CN105120898A

CN105120898A - 过敏原制剂

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Publication number: CN105120898A
Application number: CN201480017317.4A
Authority: CN
Inventors: T·莱贡
Original assignee: Biotech Tools SA
Current assignee: Biotech Tools SA
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2015-12-02
Also published as: AU2014234316A1; JP6419775B2; EP2976107B1; WO2014147131A1; US20160030553A1; BR112015024040A2; JP2018168192A; JP2016515554A; AU2014234316B2; EP2976107A1; CA2903345A1

Abstract

过敏原制剂，包括在水包油乳液中的过敏原。

Description

过敏原制剂

本发明涉及一种过敏原制剂。

常见的过敏原有花粉、屋尘螨、霉菌、药物、食物和动物毛发及皮屑。

最常见的过敏疾病有鼻炎、哮喘和特应性皮炎。过敏性哮喘是一种慢性炎症性疾病。通过使用抗组胺剂、β-激动剂及皮质类固醇能影响过敏性疾病的对症治疗。

此外，所谓的“特异性”免疫疗法是基于脱敏作用。具体地，向患者皮下注射施用特异性引发过敏原(offendingallergen)。治疗从小剂量过敏原开始，且剂量有所增加。通常，治疗维持数年。这类治疗的患者依从性较差，且由于患者遭受到严重的过敏反应而受到安全因素的质疑。

作为重复皮下注射法的补充，还有口服脱敏法。

US4,822,611公开了一种治疗过敏的方法，包括口服过敏原治疗。它描述了市售可得的“bulk”过敏原提取物，其表现出不同制品提取物中批次间的变化和差异。并未对这些提取物的制备有所描述。

GB1247614公开了一种过敏原提取方法。该方法的目的在于通过纳入过敏原的所有可提取组分以获得一种更完整有效的过敏原提取物。

US5,770,698公开了一种纯化过敏性活性蛋白提取物的方法。US'698中图2的图谱在280nm未显示出峰。这意味着该提取物中含有大量的非蛋白杂质。

WO99/22762公开了一种类似的方法；因此，该产物也含有大量的非蛋白杂质。

另一方面，有基于单表位开发高特异性制剂的趋势。例如，WO00/58349公开了一种分离纯化肽，含有位于离酪氨酸/精氨酸对两个肽键位置的亮氨酸。这些肽可用于制备治疗或预防(在此特别是针对犬类)过敏的药物组合物。

一方面，采用各种方法来纯化特异性识别的单个过敏性分子。另一方面，人们尝试着尽可能完整地生产过敏性提取物。

根据第一种选择，过敏原制剂常有可能缺乏在特定患者中诱发耐受的相关表位。第二种选择的缺陷在于批次与批次之间的变异性以及能够触发免疫反应的化合物的存在，例如其DNA分子、碳水化合物、脂类复合物。

WO2008/000793描述了一种至少克服了部分现有技术中缺陷的纯化过敏原的方法，尤其是提供了来源于天然过敏原中的抗原，相较于粗过敏原提取物，触发过敏反应的能力大幅下降，但仍能刺激T细胞。

WO2012/172037公开了一种制备水解过敏原的方法。

尽管进步显著，仍需要改善过敏原制剂的免疫原性，尤其是对过敏的治疗。

本发明的一个目的在于提供一种具有增强过敏原性的过敏原制剂，及其在治疗过敏中的治疗性应用。

通过提供在水包油乳剂中含有至少一种过敏原的过敏原制剂，解决了该问题。

现有技术中已知的水包油乳剂存在于疫苗制剂中；见WO95/17210和WO2008/043774及其引用文献。

据发现，佐剂可改善过敏原制剂的有效性，从而减少制剂中过敏原的必需量。这提高了安全性。还发现如Al(OH)₃的佐剂不能以相似的方式结合所有过敏原蛋白/肽。它们对某些改善T细胞和B细胞刺激的过敏原(而另一些表现出的刺激作用降低)效果具有负面影响。这个问题非常重要，如果不仅是一个单一纯化过敏原，而是采用过敏原蛋白质或过敏原蛋白质的水解产物的混合物被。

