柱表示来自Cy5m的发射，蓝色柱表示来自DACm的发射。柱的高度表示发射强度水平。
图5：显示通道的在RBL-2H3肥大细胞中的mcC点的共聚焦荧光显微图像，(a)绿色Ch：560nm，(b)红色Ch：633nm，(c)蓝色Ch：405nm，(d)黄色Ch：488nm；(e)(a、b、c和d)的重叠图像，(f)亮场图像。
图6：显示含有至多17种不同颗粒的细胞的单一512x 512混合颗粒图像图块。(a-d)图像在红色、绿色、蓝色和黄色通道同时采集。(e)叠加全部四个荧光图像以显示颗粒实际上在细胞内。(f)在亮场采集的图像。
图7：将17种光谱不同的多色纳米颗粒装载进入大鼠嗜碱性白血病细胞中。(a)显示多颗粒样品成功“解码”的细胞的全尺寸(1280x 1280像素)假彩色图像，所述细胞各自负载17种单“色”mc C点中的1种。说明颗粒组成和所指定的细胞颜色的颜色-编码图例在右下角显示。(b)相同图像的放大区。
发明详述
本公开提供了多层的含荧光响应材料(FRM)的纳米颗粒。还提供了制备和使用所述多层的含FRM的纳米颗粒的方法。
本公开的多层的含FRM的纳米颗粒提供了能够通过特定的FRM及FRM水平而唯一识别的纳米颗粒。具有用于识别的内置码的纳米颗粒能够作为分子运载体和标签。特定的FHM/水平组合(可以将其描述为光学“条码”)能够通过其荧光发射(例如以图像的形式)识别。例如，在具有不同FHM/水平组合的多层的含FRM的纳米颗粒的混合物中，每个不同的FHM/水平组合能够得以唯一识别。每个可区分的颗粒类似于2-D阵列技术中的单一孔或阵列。因此多重测定不受孔或阵列数量的限制，但是受可区分的颗粒的数量的限制。纳米颗粒的构造使层内和层间FRM的荧光淬灭最小化。这通过有效使用颗粒中的所有荧光染料而提供了具有所需的亮度的纳米颗粒，从而在光学/荧光检测方案中产生所需的信躁比水平。
在一个方面，本公开提供了多层的含FRM的二氧化硅纳米颗粒。所述纳米颗粒包含能够以一种或多种量(即水平)存在的一种或多种荧光响应材料(FRM)。所述纳米颗粒的尺寸(例如直径)可以是5nm至500nm，包括其间所有的整数值和范围。
本文提及多层的含FRM的纳米颗粒旨在包括多层的含染料的纳米颗粒。本申请中提及的无FRM的二氧化硅层旨在包括无染料的二氧化硅层。本文提及含FRM的二氧化硅层旨在包括含有染料的二氧化硅层。本文提及最外的无FRM的二氧化硅层旨在包括最外的含染料的二氧化硅层。本文提及FRM旨在包括染料分子。本文提及FRM-缀合物前体旨在包括染料-缀合物前体。本文提及最外的含FRM的二氧化硅层旨在包括最外的含染料的二氧化硅层。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒包含二氧化硅核、1至100个含FRM的二氧化硅层、一个或多个无FRM的二氧化硅层、设置于最外的含FRM的二氧化硅层上的最外的无FRM的二氧化硅层，和与所述最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个聚(乙二醇)分子；所述二氧化硅核含有与所述核的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分子，每个含FRM的二氧化硅层均包含与所述含FRM的二氧化硅层的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分子，所述无FRM的二氧化硅层之一将所述二氧化硅核与所述含FRM的二氧化硅层之一分隔，并且，如果存在，所述含FRM的二氧化硅层的每个相邻对被所述无FRM的二氧化硅层之一所分隔。所述纳米颗粒还可以包含与共价结合至所述最外的无FRM的二氧化硅层的外表面的所述聚(乙二醇)分子共价结合的一个或多个部分(例如蛋白、肽、核酸、适体、抗体、抗体片段、聚合物、有机小分子及其组合)。所述纳米颗粒能够具有的直径为5nm至500nm，包括其间所有的整数nm值和范围。每个无FRM的二氧化硅层的厚度(例如1nm至20nm)使得在所述核中的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM之间具有低于10％的可检测的能量转移。
在另一个实施方式中，所述纳米颗粒包含二氧化硅核、1至100个含FRM的二氧化硅层、一个或多个无FRM的二氧化硅层，和设置于最外的含FRM的二氧化硅层上的最外的无FRM的二氧化硅层；所述二氧化硅核含有与所述核的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分子，每个所述含FRM的二氧化硅层均包含与所述含FRM的二氧化硅层的二氧化硅网络共价结合的多个FRM分子，所述无FRM的二氧化硅层之一将所述二氧化硅核与所述含FRM的二氧化硅层之一分隔，并且，如果存在，所述含FRM的二氧化硅层的每个相邻对被所述无FRM的二氧化硅层之一所分隔。所述纳米颗粒能够具有的直径为5nm至500nm，包括其间所有的整数nm值和范围。每个无FRM的二氧化硅层的厚度(例如1nm至20nm)使得在所述核中的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM之间具有低于10％的可检测的能量转移。
在一个实施方式中，每个无FRM的二氧化硅层可以设置于二氧化硅核或含FRM的二氧化硅层上。
在另一个实施方式中，所述纳米颗粒包含a)二氧化硅核，所述二氧化硅核含有与所述核的二氧化硅网络共价结合的多个FRM；和b)围绕所述二氧化硅核的无FRM的二氧化硅层与含FRM的层的交替的层。最外层是无FRM的二氧化硅层或含FRM的层。任选地，多个聚醚分子共价结合最外的无FRM的二氧化硅层或含FRM的层的外表面。
所述核的形状基本上是球形，并且其尺寸(例如直径)可以为1nm至20nm，包括其间的所有整数nm值。所述核具有能够与所述核的氧化硅网络共价结合的多个荧光响应材料(例如荧光响应分子，如染料分子和颜料分子)。
所述无FRM的二氧化硅层设置于所述核和/或含FRM的二氧化硅层上。在该层中无可检测的FRM。该层至少部分地覆盖所述核和/或含FRM的二氧化硅层。在一个实施方式中，所述层是完全覆盖所述核和/或含FRM的二氧化硅层的连续的层。所述纳米颗粒可以具有1至99个无FRM的二氧化硅层，包括其间的所有整数层数和范围。
每个无FRM的二氧化硅层分隔所述核与一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层(即减少其间的能量转移)。在各种实施方式中，每个无FRM的二氧化硅层的厚度使得在所述核中的FRM分子与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM分子之间具有10％或更低、5％或更低、4％或更低、3％或更低、2％或更低或者1％或更低的可检测的能量转移。在一个实施方式中，每个无FRM的二氧化硅层的厚度使得在所述核中的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM之间无可检测的能量转移。可以通过本领域已知的方法测量在所述核中的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM之间的能量转移。例如，可以通过激发在较低波长下吸收的一种FRM(例如一种染料物质)(供体)并检测另一种FRM(例如另一种染料物质)(受体)的发射而测量能量转移，所述另一种FRM的吸收光谱与所述供体染料的发射光谱之间具有重叠。另一种方法是在不存在和存在受体FRM(例如染料)的情况下测量供体FRM(例如染料)的发射强度。如果FRET发生在供体和受体之间，则供体的发射被抑制。例如，所述无FRM的二氧化硅层可以为1nm至20nm，包括其间的所有整数nm值和范围。
所述含FRM的二氧化硅层设置于无FRM的二氧化硅层上。该层至少部分地覆盖所述无FRM的二氧化硅层。在一个实施方式中，所述层是完全覆盖所述核和/或含FRM的二氧化硅层的连续的层。在一个实施方式中，每个无FRM的二氧化硅层具有单一类型的FRM。所述纳米颗粒可以具有1至100个含FRM的二氧化硅层，包括其间的所有整数层数和范围。所述含FRM的二氧化硅层可以具有小于1nm至20nm的厚度。在一个实施方式中，所述含FRM的二氧化硅层具有1nm至20nm的厚度，包括其间的所有整数nm值和范围。最外的无FRM的二氧化硅层设置于最外的含FRM的二氧化硅层上。该层至少部分地覆盖最外的含FRM的二氧化硅层。在一个实施方式中，所述层是完全覆盖所述核和/或含FRM的二氧化硅层的连续的层。该层具有1nm至20nm的厚度，包括其间的所有整数nm值和范围。
所述核、含FRM的二氧化硅层和无FRM的二氧化硅层具有网络结构。所述网络可以由二氧化硅前体的缩合形成。在一个实施方式中，所述网络是二氧化硅网络。所述核的二氧化硅网络可由二氧化硅前体(例如TMOS和TEOS)的缩合形成。适宜的前体可以采用已知的方法制备，并可以由市售来源获得。
可以使用能够与所述纳米颗粒的氧化硅网络共价结合的任意荧光响应材料(例如染料和颜料)。FRM的示例包括染料分子。适宜的荧光响应材料可以采用已知的方法制备，并可以由市售来源获得。
多种适宜的化学反应性荧光响应材料是已知的，参见例如MOLECULAR PROBESHANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS,6th ed.,R.P.Haugland,ed.(1996)。典型的荧光团是例如荧光芳族或杂芳族化合物，如芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、恶唑或苯并恶唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、花青、羰花青、喹诺酮、卟啉、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、甘菊蓝、苝、吡啶、喹啉、香豆素(包括羟基香豆素和氨基香豆素及其氟化衍生物)，和类似的化合物，参见例如美国专利号5,830,912；4,774,339；5,187,288；5,248,782；5,274,113；5,433,896；4,810,636；和4,812,409。
例如，所述染料是有机染料。适宜的有机染料的示例包括但不限于呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红、德克萨斯红和Cal Fluor染料)、花青衍生物(例如，花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青、部花青和Quasar染料)、萘衍生物(例如，丹酰和氟硅酸钠衍生物)、香豆素衍生物、恶二唑衍生物(例如，吡啶恶唑、硝基苯并恶二唑和苯并恶二唑)、芘衍生物(例如，级联蓝)、恶嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170)，吖啶衍生物(例如，普鲁黄素、吖啶橙、吖啶黄)，芳基次甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫、孔雀绿)、四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁和胆红素)、CFTM染料(Biotium)、(Invitrogen)、ALEXA(Invitrogen)、DYLIGHTTM(Thermo Scientific,Pierce)、ATTOTM和TRACYTM(Sigma Aldrich)、(Interchim)、其衍生物等。
使用具有与常用的激发和/检测波长对应的吸收和/或发射光谱的荧光响应材料是理想的。例如，具有与市售成像***中所使用的激发和/检测波长对应的吸收和/或发射光谱的荧光响应材料。例如，所述纳米颗粒可具有带有红色、绿色、蓝色发射波长或其组合的FRM。在一个实施方式中，所述荧光响应材料是选自下组的荧光染料：N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)(DAC)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR)、Cy5、N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACm)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMRm)、Cy5-马来酰亚胺(Cy5m)或其组合。
所述FRM与所述核或含FRM的层的纳米颗粒二氧化硅网络共价结合(例如直接地或经由连接基团)。所述FRM可以通过例如酯键、酰胺键或硫醚键经由连接基团直接与二氧化硅网络共价结合。例如，FRM(例如染料分子)可以通过连接基团与溶胶-凝胶前体(例如官能化的烷基(三烷氧基)硅烷)共价结合，并且将该FRM-缀合物前体用于生产所述核或含FRM的二氧化硅层。在一个实施方式中，所述FRM通过马来酰亚胺-巯基缀合物与氧化硅网络共价结合。可以采用本领域已知的方法在FRM与溶胶-凝胶前体(例如官能化的烷基(三烷氧基)硅烷)之间形成一个或多个共价键。
当在水溶液中测量各荧光发射时，在所述纳米颗粒中的FRM(例如染料分子)(即与所述核或含FRM的层的纳米颗粒二氧化硅网络共价结合)具有比游离FRM的荧光发射强度(即亮度)更高的荧光发射强度(即亮度)。在各种实施方式中，当在水溶液中测量各荧光发射时，在所述纳米颗粒中的一种或多种或全部FRM(例如染料分子)的荧光发射强度是游离FRM(例如染料分子)的10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、5倍、10倍或20倍。
可以将最外的无FRM的二氧化硅层钝化，以使得所述纳米颗粒空间稳定化以对抗在生理缓冲溶液中与其他纳米颗粒的聚集。例如，所述纳米颗粒具有多个聚合物基团，如与该层的外表面共价结合的聚醚基团。聚醚基团可以衍生自聚醚分子或官能化的聚醚分子。在一个实施方式中，所述聚醚基团是PEG基团。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒具有多个与该层的外表面共价结合的聚(乙二醇)(PEG)基团。所述PEG基团可以衍生自PEG分子或官能化的PEG分子。所述PEG基团与该层的二氧化硅网络共价结合。例如，所述PEG基团的分子量可以为400g/mol至10,000g/mol。所述PEG基团覆盖最外的无FRM的二氧化硅层的至少一部分。理想的是所述PEG基团覆盖该层的至少一部分，使得所述纳米颗粒空间稳定化以对抗在生理缓冲溶液中的聚集。
所述PEG基团中的一个或多个可以具有与所述基团(即PEG链)共价结合的部分。在一个实施方式中，全部的所述PEG基团均具有与所述PEG基团(即PEG链)共价结合的部分。所述纳米颗粒可以具有全部相同的部分或部分的组合。所述部分可以是靶向细胞结构(例如表面细胞结构或细胞内结构)的靶向部分。适宜部分的示例包括但不限于蛋白(例如蛋白亚基和蛋白结构域)、肽、核酸(例如单链DNA分子、双链DNA分子、单链RNA分子、双链RNA分子和分支的DNA分子)、适体(例如DNA适体、RNA适体和蛋白适体)、抗体、抗体片段、聚合物(例如树枝状大分子)、有机小分子(例如药物分子和有机化合物(如叶酸盐或叶酸))。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒不具有与最外的无FRM的二氧化硅层共价结合的聚醚基团(例如PEG基团)。
所述FRM(例如各染料)可以以不同的量(即水平)存在于所述纳米颗粒中。在所述纳米颗粒中存在的FRM是在任意的所述核和含FRM的二氧化硅层中存在的所有相同类型的FRM之和。在给定纳米颗粒中的FRM的量(即水平)可以表示为每个纳米颗粒中FRM(例如染料分子)的数量。理想的是染料的量使得在某纳米颗粒中FRM的水平可以不同于在不同纳米颗粒中相同FRM的水平。将不存在染料认定为是一个水平。在具有相同标称染料水平的纳米颗粒中存在的染料的量可以变化。在各种实施方式中，在所述纳米颗粒中FRM的量使得其与在存在的另一纳米颗粒中的相同FRM(例如构成另一光学条码)的量具有10％或更少的、5％或更少的、4％或更少的、3％或更少的、2％或更少的、1％或更少的重叠。在一个实施方式中，在所述纳米颗粒中FRM的量使得其与在存在的另一纳米颗粒中的相同FRM(例如构成另一光学条码)的量不具有重叠。
在另一个方面，本公开提供了一种包含所述纳米颗粒的组合物。所述组合物可以包含多个可区分(即可唯一识别)的纳米颗粒。在一个实施方式中，所述组合物包含多个纳米颗粒。在另一个实施方式中，组合物包含具有染料和/或染料水平的不同组合的多个纳米颗粒。例如，所述多个纳米颗粒中的每一个均具有水平为每个纳米颗粒0、5或20个染料的两种或三种染料(例如N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)(DAC)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR)、Cy5)。
在另一个方面，本发明提供了制备所述多层的含FRM的纳米颗粒的方法。在所述方法中，所述纳米颗粒通过将无FRM的二氧化硅层和含FRM的二氧化硅层层层沉积添加至核上形成。
在一个实施方式中，一种制备多层的含FRM的纳米颗粒的方法，包括步骤：a)将二氧化硅前体、多个单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成具有多个与所述二氧化硅核的二氧化硅网络缀合的FRM的二氧化硅核，b)将步骤a)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层；c)将步骤b)得到的材料与二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成含FRM的二氧化硅层；d)任选地，将步骤c)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层，并且将所得到的材料与二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成含FRM的二氧化硅层；e)任选地，将步骤d)重复所需的次数，其中所述接触是与从在此前进行的步骤d)中得到的材料接触；f)将步骤c)、d)或步骤e)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在最外的含FRM的层上形成最外的无FRM的二氧化硅层；和g)将步骤f)得到的材料与官能化的聚醚分子接触，以形成具有同所述纳米颗粒的最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个聚醚分子的纳米颗粒。在一个示例中，所述官能化的聚醚分子是官能化的PEG分子和所述聚醚基团是PEG基团。
在另一个实施方式中，一种制备多层的含FRM的纳米颗粒的方法，包括步骤：a)将二氧化硅前体、多个单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成具有多个与所述二氧化硅核的二氧化硅网络缀合的FRM的二氧化硅核，b)将步骤a)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层；c)将步骤b)得到的材料与二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成含FRM的二氧化硅层；d)任选地，将步骤c)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在所形成的含FRM的二氧化硅层上形成无FRM的二氧化硅层，并且将所得到的材料与二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以使得形成含FRM的二氧化硅层；e)任选地，将步骤d)重复所需的次数，其中所述接触是与从在此前进行的步骤d)中得到的材料接触；f)将步骤c)、步骤d)或步骤e)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在最外的含FRM的二氧化硅层上形成最外的无FRM的二氧化硅层。