本发明的一个实施方案是一种过敏原制剂，其含有在水包油乳剂中的过敏原。过敏原可以是例如过敏原提取物，纯化的过敏原提取物，变性的过敏原提取物或水解的过敏原提取物。

优选地，所述过敏原制剂包含可代谢的油、水和一种或多种表面活性剂。

优选地，所述可代谢的油选自下组：角鲨烯，角鲨烷，大豆油，芝麻油和Miglyol810油。

优选地，一种或多种表面活性剂表面活性剂选自下组：吐温80、CAMPULPOE-O-低PV表面活性剂，SOLITOLHS15表面活性剂、PLURONICF68嵌段共聚合物、胆酸钠、丙三氧基脱氧胆酸、鞘磷脂、鞘氨醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三氧基-3-磷脂酰乙醇胺、L-a-磷脂酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3胆碱磷酸和蛋磷脂酰胆碱、山梨醇三油酸酯或其混合物。

优选地，在所述制剂中，过敏原的浓度为0.1至200μg/ml(在25℃下)。

优选地，所述的制剂中油含量为制剂的1至10％(w/w)。

所述的至少一种表面活性剂的含量优选为油的1至30％(w/w)。

优选的o/w乳剂的例子是例如：

5wt-％的角鲨烯

0.5wt-％的聚三梨醇酯

0.5wt-％山梨醇三油酸酯

于pH6.5的含水柠檬酸盐缓冲液(puffer)中。

在进一步的实施方案中，o/w乳液包括至少角鲨烯，水性溶剂和聚氧乙烯基烷基醚。

在一个实施例中，将所述的o/w乳液制备为不含有过敏原。然后含有过敏原的溶液与o/w乳液以1:9至9:1(w/w)的比例组合。

在另一优选例中，过敏原可以是例如过敏原提取物，纯化的过敏原提取物，变性的过敏原提取物或水解的过敏原提取物。

用于生产本发明的过敏原提取物的优选方法包括下列步骤：

a)提取含有过敏原蛋白的过敏原，从而形成提取物，

b)纯化所述的提取物，去除非蛋白组分从而形成纯化的提取物，

c)用第一变性剂对所述纯化的提取物进行变性，以形成纯化的变性提取物，

d)精炼纯化的变性提取物，除去杂质，从而形成精炼的变性提取物。

在一些实施例中，所述的方法随后还：

-用第二变性剂对精炼的变性提取物进行变性，形成变性的过敏原混合物。

在所述步骤d)后，可以进行第二变性步骤。用于该变性步骤的第二变性剂，可以是与步骤c)相同的或具有不同的组成。在优选的实施方式中，用于第二变性步骤的还原剂是TCEP。

优选地，所述的第二变性步骤的pH设定为在1.5至9.0之间。在一个优选实施例中，所述的pH为低于7.0或低于5.0或低于3.0，但优选为高于1.0。优选进行变性至少15分钟，优选至少30分钟，更优选至少60分钟，温度在15至40℃之间，优选在20至37℃之间。

与现有技术的方法相比，该方法生产出主要包含蛋白质的过敏原提取物，而无需将所述提取物纯化形成单一的肽或蛋白质。

与现有技术的产品相比，本发明的产品具有以下优点：

-基本去除了非蛋白质的免疫原性物质

-天然过敏原提取物能刺激T细胞和/或B细胞而触发速发型过敏反应(嗜碱性粒细胞活化，肥大细胞脱粒)的能力降低

作为起始原料，可以使用不同的天然发生的过敏原。典型的天然原料是牛奶、毒液、鸡蛋、野草、牧草、树木、灌木、花卉、蔬菜、粮食、真菌、水果、浆果、坚果、种子、豆类、鱼类、贝类、海鲜、肉类、香料、昆虫、螨虫包括屋尘螨、霉菌、动物、鸽子蜱、蠕虫、软珊瑚、动物皮屑、线虫、橡胶树、以及它们的组合。

用于本发明优选的过敏原特别是花粉，屋尘螨，豚草花粉，牛奶，鸡蛋白和花生。优选地，所述的花生选自花生属，优选花生种，更优选选自花生(hypogaea)和长鞭红景天(fastigiata)。亚种包括弗吉尼亚、西班牙、巴伦西亚种和/或杂合体，诸如转轮(Runner)或者甚至是通过基因工程获得的转基因花生。优选地使用由至少两种，更优选地使用三种物种/亚种/品种/杂交和/或转基因的花生。在一个优选实施例中，花生的红色种皮(外皮)已被去除。