在制备多层的含FRM的纳米颗粒的实施方法中，所述溶剂、碱、FRM缀合物前体和二氧化硅前体可以是本申请公开的任意物质。因而，所述溶剂、碱、FRM缀合物前体和二氧化硅前体针对各接触步骤可以是相同的，或者针对一个或多个所述接触步骤可以是不同的。
所述二氧化硅前体经历一个反应(如缩合反应)以形成二氧化硅网络。所述二氧化硅前体可以是四甲氧基硅烷(TMOS)或四乙氧基硅烷(TEOS)。所述前体可以采用本领域公知的方法制备或由市售来源获得。
所述FRM缀合物前体是FRM直接或通过连接基团与FRM缀合物部分共价结合的，所述FRM缀合物部分具有至少一个能够经历缩合反应的基团(例如烷氧基硅烷基团，如甲氧基硅烷或乙氧基硅烷)以使得所述FRM与所述核或含FRM的二氧化硅层的网络(例如二氧化硅网络)共价结合。例如，所述FRM缀合物部分是负载反应性基团如巯基(-S-H)的三烷氧基硅烷基团(例如-Si(OR)3，其中各R均是甲基或乙基)。所述连接基团可以来源于马来酰亚胺基团。所述FRM缀合物前体可以由公知的连接化学物质形成。在一个实施方式中，FRM缀合物前体是马来酰亚胺-巯基缀合物。例如，所述FRM直接或通过与FRM-马来酰亚胺缀合物上的马来酰亚胺基团的反应与3-巯基丙基-三甲氧基硅烷(MPTMS)缀合。在一个实施方式中，所述FRM是FRM-马来酰亚胺缀合物。例如，FRM-马来酰亚胺缀合物与3-巯基丙基-三甲氧基硅烷(MPTMS)反应以形成FRM缀合物前体。
所述官能化的聚醚分子(例如官能化的PEG分子)具有能够与最外的无FRM的二氧化硅层的最外的表面反应的官能团，以便将聚醚(例如PEG分子)与所述纳米颗粒最外的无FRM的二氧化硅层的最外的表面共价结合。例如，聚醚分子或PEG分子直接或通过连接基团与某一部分共价结合，该部分具有至少一个基团(例如烷氧基硅烷基团，如甲氧基硅烷或乙氧基硅烷)，其能够经历缩合反应，以使得所述聚醚分子或PEG分子与所述最外的无FRM的二氧化硅层的最外的表面的二氧化硅网络共价结合。适宜官能团的示例是三烷氧基硅烷基团(例如-Si(OR)3，其中各R均是甲基或乙基)。适宜接头基团的示例是(-O-CH2-CH2CH2-)。在一个实施方式中，所述功能性的PEG分子是甲氧基-PEG-硅烷(mPEG-硅烷)。
任选地，所述功能性的PEG分子能够具有与其共价结合的部分。此类功能性的PEG分子可以使用异双功能性的PEG分子形成。所述异双功能性的PEG分子至少具有一个能够与所述最外的无FRM的二氧化硅层的最外的表面上的官能团反应的官能团和一个能够与所述部分(或其官能化的形式)反应的官能团。
在核形成反应中，将二氧化硅前体、多个单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱(例如氨)在一定条件下反应(例如时间和温度)，以使得形成与二氧化硅核的二氧化硅网络缀合的具有多个FRM的多个二氧化硅核。
在无FRM的二氧化硅层的形成反应中，将所述核(例如在其中形成核的反应混合物)与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层。
在所述含FRM的二氧化硅层的形成反应中，将包含核和无FRM的二氧化硅层的所述纳米颗粒(例如在其中形成包含核和无FRM的二氧化硅层的所述纳米颗粒的反应混合物)与二氧化硅前体、与在所述核中的单一类型的FRM缀合物前体不同的单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以使得形成含FRM的二氧化硅层。
在所述含FRM的二氧化硅层的形成反应中，将二氧化硅前体的浓度保持在低于成核作用的阈浓度。在一个实施方式中，加入系列稀释的反应物以保持二氧化硅前体的浓度低于成核作用的阈浓度。使用TMOS是理想的，其与那些TEOS相比具有更快的水解反应动力学，以使其更易于将二氧化硅前体的浓度保持在成核作用的阈浓度以下。
任选地，在所述纳米颗粒上顺序重复进行所述无FRM的二氧化硅层的形成反应和含FRM的二氧化硅层的形成反应，其包含按照所述纳米颗粒核中心、无FRM的二氧化硅层和含FRM的二氧化硅层的顺序(例如在其中形成这些纳米颗粒的反应混合物)直至形成具有2至100个含FRM的二氧化硅层，包括其间的所有整数的含FRM的二氧化硅层和范围。在这些任选地含FRM的二氧化硅层的反应中，FRM与在任意其他含FRM的二氧化硅层的反应中使用的FRM可以是相同的或不同的。
在所述最外的无FRM的二氧化硅层的形成反应中，将具有核、一个或多个无FRM的二氧化硅层和一个或多个含FRM的二氧化硅层的所述纳米颗粒(例如在其中形成这些纳米颗粒的混合物)与二氧化硅前体和溶剂接触，以使得在所述最外的含FRM的二氧化硅层上形成最外的无FRM的二氧化硅层。
在所述PEG官能化反应(在本申请中也称为PEG化)中，将具有核、一个或多个无FRM的二氧化硅层、一个或多个含FRM的二氧化硅层和最外的无FRM的二氧化硅层的所述纳米颗粒(例如在其中形成这些纳米颗粒的反应混合物)与官能化的PEG分子接触，以使得形成具有与所述纳米颗粒最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个PEG分子的纳米颗粒。
在一个实施方式中，使用单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱形成二氧化硅核。使用二氧化硅前体和溶剂在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层。使用二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱在所述无FRM的二氧化硅层上形成含FRM的二氧化硅层。任选地，以交替的方式在距离二氧化硅核最远的所述含FRM的二氧化硅层上形成一个或多个无FRM的二氧化硅层和一个或多个含FRM的二氧化硅层。在所有含FRM的层形成后，使用二氧化硅前体和溶剂在距离二氧化硅核最远的所述含FRM的层上形成最外的无FRM的二氧化硅层。将最外的无FRM的二氧化硅层任选地与官能化的聚醚分子反应，以使得形成具有与所述纳米颗粒的最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个聚醚分子的纳米颗粒。在一个示例中，所述官能化的聚醚分子是官能化的PEG分子和所述聚醚基团是PEG基团。
在所述方法的任意步骤中使用的溶剂是醇和适于水解所述前体(例如二氧化硅前体、FRM-缀合物前体和/或官能化的PEG分子)的量的水。在一个实施方式中，所述溶剂包含醇和适量的水。在一个实施方式中，所述醇是乙醇。
确定核形成反应、无FRM的二氧化硅层形成反应、含FRM的二氧化硅层反应或最外的含FRM的二氧化硅层反应的适宜条件在本领域技术人员的能力范围内。例如，核形成反应、无FRM的二氧化硅层形成反应、含FRM的二氧化硅层反应或最外的含FRM的二氧化硅层反应在10℃至30℃(包括其间的所有整数℃值和范围)下进行10分钟至120分钟(包括其间的所有整数分钟值和范围)。
在所述方法的任意步骤中使用碱催化所述前体(例如二氧化硅前体、FRM-缀合物前体和/或官能化的PEG分子)的缩合反应。在一个实施方式中，所述碱是氨(例如在水溶液中的氨)。
在又一个方面，本公开提供了所述多层的含FRM的纳米颗粒的用途。所述纳米颗粒能够用于如成像方法(例如细胞内生物成像方法)、高通量筛选、医学诊断、传感和产品追踪的应用。
所述多层的含FRM的纳米颗粒可以在不溶解细胞的情况下用于靶向和/或鉴定特定的细胞类型(例如具有某些内部结构的细胞)。所述方法使用荧光显微镜或流式细胞术以检测不同的多层的含FRM的纳米颗粒。在一个实施方式中，成像方法包括步骤：将一个或多个细胞与多个多层的含FRM的纳米颗粒(或多个可区分的纳米颗粒)接触；以及获得所述一个或多个细胞的多个图像，使用不同的激发波长和不同的发射波长获得每个图像，其中每个不同的激发波长在存在于所述纳米颗粒中的不同类型的FRM的吸收光谱中，并且每个不同的发射波长在存在于所述纳米颗粒中的不同类型的FRM的发射光谱中。所述方法还可以包括将多个图像组合以提供单一图像的步骤。在所述成像方法中，可以使用荧光显微镜技术进行所述成像，例如共聚焦显微镜。使用具有与PEG基团缀合的多个部分的纳米颗粒可能是理想的。
例如，所述成像方法可以用于以多重测定的方式基于细胞的内部结构对细胞进行鉴定。在一个实施方式中，将所述细胞与具有1nm至小于100nm尺寸的纳米颗粒或多个可区分的纳米颗粒接触，以使得所述纳米颗粒进入所述细胞。例如，所述细胞可以经受电穿孔(例如方波电穿孔)，以促进所述纳米颗粒掺入所述细胞。
所述一个或多个细胞可以存在于对象中。所述对象可以是具有一个或多个细胞的任意对象。例如，所述对象可以是人或非人动物。
提供下述实施例以解释本公开。所述实施例并非旨在以任何方式进行限制。
实施例1
下述是描述本公开的多层的含FRM的纳米颗粒的合成和用途的实施例。
在这个实施例中，生产亮的光学编码的荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒。将所述纳米颗粒称为多色康奈尔点或简称为mcC点，其尺寸小于100nm，这使得所述纳米颗粒对于高通量筛选以及将其用于使用荧光多重测定的细胞内生物成像是理想的。这些纳米颗粒由三种光谱不同的有机荧光团(即N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACm,λabs＝395nm，λem＝450nm)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMRm，λabs＝540nm，λem＝570nm)和Cy5-马来酰亚胺(Cy5m，λabs＝640nm，λem＝670nm))以三种精确控制的染料数(即每个颗粒分别为0、5和20)编码，从而得到26个光学上可区分的纳米颗粒，如图1所示。基于在共聚焦显微镜或在高通量筛选技术(如流式细胞术)中使用的通常可得的激发激光源(λexc＝405nm、540nm和633nm)而选择染料，从而使得mcC点能够用于标准荧光仪器。对颗粒的结构进行设计，从而以逐层的方式将染料添加至掺杂染料的颗粒的核中，并且每个光谱不同的染料由纯的二氧化硅壳空间分隔，以降低染料之间的能量转移(图1)。这确保了在成像中的最高亮度水平和最大信噪比。
制备具有不同荧光性质的光学编码的荧光二氧化硅纳米颗粒，其能够用于开发筛选测定。二氧化硅表面化学的多功能性使得所述纳米颗粒表面能够被生物分子探针(如寡核苷酸或肽)修饰。能够由基于二氧化硅的mcC点产生的荧光光学编码“C”的数量取决于两个参数：染料颜色的数量‘m’和与每种颜色相关的荧光强度水平数‘N’。对于0至无穷的强度水平，将编码的数量定义为C＝Nm-1。本案中有三种颜色m＝3的三个强度水平N＝3，因此产生26种颜色编码。
为了进行mcC点的合成，解决了三个问题：(1)基于通常可得的激发激光源鉴定适宜的荧光染料‘m’；(2)鉴定能够重复掺入颗粒中的适宜染料数量，以产生可区分的荧光强度水平‘N’，和(3)将颗粒中光谱不同的染料空间分隔，以将能量转移和荧光淬灭最小化，从而获得最大亮度水平。选择用于开发mcC点的三种染料是DACm、TMRm和Cy5m，见上文。针对单一颗粒和单一颜色测得的荧光强度取决于掺入其中的染料数量。假设在典型的mcC点合成批次中，特定颜色的染料数量为泊松分布(从而假设染料的包封是纯粹的随机过程)以区分不同mcC点的不同强度水平，则对这些泊松分布的平均值进行选择，使得所述分布的翼侧之间具有最小的重叠(见图2a)。因此理想的是精确控制染料掺入颗粒，并在增加染料的包封数量时在染料之间具有最小的能量转移以避免荧光淬灭。对于给定的核尺寸而言，在增加染料分子的数量时，空间上接近的染料趋向于显示出能量转移。因此为了使染料之间的干扰最小化，这里使用逐层的方法构建具有高染料包封数量的颗粒。此前的C点合成工作显示，对于给定的染料浓度而言，直径20-30nm的核-壳二氧化硅纳米颗粒通常每个颗粒核掺入约5-7个染料。假设染料掺入为泊松分布，则对于每个颗粒的平均染料数量分别为10和15的颗粒而言，预计其与每个颗粒5个染料的批次的重叠分别为～45％和～25％，如图2a所示。相比之下，每个颗粒平均具有20个染料的颗粒仅显示出与每个颗粒5个染料的批次～3％的重叠。预计每个颗粒5个染料的批次与含有0个该颜色染料的颗粒批次的泊松分布具有类似较小的重叠(图2a)。基于这些考虑，我们分别选择了每个颗粒0、5和20个染料的三种不同的水平，以区分在mcC点中相同颜色的不同强度水平。
图2b-i显示了产生26个不同的mcC点的各种逐层颗粒合成路线的示意图。在本实施例中用于区分mcC点颜色编码的标记包括用以表示荧光强度水平(中等/高为m/h，即每个颗粒～5/20个染料)的小写字母和用以表示荧光颜色(绿色/红色/蓝色发射分别为G/R/B)的大写字母。每个顺序为由核至外壳。例如，mGhRmB mcC点具有中等绿色(～5个染料)的核，接下来是高红色(～20个染料)的内壳，接下来是中等蓝色(～5个染料)的外壳。通过省略其标记而简单地表示在mcC点中不存在的颜色(即该颜色为0个染料)。例如，hGhB mcC点具高绿色(～20个染料)的核，无红色(即0个红色染料)和高蓝色(～20个染料)的外壳。通过如下方式进行颗粒合成：首先利用马来酰亚胺-巯基生物缀合反应将市售的马来酰亚胺活化的染料(TMRm、Cy5m或DACm)与3-巯基丙基-三甲氧基硅烷(MPTMS)缀合，以形成染料缀合物(图2b)。首先经由改良的型二氧化硅缩合，通过在适宜的氨和水在醇中的浓度下将染料缀合物与TEOS共缩合，从而合成含有中等染料负载的三种单色颗粒(分别为mG、mR或mB，参见图2c-e)。通过将浓度低于成核阈值的TEOS给与反应溶液以避免任意的二次成核，从而向颗粒上添加薄的二氧化硅层。从各反应溶液中移出特定体积，并留出这些颗粒作为具有中等染料负载的颗粒。为了得到具有高染料负载的三种单色颗粒(分别为hG、hR或hB，参见图2c-e)，向剩余的反应溶液中加入染料缀合物，以与所述核-壳二氧化硅纳米颗粒表面上的硅烷醇基团共缩合。在这一步骤后，如上所述再次添加的薄二氧化硅层。进行该交替的染料层-二氧化硅壳的程序，直至获得每个颗粒具有～20个染料的适宜的高染料负载。图2c-e显示了高绿色(TMRm)高红色(Cy5m)和高蓝色(DACm)单色C点颗粒的所得洋葱样结构的示意图。用以获得高强度发射的在每个颗粒的核上的另外的染料和二氧化硅壳层所必需的数量对于高绿色(TMRm)和高蓝色(DACm)颗粒为4，对于高红色(Cy5m)颗粒为3。
在开发针对三种不同的染料***精确控制每个颗粒的染料数量的合成方案后，我们周密地设计了颗粒结构，以在同一颗粒中以对于每个染料不同的染料负载水平掺入全部三种染料。合成这些颗粒，从而以逐层的方式加入三种染料，其中TMRm染料(绿色)在核中，接下来Cy5m染料缀合物(红色)在内壳中，接下来DACm染料缀合物(蓝色)作为最终的染料层添加(参见图1a中中间的颗粒)。有机荧光团具有相对较宽的吸收和发射光谱。取决于在我们的颗粒中的各种染料的光谱和空间接近性，预计会出现共振能量转移。这种非放射性的能量转移是由供体染料的发射与受体染料的吸收光谱之间的光谱重叠所导致。通过半径确定两个染料之间能量转移的效率，所述半径是在供体和受体之间发生50％有效的能量转移的距离。DACm-TMRm对的计算半径为(4.0nm)，而TMRm-Cy5m对的计算半径为(4.5nm)。由于DACm和Cy5m在可见光谱的末端，该配对的(1.5nm)的半径是最小的。能量转移的效率随着供体和受体分子之间的分隔距离r以1/r6显著下降。为了有效抑制能量转移，在我们的颗粒中的TMRm和Cy5m染料层由10-12nm厚的二氧化硅壳分隔(例如参见图2f)。对于不含Cy5m染料的颗粒而言，在加入DACm染料之前，在含有TMRm的颗粒的核上生长10-12nm的二氧化硅壳厚度(例如参见图2g)。对于将第一个DACm染料层加入含有TMRm和Cy5m层的颗粒而言，首先生长6-8nm厚度的纯二氧化硅壳(例如参见图2i)。因此，不同颜色的染料层由足够厚的二氧化硅壳空间分隔，以期有效地抑制能量转移。
由于TMRm为选择在中心的染料，以维持在不同mcC点的合成中的一致性，因而合成大批量的中等和高染料负载的TMRm颗粒。获得双色C点的下一步为在这些纳米颗粒上生长10-12nm厚的二氧化硅分隔壳，接下来为加入Cy5m染料缀合物(图2f)。在加入最终的二氧化硅壳后，产生具有中等Cy5m(mR)染料负载的颗粒。在该步骤之后，加入两个另外的Cy5m染料层及其二氧化硅壳，以获得高Cy5m(hR)染料负载的颗粒。减少另外的层以在更大的多色C点中达到较高染料负载是由于它们相对于单色C点增加的尺寸，所述增加的尺寸提供了每个颗粒更大的表面积以用于另外的染料附接。按照这些方案的合成提供了下述四种在每个颗粒中具有零DACm染料的双色C点：mGmR、mGhR、hGmR和hGhR。为了获得在每个颗粒中具有零Cy5m染料的双色颗粒，将DACm染料缀合物加入具有10-12nm厚的二氧化硅分隔层以分隔TMRm和DACm染料层的mG和hG颗粒中(图2g)。这产生具有中等DACm(mB)染料负载的颗粒。将三个另外的DACm染料层及其二氧化硅壳加入mGmB和hGmB颗粒中，以获得高DACm(hB)染料负载。按照这些方案合成提供了下述四种在每个颗粒中具有零DACm染料的双色C点：mGmB、mGhB、hGmB和hGhB。
使用Cy5m核-壳颗粒作为模板合成在每个颗粒中具有零TMRm染料的双色C点(图2h)。为达到这一目的，合成大量批次的掺杂中等Cy5m的颗粒，将所述批次分成两部分，留下一个批次作为具有中等Cy5m(mR)染料负载的颗粒，而将三次交替的Cy5m染料和二氧化硅壳层添加至另一批次中，以获得高Cy5m(hR)染料负载的颗粒(图2d)。在这些mR/hR纳米颗粒上生长厚度为6-8nm的二氧化硅分隔壳，随后加入DACm染料缀合物(图2h)。与最终的二氧化硅壳一起，这产生具有中等DACm(mB)染料负载的颗粒。随后添加三次交替的DACm染料和二氧化硅壳层，以获得高DACm(hB)染料负载。按照这些方案的合成提供了在每个颗粒中具有零TMRm染料的最终四种双色C点：mRmB、mRhB、hRmB和hRhB。
最后，为了获得具有掺入的全部三种染料的三色颗粒，在mGmR、mGhR、hGmR和hGhR颗粒上生长厚度为6-8nm的二氧化硅壳，随后加入DACm染料层和二氧化硅壳。向所得到的mGmRmB、mGhRmB、hGmRmB和hGhRmB颗粒加入三个另外的DACm染料和二氧化硅壳层，以获得掺杂高染料DACm(hB)的颗粒(图2i)。按照这些方案的合成提供了下述八种三色mcC点：mGmRmB、hGmRmB、mGhRmB、hGhRmB、mGmRhB、hGmRhB、mGhRhB和hGhRhB。
在这种多色荧光二氧化硅纳米颗粒中精确调节染料数量的能力伴随大量结构复杂性而产生。例如，具有TMRm、Cy5m和DACm的高染料负载的三色C点(hGhRhB)含有添加至中等TMRm染料负载的核-壳颗粒上的四个TMRm染料和四个二氧化硅壳层(在TMRm核周围总计达9层)，以及用以获得高Cy5m染料负载的随后的三个染料和三个二氧化硅壳层，以及用以获得高DACm染料负载的随后的四个染料和四个二氧化硅壳层。所有颗粒最终表面涂覆有聚乙二醇(PEG)层，以提供在缓冲溶液中的空间稳定性，并使其更加生物相容。结果是在被染色的核周围具有24个不同的层(包括PEG层)的洋葱型结构，其中11个层为染料层，12个层为纯的二氧化硅壳层。基于各种每个颗粒的染料组合合成了如图1所示的26个光谱可区分的颗粒。图1a以反映上述合成途径的方式显示了组装的这26种颗粒的显色性。图1b显示了在环境光下在比色皿中的水溶液中的26种颗粒的照片。根据绿色TMRm染料负载放置比色皿，在下面、中间和上面一行分别设置不含、含有中等和含有高的TMRm染料负载的颗粒(具体安排参见图4b)。在图1b下部左侧的第27个比色皿填充有未染色的PEG化的二氧化硅纳米颗粒，以用于比较。