或者，合成来源的过敏原可以被用作为起始原料。合成来源的过敏原指生物技术所产生的蛋白质，如重组蛋白和/或转基因生物体。

优选地，所述的来源包括过敏原混合物。

本发明的过敏原制备可用于制备诱导耐受性和脱敏的药物组合物和/或食品组合物的。诱导耐受可用于治疗或预防过敏反应。

需要治疗或预防的过敏反应取决于过敏原的来源，即对花生过敏通过使用源于花生的过敏原预防或治疗，而对牧草花粉过敏通过使用源于牧草花粉的过敏原治疗。

提取物质后，将提取物纯化，以除去非蛋白质成分，如糖、脂质、核酸和类似物。典型地，有几个不同的蛋白质存在于纯化的提取物的蛋白质部分中。

根据现有技术，一种蛋白质被纯化，其它剩余蛋白是“杂质”。

与此相反，本发明的目的是纯化在一起的蛋白质。在纯化的提取物中蛋白质的相对量可以方便地使用诸如SDS-PAGE，随后通过光密度法来测量。

有必要进行计数的两个最主要蛋白质至少占蛋白质的总重量的60％，例如，没有单一的蛋白质占总蛋白质的60％(w/w)或以上。更优选地，所有蛋白质的60％由至少3个主要蛋白组成的，优选由至少4个主要蛋白，更优选为由至少5、6、7、8、9或10个主要蛋白。

例如，有以下的蛋白：

蛋白1：27％

蛋白2：13％

蛋白3：34％

蛋白4：19％

蛋白5：17％

共同形成至少60％(≈60％或更多)的最主要的蛋白质是蛋白质3+1(34+27＝61％)。

此外，总蛋白含量在纯化的提取物中至少为60％(按重量计)；优选含量为70％(按重量计)或80％(按重量计)，更优选为90％的(按纯化提取物的重量计)。

提取物优选以水溶液形式呈现。合适的盐例如但不限于以下的盐：碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、TRIS和HEPES。

也与许多其它提取方法不同，优选地，萃取介质的量是相当大的，例如，天然来源的过敏原的至少20倍重量，优选为100倍重量或更多。

提取物的纯化可以通过以下一种或多种方式实施：

-离子交换层析步骤(包括阴离子交换层析和阳离子交换层析)，

-尺寸排阻层析步骤(也称为凝胶过滤)，

-沉淀步骤，

-疏水相互作用层析步骤，

-伪亲和及亲和层析，和/或

-透析过滤。

在一个优选的实施方案中，当在阳离子交换剂中，上样溶液的pH在阳离子交换剂酸性基团的pKa和具有提取物蛋白中最低pKa的蛋白的pKa之间时，则使用离子交换层析。在阴离子交换剂中，其pH在阴离子交换剂碱性基团的pKa和具有构成提取物中最高pKa的蛋白的pKa之间。

通过这种方法，所有蛋白质结合于离子交换剂，而中性杂质和与离子交换树脂具有相同电荷的杂质将被去除。

在一个优选的实施方案中，至少一个纯化步骤是用包含一种或多种表面活性剂和/或变性剂的溶液进行。所述表面活性剂可以是非离子、阴离子、阳离子或两性的。合适的变性剂为离液剂、还原剂和其混合物。合适的变性剂为例如尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇。尿素合适的浓度为3M或更高，优选为4M或更高。合适的胍盐的浓度优选为2M，优选为3M或更高。乙二醇和/或异丙醇合适的浓度为5％或更高，更优选10％或更高，最高达20％(按重量计)。

在某些情况下，纯化的提取物的生产便已足够。这种类型的提取物可被用于进行过敏性疾病的离体/体内和体外诊断、预防和治疗。

在一些实施例中，所述的方法还包括步骤：

-水解变性的过敏原以形成过敏原水解产物。

所述步骤可以在(第一或第二)变性步骤，或精炼步骤后。

其可以表明，一些过敏原在两步变性后显示出更好的水解作用。

由此获得的产物的优点是，肽是变性蛋白的消化产物。

在一些实施例中，所述的水解作用随后还：

-纯化所述过敏原水解产物以去除分子量高于10,000Da和低于1,000Da的肽以获得纯化的水解产物，其中70％，更优选80％的肽是在10000Da和1000Da之间。

所述纯化的变性提取物包含蛋白质，其中一起形成所有蛋白质的至少60％(w/w)的最丰富(w/w的)的蛋白质，，为至少两种蛋白质，且所有蛋白质代表至少60％(w/w)的纯化的变性提取物的干重。