实验部分。化学药品和材料。为了进行颗粒合成，所有化学药品均按原样使用。四乙氧基硅烷(TEOS,≥99％,GC)和在乙醇中的氨(2.0M)购自Sigma Aldrich。将(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷(MPTMS，纯度>96％，Gelest Inc.)用作将染料掺入二氧化硅纳米颗粒中的缀合接头。用于纳米颗粒合成的染料为Cy5-马来酰亚胺(Cy5m,GE Healthcare LifeSciences)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMRm,Life Technologies)和N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACm,Anaspec,Inc.)。将染料溶于二甲亚砜(DMSO，无水≥99.9％,Sigma Aldrich)中。乙氧基-硅烷封端的聚(乙二醇)(mPEG-硅烷，摩尔质量～5000g/mol)购自Layson Bio。反应在乙醇(200标准酒精度，Pharmaco-Aaper)和去离子水(DI水，18.2MΩ.cm-1纯度，Millipore Milli-Q system)中进行。使用截断分子量(MWCO)为10,000的Snakeskin透析膜管(Pierce)对颗粒进行透析，并且使用0.2μm的PTFE注射式滤器(Fisher Scientific)对颗粒进行过滤。将颗粒转移至Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水1X缓冲液(不含钙和镁的DPBS，Life Sciences)中，以使用MWCO 30,000的AdvanceCentrifugal Device(Pall Corporation)进行细胞测量。将叠氮化钠(BioUltra,≥99.5％,Sigma Aldrich)加入缓冲溶液中的颗粒中作为抗微生物剂。对于细胞成像，使用Gene Pulser X(Bio-Rad)将纳米颗粒电穿孔。使用Alexa Fluor 488霍乱毒素亚基B(Invitrogen)标记细胞表面。
纳米颗粒的合成。染料缀合。在氮气氛手套箱中将染料TMRm(在DMSO中2.6mM)、Cy5m(在DMSO中1.26mM)和DACm(在DMSO中3.4mM)的马来酰亚胺衍生物在DMSO中溶解15小时。对于纳米颗粒的合成，在手套箱中以1:25的染料与硅烷的摩尔比将染料与MPTMS缀合10-12小时。10×10-5M/4.0×10-5M/45×10-5M的浓度分别用于TMRm/Cy5m/DACm染料缀合物。
具有中等和高染料负载的单色C点的合成。中等和高TMRm负载的纳米颗粒的合成。向在乙醇中含有0.88M DI水和0.2M氨的10ml乙醇溶液中加入1.3×10-5M TMRm染料缀合物并搅拌15分钟。向该溶液中加入0.055M TEOS，反应搅拌12小时。以每30分钟每ml反应体积1μl的速率向该溶液中滴加0.105M的纯TEOS，从而获得中等TMRm负载的颗粒(mG)。
对于高TMRm负载的颗粒(hG)而言，将2×10-5M TMRm染料缀合物加入5ml mG反应溶液中并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.105M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的TMRm染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该顺序重复总共四次，以获得hG颗粒。
中等和高Cy5m纳米颗粒的合成。向在乙醇中含有0.88M DI水和0.2M氨的10ml乙醇溶液中加入1×10-5M Cy5m染料缀合物并搅拌15分钟。向该溶液中加入0.055M TEOS，反应搅拌12小时。以每30分钟每ml反应体积1μl的速率向该溶液中滴加0.105M的纯TEOS，从而获得中等Cy5m负载的颗粒(mR)。
对于高Cy5m负载的颗粒(hR)而言，将1×10-5M Cy5m染料缀合物加入5ml mR反应溶液中并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.105M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的Cy5m染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该顺序重复总共三次，以获得hR颗粒。
中等和高DACm纳米颗粒的合成。向在乙醇中含有0.88M DI水和0.2M氨的10ml乙醇溶液中加入5×10-5M DACm染料缀合物并搅拌15分钟。向该溶液中加入0.055M的纯TEOS，反应搅拌12小时。以每30分钟每ml反应物体积1μl的速率向该溶液中滴加0.15M的纯TEOS，从而获得中等DACm负载的颗粒(mB)。
向5ml mB颗粒溶液中加入5ml乙醇，以合成高DACm负载的颗粒(hB)。DI水和氨在乙醇中的浓度分别保持在0.88M和0.2M。将9×10-5M DACm染料缀合物加入10ml反应溶液中并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.15M的纯TEOS。溶液搅拌4小时，随后是进一步的DACm染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该顺序重复总共四次，以获得hB颗粒溶液。
多色C点(mcC点)的合成。在中等和高TMRm负载颗粒上的二氧化硅壳的合成：通过将反应溶液放大至100ml，从而合成中等TMRm负载的颗粒(mG)。将1.3×10-5M TMRm染料缀合物加入在乙醇中含有0.88M DI水和0.2M氨的100ml乙醇中并搅拌15分钟，随后加入0.055M的纯TEOS并搅拌12小时。以每30分钟每ml反应体积1μl的速率向该溶液中滴加0.105M的纯TEOS，以形成二氧化硅壳。在mG颗粒合成后，将溶液分别加入两个圆底烧瓶中，每个圆底烧瓶50ml。向50ml的mG颗粒溶液中的一个中加入2×10-5M TMRm染料缀合物并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.105M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的TMRm染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该顺序重复总共四次，以获得高TMRm颗粒(hG)。
以每30分钟每ml反应体积2μl的速率向50ml mG和hG溶液中的每一个中加入2.6M的纯TEOS，以在进行双色颗粒合成前获得10-12nm厚的二氧化硅壳。
在中等和高Cy5m负载颗粒上的二氧化硅壳的合成。通过放大至30ml反应***而合成中等Cy5m负载的颗粒(mR)。将1×10-5M Cy5m染料缀合物加入在乙醇中含0.88M DI水和0.2M氨的30ml乙醇溶液中并搅拌15分钟，随后加入0.055M的纯TEOS并搅拌12小时。以每30分钟每ml反应体积1μl的速率向该溶液中滴加0.105M的纯TEOS，以形成二氧化硅壳。将mR颗粒溶液分别加入两个圆底烧瓶中，每个圆底烧瓶15ml。向15ml的mR颗粒溶液中的一个中加入1×10-5M Cy5m染料缀合物并且搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.105M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的Cy5m染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该顺序重复总共三次，以获得高Cy5m负载的颗粒(hR)。
以每30分钟每ml反应体积2μl的速率向15ml mR和hR溶液中的每一个中加入1.8M的纯TEOS，以获得6-8nm厚的壳。
双色C点的合成。向中等和高TMRm颗粒中加入Cy5m染料缀合物。为了合成具有Cy5m染料作为第二层的颗粒，将30ml具有10-12nm厚的二氧化硅壳的mG和hG颗粒溶液加入两个分别的圆底烧瓶中。对于中等Cy5m负载而言，将1×10-5M Cy5m染料缀合物加入每个含30mlmG和hG颗粒溶液的反应烧瓶中并搅拌8小时。以每30分钟每ml反应体积1μl的速率向该反应溶液中滴加0.105M的纯TEOS，以形成薄二氧化硅壳。从每个反应溶液中取出15ml，并保留为mGmR和hGmR颗粒溶液。对于高Cy5m负载而言，将1×10-5M Cy5m染料缀合物加入15ml的mGmR和hGmR反应溶液的每一个中并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.105M的纯TEOS。将该溶液搅拌4小时，随后是进一步的Cy5m染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该交替的Cy5m染料缀合物-TEOS壳添加顺序进行总共两次，以使用mGhR和hGhR的颗粒溶液获得颗粒。
向中等和高TMRm颗粒中加入DACm染料缀合物。为了合成具有DACm作为第二染料层的颗粒，将10ml具有10-12nm厚的二氧化硅壳的中等和高TMRm颗粒加入两个分别的圆底烧瓶中(来自1.3.a部分)。
对于中等DACm负载而言，将5×10-5M DACm染料缀合物加入每个含10ml mG和hG颗粒溶液的反应烧瓶中，反应溶液搅拌8小时。通过以每30分钟每ml反应体积1μl的速率滴加0.15M的纯TEOS，将薄二氧化硅壳加入反应以形成二氧化硅壳。留出5ml反应溶液作为mGmB和hGmB颗粒溶液。
对于高DACm负载而言，将5ml乙醇加入5ml双色mGmB和hGmB颗粒溶液中。DI水和氨在乙醇中的浓度分别保持在0.88M和0.2M。将9×10-5M DACm染料缀合物加入10ml反应溶液中并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.15M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该交替的DACm染料缀合物-TEOS壳添加顺序进行总共三次，以获得作为mGHB和hGhB颗粒溶液的高DACm负载的颗粒。
将DACm染料缀合物加入中等和高Cy5m颗粒。为合成具有DACm作为第二染料层的颗粒，将10ml具有6-8nm厚的二氧化硅壳的mR和hR颗粒加入两个分别的圆底烧瓶中(来自1.3.b部分)。
对于中等DACm负载而言，将5×10-5M DACm染料缀合物加入每个含10ml mR和hR颗粒溶液的反应烧瓶中，反应溶液搅拌8小时。通过以每30分钟每ml反应体积1μl的速率滴加0.15M的纯TEOS，将薄二氧化硅壳加入反应以形成二氧化硅壳。留出5ml反应溶液作为mRmB和hRmB颗粒溶液。
对于高DACm负载而言，将5ml乙醇加入5ml双色mRmB和hRmB颗粒溶液中。DI水和氨在乙醇中的浓度分别保持在0.88M和0.2M。将9×10-5M DACm染料缀合物加入10ml反应溶液中并搅拌8小时，随后以每30分钟每ml反应体积1μl的速率加入0.15M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该交替的DACm染料缀合物-TEOS壳添加顺序进行总共三次，以获得作为mRhB和hRhB颗粒溶液的高DACm负载的颗粒。
三色C点的合成。在含有TMRm和Cy5m的双色颗粒上的二氧化硅壳的合成。以30分钟每毫升反应体积2μl的速率向1.3.c部分中提及的10ml mGmR、mGhR、hGmR和hGhR中加入1.8M的纯TEOS，以获得6-8nm厚的壳。将含TMRm和Cy5m的双色颗粒中的每一个的10ml溶液加入分别的圆底烧瓶中。DI水和氨在乙醇中的浓度分别保持在0.88M和0.2M。
将DACm染料缀合物加入负载TMRm和Cy5m的双色颗粒中。对于中等DACm负载而言，将5×10-5M DACm染料缀合物加入含10ml mGmR、mGhR、hGmR和hGhR颗粒溶液的反应***每一个中并搅拌8小时。通过以每30分钟每毫升反应体积1μl的速率滴加0.15M的纯TEOS，将薄二氧化硅壳加入反应以形成二氧化硅壳。留出5ml反应溶液作为mGmRmB、mGhRmB、hGmRmB和hGhRmB颗粒。
对于高DACm负载而言，将5ml乙醇加入5ml的含中等DACm负载颗粒的三色颗粒溶液中。DI水和氨在乙醇中的浓度分别保持在0.88M和0.2M。将9×10-5M DACm染料缀合物加入10ml反应溶液并搅拌8小时，随后以每30分钟每毫升反应体积1μl的速率加入0.15M的纯TEOS。将溶液搅拌4小时，随后是进一步的DACm染料层-TEOS二氧化硅壳添加。该交替的DACm染料缀合物-TEOS壳添加顺序进行三次，以获得高DACm负载颗粒：mGmRhB、mGhRhB、hGmRhB和hGhRhB颗粒。
在PEG化之前在纳米颗粒上的二氧化硅壳生长。通过滴加TEOS而在所有颗粒上生长二氧化硅壳，以对于所有纳米颗粒获得相同的尺寸。对于所有溶液而言，DI水和氨在乙醇中的浓度分别保持在0.88M和0.2M。
向10ml含中等(1.1.b部分)/高(1.1.c部分)DACm颗粒的溶液中加入4.8M TEOS，并且向中等/高TMRm颗粒(1.3.a部分)中以每30分钟每毫升反应体积2μl的速率加入2.7MTEOS。向5ml中等和高Cy5m颗粒溶液(1.3.b部分)中以每30分钟每毫升反应体积2μl的速率加入3.6M TEOS。
向5ml含G-R(1.3.c部分)/G-B(1.3.d部分)/R-B(1.3.e部分)的双色颗粒溶液中分别以每30分钟每毫升反应体积2μl的速率加入2.6M TEOS/2.6M TEOS/3.3M TEOS。
向5ml仅含中等DACm颗粒(1.3.f部分)的三色颗粒溶液中，以30分钟每毫升反应体积2μl的速率加入另外0.7M TEOS。不向含高DACm的三色颗粒中加入另外的TEOS。
mcC点纳米颗粒的PEG化。使用pH计(VWR International Symphony,SB70P)通过加入2.0M盐酸(aq.)将1.0升DI水调整至pH 5。为了进行PEG化，如颗粒合成部分所述将所有颗粒生长至相同的尺寸。通过将PEG-硅烷溶于pH 5的DI水中，制备0.08M的PEG-硅烷(mPEG-硅烷，M.W.5k)水溶液。取出1ml该溶液至小瓶中，加入2ml乙醇并将该溶液搅拌约10分钟。将1.0ml的制备得到的颗粒溶液滴加至3ml的溶于乙醇-水混合物中的mPEG-硅烷中，然后在保持在70℃的油浴中将该溶液搅拌24小时。
在PEG化后，使用10,000MWCO透析膜管在DI水中透析颗粒，并使用0.2μm PTFE注射式滤器过滤颗粒，并在室温下避光保存颗粒以用于进一步表征。
对于细胞成像测量而言，使用MWCO为30,000的Advance CentrifugalDevice将颗粒转移至Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。透析后，将5ml PEG化的纳米颗粒溶液加入5ml缓冲溶液中，并在3500rpm下离心30分钟。使用缓冲溶液将该过程重复三次。作为最后一步，将颗粒加热至75℃达15分钟以将溶液巴氏杀菌，随后加入0.1％(w/v)的叠氮化钠水溶液。
中等和高染料负载的纳米颗粒的表征。27个比色皿的反射光图像的照片在环境光下拍摄。照片图像排列为在核中无TMRm染料的颗粒(下面一行)、在核中具有～5个TMRm染料的颗粒(中间一行)和在核中具有～20个染料的颗粒(上面一行)。每行均使用固定在三角架上的佳能EOS数字Rebel 400D相机在ISO 100以及f/4.5下的二次曝光为1/20th的相同设置下独立拍摄，然后使用Adobe Photoshop以所述的排列叠放。
光谱测定和荧光光谱测定。使用Varian Cary 5000分光光度计(Varian,PaloAlto,CA)，通过在石英比色皿中用DI水稀释颗粒或游离染料，从而将颗粒与分别的游离染料进行吸光度匹配。使用DACm(25,000M-1cm-1)、TMRm(98,000M-1cm-1)和Cy5m(250,000M-1cm-1)的消光系数对样品中染料的浓度进行定量。在Photon Technologies InternationalQuantamaster荧光光谱仪(PTI,Birmingham,NJ)上进行吸光度匹配的样品的荧光测量。
荧光相关光谱(FCS)。为了对各颗粒的亮度、颗粒的流体力学半径和浓度进行定量；在使用固态405nm(用于DACm颗粒)、HeNe 535nm(用于TMRm颗粒)和HeNe 633nm(用于Cy5m颗粒)激光激发源的自制的多光谱荧光相关光谱(FCS)装置上测量吸光度匹配的样品。激发束通过60X Olympus UPlan SAPO，1.2NA水浸物镜反射。使用1.5号盖玻片底部(MatTekP35G-1.5-10-C)将200μL体积纳摩浓度的荧光样品置于微孔皿上。来自样品的发射光通过物镜收集，经过激发/发射分色镜并由发射镜反射至聚焦透镜中。发射光通过长通滤波器(Chroma)聚焦，以除去任意的激发光并且仅收集发射光子。使用50微米针孔轴向限制收集荧光的有效体积。然后光通过第二透镜进入雪崩光电二极管(SPCM 14,Perkin Elmer)。将所得到的光电流与相关器卡(Correlator.com)数字自相关。
使用三重校正自相关函数对数据进行拟合，如等式1中的分析形式所示。
等式1
A是三重校正的振幅，τR是三重态的染料分子/颗粒的表观扩散时间，τD是单重态的分子/颗粒的扩散时间，且N是在聚焦体积中的分子数量。结构因子参数‘s’描述了就轴向与径向轴比率而言的3-D高斯聚焦体积，并且由具有已知扩散系数的标准染料的测量计算得到。为了获得405nm、535nm和633nm激光线的结构因子‘s’，使用的染料分别为N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺和Alexa Fluor647-马来酰亚胺。
细胞成像。细胞培养。如此前所述，RBL-2H3细胞在补充有20％FBS(AtlantaBiologicals)和10μg/ml硫酸庆大霉素的MEM中保持单层培养。
经由电穿孔将纳米颗粒递送进入细胞。传递后3-5天收集细胞，并将1×106/mlRBL-2H3细胞在具有悬浮于DPBS缓冲液中的200μl纳米颗粒(5-10μM)的0.5ml的冷的电穿孔缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl2、1mg/ml葡萄糖和20mM HEPES(pH 7.4))中电穿孔。使用方波电穿孔，其使用Gene Pulser X(Bio-Rad)，并具有280V、10.0ms脉冲长度、4次脉冲和0.1ms的脉冲间隔的设置。对于26种纳米颗粒中的每一种重复该程序。在使用4％多聚甲醛和0.1％戊二醛固定前，使经电穿孔的细胞恢复约1小时。然后在室温下使用0.5μg/ml Alexa 488霍乱毒素亚基B标记经固定的细胞达15分钟，以将细胞膜染色。
共聚焦成像。含有纳米颗粒的细胞在使用40X水物镜(N.A＝1.2)的蔡斯510LSM共聚焦显微镜上进行成像。依次使用用于激发的405、488、561、633nm激光线和用于收集发射光的420-480(带通，BP)、575(长通，LP)、505-550(BP)和650(LP)滤光片组，从而拍摄图像。使用ImageJ将图像分成绿色、红色、蓝色、黄色和亮场图像。在ImageJ中连接重叠图像，所述重叠图像仅含有来自四个发射通道的图像。基于红色、绿色和蓝色图像的共定位而鉴定颗粒。
在进行任何光谱测量之前，使用5k摩尔质量的聚(乙二醇)-硅烷将所有得到的颗粒PEG化(见实验部分)。由于对全部26种颗粒物质完整光谱表征的描述超出了本文的范围，因此这里仅提供了特定mcC点的代表性示例，以及对在全部26种颗粒中的所有颜色的亮度水平的光谱测量的概述，参见图3和4。为了表征纳米颗粒并了解其荧光性质，将中等和高DACm、TMRm和Cy5m染料负载的单色纳米颗粒的第一水溶液与其各自的母体游离染料的第一水溶液进行吸光度匹配。图3a-c显示了所得到的吸光度和发射光谱。未观察到游离染料和颗粒之间明显的光谱位移，这表明通过包封而保存了染料的电子结构。相对于游离染料，掺杂中等和高DACm、TMRm和Cy5m染料的纳米颗粒分别显示～6.0、～1.3和～1.5的增强。对于全部三种体系而言，将染料包封至刚性二氧化硅环境中因此导致与在水溶液中的游离染料相比显著的亮度增强，这与此前的研究一致，并且表明在这些条件下，即使在本文所述的高负载水平下，染料也未显示出荧光淬灭。
使用荧光相关光谱(FCS)结合吸光度测量对掺入颗粒中的染料数量进行定量。FCS的实验装置配置为分别在λ＝405nm、543nm和633nm下激发染料(参见实验部分)。FCS是基于扩散的荧光技术，其使用扩散部分的荧光以产生自相关曲线。与动态光散射(DLS)类似，相关衰减的时间标度可与扩散系数相关，而扩散系数反过来又可以与扩散部分的流体力学半径/直径相关。图3d-f对三种母体染料(实线)得自相关曲线与分别衍生自中等和高染料负载的三种染料/颜色的6种单色C点(mG、mR和mB，空心符号；hG、hR和hB，实心符号)的自相关曲线进行了比较。与母体游离染料相比，掺入染料的纳米颗粒扩散更慢，这确证了由游离染料到颗粒的流体力学半径的显著增加。而且，含有中等和高染料水平的颗粒显示出非常类似的相关曲线，这揭示了对最终目标颗粒尺寸的高度控制。对DACm、TMRm和Cy5m体系的自相关曲线的分析揭示了游离染料的分别为1.3nm、1.4nm和1.4nm的直径，以及中等和高染料负载纳米颗粒的分别为40nm、45nm和35nm的直径。
由FCS自相关曲线的振幅G(0)，能够获得在聚焦体积中的荧光部分的数量，由所述数量能够推断出其浓度。使用该颗粒浓度以及由吸光度测量获得的染料浓度，能够计算出每个颗粒的染料数量。这是能够对在多色C点(mcC点)的合成中每个颗粒的染料数量进行定量评估的一条信息，所述信息用作优化合成方案的反馈以达到本文所述的必要的控制水平。基于这些测量，我们计算了中等和高染料负载的颗粒的每个颗粒的染料数量对于TMRm、Cy5m和DACm染料负载分别为6/27、6/22和6/24。而且，由包封在颗粒中的染料与在水溶液中的游离染料相比的荧光增强与每个颗粒的染料数量的乘积，可以计算每个染料-颗粒体系的亮度因子。该因子描述了相对于水溶液中的单一游离染料，颗粒更亮多少。以这种方式确定的分别的亮度因子为：中等/高TMRm颗粒9.1/35、中等/高Cy5m颗粒9/33，和中等/高DACm颗粒36/144。这些结果表明，颗粒应比母体游离染料亮1至2个数量级。除了其多重测定性质以外，这些非常高的亮度水平将使得mcC点在生物成像应用方面极具吸引力。计算亮度因子与通过在光学FCS检测器上单独的扩散物质的计数率所测定的染料和颗粒的实验亮度是可以相比较的。这分别提供了游离染料和颗粒的亮度的直接量度。图3g-i显示了这些测量的结果。图3g显示中等/高TMRm负载颗粒的亮度是母体TMRm游离染料的亮度的6.6(±0.1)/32(±0.4)倍，而对于Cy5m体系而言，图3h显示了中等/高Cy5m负载的颗粒的亮度是母体Cy5m游离染料的亮度的5.3(±0.2)/27.6(±0.4)倍。图3i比较了DACm颗粒体系的亮度，并显示中等/高DACm负载颗粒的亮度分别是母体DACm游离染料的亮度的24(±3.0)/105(±10)倍。这些直接的亮度测量确证了如目标那样，各亮度水平彼此之间相差4-6倍。与在早期研究中的类似观察一致，计算亮度因子***性地高估了获自FCS测量的值。这可能是由于在染料当量测定中的误差所致，其例如在游离染料和包封染料之间不呈现吸收截面的变化。其可能还是由于FCS检测使用偏振光进行所致，所述偏振光可能仅激发颗粒中染料的子集，这反过来会导致每个颗粒的计数比从亮度因子预期更小。
此前的尺寸>3μm的荧光多壳纳米颗粒的工作揭示了由于折射率的改变(其导致发射光的散射)，颗粒的荧光强度随着壳层数量的增加而降低。我们通过比较中等和高染料负载颗粒的每个颗粒染料数量与每个颗粒亮度的比率，从而检验了相同的效应是否适用于本颗粒。我们的结果显示，对于中等和高DACm负载颗粒而言，比率为4.0/4.3，对于中等和高TMRm负载颗粒而言，比率为4.5/4.8，对于中等和高Cy5m负载颗粒而言，比率为3.66/3.69。这些结果揭示，相比于此前的结果，在我们的***中通过掺入另外的二氧化硅壳从中等染料负载变化至高染料负载不会降低相对荧光发射。
图4a显示了获得三色C点的特定颗粒的代表性FCS曲线，其覆盖了从中等/高TMRm染料负载的单色C点(mG，空心圈/hG，实心圈)起始，经由中等/高Cy5m染料负载的双色C点(hGmR，空心圈/hGhR，实心圈)，至具有中等/高DACm染料负载的最终三色mcC点(hGhRmB，空心圈/hGhRhB，实心圈)的整个合成路线。使用PEG化步骤终止该图中的所有颗粒，尽管颗粒没有生长至～85nm的相同尺寸。结果清楚地表明，从中等TMRm染料负载颗粒开始至含有高染料负载的全部三种染料的颗粒，颗粒尺寸增加，如由移动至更长时间的相关曲线所反映。绿色荧光颗粒的FCS曲线显示了在短时间来自三重态的显著贡献，这通过拟合程序解释(参见实验部分)。中等TMRm负载的核壳颗粒合成(mG，空心绿色圈)产生15nm(±0.5)直径(包括PEG层)的颗粒。加入4个TMRm染料和二氧化硅壳层产生28nm(±0.6)直径(包括PEG层)的高TMRm染料负载颗粒(hG，实心绿色圈)。4个交替的染料和二氧化硅壳层中的每个均为壳厚度贡献了1.2-1.5nm(或为颗粒直径贡献了2.4-3nm)。具有中等Cy5m染料负载的双色颗粒首先将10-12nm厚的二氧化硅壳(使颗粒直径增加20-24nm)接枝于直径为28nm的hG颗粒上，随后加入一个交替的Cy5m染料和二氧化硅壳层(hGmR，空心红色圈)。对hG和hGmR颗粒的自相关曲线的比较揭示了颗粒尺寸的大的差异，因为hGmR的曲线显著位移至hG曲线的右侧。分析揭示了双色C点的直径为53nm(±2.0)。在hGmR颗粒上具有两个另外的交替的Cy5m染料和二氧化硅壳层的高Cy5m染料负载的颗粒产生直径为57nm(±2.2)的双色C点(hGhR，实心红色圈)。每个另外的Cy5m染料和二氧化硅壳层使颗粒的厚度增加～1.0-1.1nm(使颗粒直径增加2.0-2.2nm)。最后，含有第三DACm染料的颗粒在57nm(±2.2)的hGhR颗粒上生长6-8nm厚的二氧化硅分隔壳(使颗粒直径增加12-16nm)，随后加入一个交替的DACm染料和二氧化硅壳层，从而产生颗粒直径为～72nm(±4.1)的三色C点(hGhRmB，空心蓝色圈)。当对hGhR和hGhRmB的FCS曲线进行比较时，颗粒尺寸的增加是值得注意的。图4a中的最终的FCS曲线来自具有高负载的全部三种染料的三色C点(hGhRhB，实心蓝色圈)，其具有加入在hGhRmB颗粒上的三个另外的交替的DACm染料和二氧化硅壳层以及PEG表面层，从而产生85nm(±4.6)的最终颗粒直径。
在图4b中高亮显示了在相同颗粒中的不同颜色的染料之间不存在能量转移，即纯二氧化硅层抑制共振能量转移(FRET)的效率，所述图显示了四种颗粒(hGhRhB、hGhRmB、mGhRhB和hGmRhB)的溶液的6个荧光发射光谱，每种颗粒均含有全部三种染料/颜色。对于在左侧和右侧的光谱而言(分别为蓝色和红色发射)，溶液在绿色中进行吸光度匹配，而对于在中间(绿色发射)的光谱而言，溶液在红色中进行吸光度匹配。图4b比较了分别在405nm、540nm和633nm激发时，含有中等和高DACm(mB/hB)、TMRm(mG/hG)和Cy5m(mR/hR)的三色颗粒的发射性质。当在405nm激发时，具有高DACm染料负载的颗粒(hGhRhB)的亮度为具有中等DACm负载的颗粒(hGhRmB)的亮度的～3.8倍。当在540nm激发时，具有高TMRm染料负载的颗粒(hGhRhB)的亮度为具有中等TMRm负载的颗粒(mGhRhB)的亮度的～3.5倍。在633nm激发时，具有高Cy5m负载的染料(hGhRhB)的亮度为具有中等负载的颗粒(hGmRhB)的亮度的～4.0倍。极为不同的发射水平确证了含中等和高的每个颜色染料负载的颗粒可清楚地光谱区分。而且，具有蓝色或绿色发射的光谱均未显示出FRET的光谱证据。例如，在405nm(在蓝色中)下激发样品hGhRmB或hGhRhB时，无明显的分别经由绿色或红色发射的由DACm至TMRm或Cy5m的显著能量转移。类似地，当在540nm下激发hGhRhB或mGhRhB颗粒时，未观察到经由红色发射的由TMRm至Cy5m的显著能量转移。我们断定用于空间分隔不同颜色的染料的层的二氧化硅壳明显抑制在其他情况中能够在光谱中观察到的FRET。
图4c以柱状图的形式汇总了在全部26种颗粒中所有颜色的光谱亮度水平，所述柱状图以与图1b中填充颗粒溶液的比色皿相同的方式设置。亮度水平测量为如图4b中示例的每个颗粒的每个颜色的各自的荧光发射最大值。将每个颜色的柱高归一化至具有中等染料负载的颗粒的亮度。从上至下，与图1b中的照片类似，我们按照在颗粒的核中每个颗粒具有～20个(上面一行)、～5个(中间一行)和0个染料(下面一行)的减少的绿色TMRm染料的数量(绿色的柱子)将显示分为三组/行。从这些柱状图中可以看出，具有高TMRm染料负载的颗粒的亮度是中等染料负载TMRm颗粒的亮度的～3.5倍。在图中从左到右，我们针对含有不同量的Cy5m(红色柱子)和DACm染料(蓝色柱子)的颗粒在这些“绿色”组/行的每一个中对荧光亮度水平进行了比较。从结果中可以看出，如设计时的目标那样(参见上文)，具有高Cy5m染料负载的颗粒的亮度是含有中等Cy5m染料水平的颗粒的亮度的～4-4.3倍，而高DACm负载颗粒的亮度是中等DACm负载颗粒的亮度的约～3.8-4.2倍。mcC点的三种颜色的如图4c所揭示的测得颗粒亮度水平因此仅源于颗粒中该颜色的染料的数量。这使得能够基于合成方案对亮度水平进行预测，并且使得特定颜色编码的鉴定更加可控。
在细胞组件中的生物多重测定。在表征mcC点后，进行荧光多重测定以显示多色细胞内成像。使用一种类型的颗粒溶液对单独的细胞溶液进行电穿孔(参见实验部分)，随后使用共聚焦成像基于RGB颜色混合方案混合和区分细胞。将大鼠嗜碱性白血病肥大细胞(RBL-2H3)用于这些测量，并使用Alexa488-霍乱毒素亚基B(λ吸收＝488nm，λ发射＝515nm，在mcC点合成中未使用该波长)对细胞表面进行标记以鉴定细胞边界。
图5显示了细胞混合物的共聚焦荧光显微镜图像，其中分别含有hB、hGhB、hGhR和hGhRmB颗粒。图5(a-d)显示了分别在560nm、633nm、405nm和488nm激发细胞时，在绿色、红色、蓝色和黄色通道获得的细胞图像。这些图像显示对应于由纳米颗粒中存在的每个染料颜色所发射的光子的每个颜色通道的发射。RBL-2H3细胞在绿色(图5a)和蓝色(图5b)通道中显示出自发荧光，然而，由于颗粒是亮的，因而高信噪比使得鉴定细胞中内化的纳米颗粒成为可能。图5e显示了四个通道的重叠图像，其中使用hB颗粒(蓝色圈)标记的细胞仅在蓝色通道中显示出发射，其在绿色或红色通道中无发射，而使用hGhRmB(洋红色圈)标记的细胞在红色、绿色和蓝色通道中显示出发射。含有双色颗粒hGhB(黄色圈)和hGhR(红色圈)的细胞分别在红色和蓝色通道中不显示贡献。图5f显示了细胞的亮场图像，所述图像显示这些RBL-2H3细胞的形态在电穿孔后是完整的，这使得进行细胞成像成为可能。基于该图，我们显示了mcC点被内化，并且从共定位来自每个通道的发射贡献可以看出，经纳米颗粒染色的细胞可以彼此之间区分。
该实施例为利用多色二氧化硅纳米颗粒的细胞内荧光多重测定的首次展示。亮的mcC点基于简单的RGB颜色编码提供了区分靶点的平台。预计这些逐层颗粒结构的适宜的纳米颗粒表面官能化可以作为在基础生物学、细胞信号、生物医学和高通量细胞与药物筛选中的体外和体内应用的有力工具提供。
实施例2
下述为描述了本公开的多层的含有FRM的纳米颗粒在成像方法中的用途的实施例。
样品的制备。在这些实验中，使用单一类型的颗粒经由方波电穿孔对26个大鼠嗜碱性白血病(RBL)细胞样品中的每一个进行机械转染。使用Alexa488和霍乱毒素的缀合物对细胞进行膜标记。选择所述第四光谱不同的荧光染料，以使得能够将荧光细胞膜与细胞内部的mc C点区分。将单一颗粒样品直接接种在玻璃显微镜载玻片上，并且在成像前将其固定。在接种前混合单一颗粒细胞样品使我们能够制备每个细胞仅具有单一类型的mc C点的多颗粒样品。
成像&分析。使用能够同时检测Cy5、TMR、DAC和Alexa488染料的蔡斯710共聚焦扫描激光显微镜对细胞进行成像。同时在“红色”通道(λ激发＝633nm)、“绿色”通道(λ激发＝561nm)、“蓝色”通道(λ激发＝405nm)和“黄色”通道(λ激发＝488nm)中采集图像。采集单独的16-bit 1280x 1280像素的图像，四个荧光图像和一个亮场图像，并将其分成512x 512像素的拼图。图6中显示了混合颗粒图像的典型拼图，其显示了含有至多17种不同颗粒的Alexa488标记的RBL细胞。还重叠荧光图像，以显示细胞已经摄取了足够高浓度的颗粒。
使用荧光细胞-膜标记鉴定单一细胞。使用尺寸分析排除背景荧光和细胞聚集体，由此细胞近似为高强度的圆形区域。认为直径小于5μm或大于15μm的荧光实体在单一细胞的正常尺寸范围之外，因而不对其进行分析。将在该图像中鉴定的单一细胞边界也应用于相应的RGB通道图像。仅将位于细胞内部的像素强度用于该分析的剩余部分。所有的图像处理算法均是自制的，并使用MATLAB实施。
使用单一颗粒图像(1280x 1280像素)表征相应mc C点的荧光性质。指定各细胞的平均红色、绿色和蓝色强度，在每个细胞中使用像素的最亮50％计算。从该分析中排除低强度像素，以使来自含较少或不含颗粒的像素的贡献最小化。使用来自超过1000个细胞的红色、绿色和蓝色平均像素强度的统计学分析来产生使我们能够“解码”多颗粒图像的RGB阈值。根据上述产生的结果逐个细胞分析多颗粒图像。根据作为概念证明的该方法，我们已经成功“解码”了17颗粒图像。该图像(1280x 1280像素)的假颜色版本显示于图7中。在该图中，根据内部的纳米颗粒的“颜色”对细胞进行颜色编码。
尽管参考特定的实施方式(其中的一些是优选的实施方式)特别显示和描述了本发明，但本领域技术人员应理解在不脱离如本文所公开的本发明的主旨和范围的前提下可以对其进行形式和细节上的各种改变。

Claims (18)

1.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：
a)二氧化硅核，所述二氧化硅核包含多个与所述核的二氧化硅网络共价结合的荧光响应材料(FRM)；
b)1-100个含FRM的二氧化硅层，每个层包含多个与所述含FRM的二氧化硅层的二氧化硅网络共价结合的FRM，并具有1nm至20nm的厚度；
c)一个或多个无FRM的二氧化硅层，其中所述无FRM的二氧化硅层之一将所述二氧化硅核与所述含FRM的二氧化硅层之一分隔，并且，如果存在，所述含FRM的二氧化硅层的每个相邻对被所述无FRM的二氧化硅层之一所分隔；
d)设置于最外的含FRM的二氧化硅层上的最外的无FRM的二氧化硅层；和
e)与所述最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个聚(乙二醇)分子。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒进一步包含与共价结合至所述最外的无FRM的二氧化硅层的外表面的所述聚(乙二醇)分子共价结合的一个或多个部分。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述一个或多个部分选自蛋白、肽、核酸、适体、抗体、抗体片段、聚合物、有机小分子及其组合。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述核酸选自单链DNA分子、双链DNA分子、单链RNA分子、双链RNA分子、分枝的DNA分子及其组合。
5.根据权利要求1所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒的直径为5nm至500nm。
6.根据权利要求1所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒的直径为5nm至100nm。
7.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中每个无FRM的二氧化硅层具有的厚度使得在所述核中的FRM与在一个相邻的含FRM的二氧化硅层或多个相邻的含FRM的二氧化硅层中的FRM之间具有10％或更低的可检测的能量转移。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中每个无染料的二氧化硅层的厚度为1nm至20nm。
9.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述核与全部的含FRM的层具有不同的FRM。
10.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述FRM是有机染料。
11.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述FRM选自N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)(DAC)、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR)、Cy5或其组合。
12.一种制备权利要求1所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括步骤：
a)将二氧化硅前体、多个单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成二氧化硅核，所述二氧化硅核具有多个与其二氧化硅网络缀合的FRM，
b)将步骤a)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层；
c)将步骤b)得到的材料与二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成含FRM的二氧化硅层；
d)任选地，将步骤c)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以在所述二氧化硅核上形成无FRM的二氧化硅层，并且将所得到的材料与二氧化硅前体、单一类型的FRM缀合物前体、溶剂和碱接触，以形成含FRM的二氧化硅层；
e)任选地，将步骤d)重复所需的次数，其中所述接触是与从在此前进行的步骤d)中得到的材料接触；
f)将步骤c)、d或步骤e)得到的材料与二氧化硅前体和溶剂接触，以在最外的含FRM的层上形成最外的无FRM的二氧化硅层；和
g)将步骤f)得到的材料与官能化的PEG分子接触，以形成纳米颗粒，所述纳米颗粒具有与其最外的无FRM的二氧化硅层的外表面共价结合的多个PEG分子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PEG分子是异双功能的PEG分子。
14.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括分离所述纳米颗粒的步骤。
15.一种成像方法，所述成像方法包括步骤：
a)将细胞与多个权利要求1所述的纳米颗粒接触；和
b)获得样品的多个图像，使用不同的激发波长和不同的发射波长获得每个图像，其中每个不同的激发波长在存在于所述纳米颗粒中的不同类型的FRM的吸收光谱中，并且每个不同的发射波长在存在于所述纳米颗粒中的不同类型的FRM的发射光谱中。
16.根据权利要求15所述的成像方法，所述成像方法进一步包括将所述多个图像组合以提供单一图像的步骤。
17.根据权利要求15所述的成像方法，其中所述图像通过共聚焦显微镜获得。
18.根据权利要求15所述的成像方法，其中所述细胞存在于对象中。
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