由于校正了具体的大小，它们对诱导速发型过敏反应和促炎症反应方面的效力降低。

如果需要的话，变性，优选在离液剂还原剂或其混合物存在下进行。合适的离液剂是，例如尿素和盐酸胍。典型的还原剂是，例如二硫苏糖醇(dithiotriethol)、β-巯基乙醇、硫代甘油和其混合物。

水解步骤特别采用酶来进行。适宜的酶是，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶。这个水解步骤也可以在离液剂，优选尿素或盐酸胍的存在下进行。在水解期间，尿素和盐酸胍的浓度应低于4M，优选低于3M。

水解步骤也可在还原剂，优选地为TCEP存在下进行。在水解过程中，TCEP的浓度优选低于10mM。优选地，使用胃蛋白酶。更优选地，使用pH范围为1.0–3.0的胃蛋白酶。

在尺寸校正步骤，将分子量大于10,000Da或小于1000Da的肽去除到某种程度。

因此，纯化的水解产物中包括分子量为1000Da和10000Da之间的肽。用于除去大或小肽的合适方法是超滤和尺寸排阻层析。再一次，所述的尺寸排阻层析可在离液剂的存在下进行，例如尿素，盐酸胍，乙二醇，异丙醇和它们的混合物。

优选地，少于10％的肽具有高于10.000Da的分子量且少于20％的肽具有低于1000Da的分子量，使得70％、或更优选80％的肽是10.000Da和1.000Da之间的。

所述水解产物的一个优点是，该肽是纯化的变性蛋白的消化产物。它们诱导直接过敏反应和共炎症反应的效力降低。

本发明的再一个实施例是一种由本发明的方法获得的过敏原提取物。典型地，在所述的提取物中共同形成所有蛋白至少60％(按重量剂)的最主要蛋白(按重量计)，是至少2个蛋白，优选至少3个或4个蛋白，或更优选至少5，6，7，8，9或10个蛋白。纯度显示为光密度260nm：光密度280nm比<1，优选<0.9，更优选为0.75和0.9之间。

另一优选例为所述方法得到的过敏原水解产物。其可被用作于：

-体内过敏原疾病的诊断：点刺试验、皮内注射、结膜，嗅和吸入试验

-离体和体内过敏原疾病的诊断ELISA试剂盒，或用于测试的标准

-过敏原疾病的预防或治疗处理：脱敏/减敏治疗和有/无佐剂组合的免疫反应调节疫苗。

本发明的过敏原提取物可以用于制备诱导耐受性的药物组合物和/或食物组合物。诱导耐受性可以被用于治疗或预防过敏反应。

本发明的一个实施例是包括含有本发明过敏原制剂的药物组合物。

此外，药物组合物可以包括一种或多种以下物质：三磷酸核苷、二磷酸核苷、单磷酸核苷、核酸、肽核酸、核苷或其类似物、免疫抑制细胞因子、免疫蛋白酶体表达诱导化合物、1,25-二羟基维生素D3或其类似物、脂多糖、内毒素、热休克蛋白、具有NADPH或NADP-硫氧还蛋白还原酶的硫氧还蛋白、二硫苏糖醇、肾上腺素能受体激动剂如沙丁胺醇、肾上腺素受体拮抗剂如丁氧胺、调节粘附分子ICAM-1的表达的化合物、N-乙酰基-L-半胱氨酸、y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酸(还原的L-谷胱甘肽)、α-2-巨球蛋白、Foxp3基因表达诱导剂、黄酮类、异黄酮类、紫檀素类似物(pterocarpanoids)、芪类如白藜芦醇、速激肽受体拮抗剂、糜酶抑制剂、疫苗佐剂如CpG或MPL或致耐受性佐剂例如酵母多糖、β-1,3-葡聚糖、调节性T细胞诱导物、用于将粒子到肠粘膜内层的粘膜粘合剂如凝集素、锌、锌盐、多糖、维生素和细菌裂解物。

如本文所用，“提取”是一种对过敏原来源的处理，使用萃取介质包括水、缓冲液或有机溶剂从而将可溶性组分从非溶性残留物中分离。优选地使用水性体系(包括至少50％H₂O)。

如本文使用，“变性”是一种过程，在其中，蛋白质失去其四级、三级和二级结构，该术语特别是是指被一个或多个变性剂处理。

本发明的另一个实施例是含有本发明过敏源制剂的药物组合物。此外，所述的药物组合物可以包括一种或多种以下物质：三磷酸核苷、二磷酸核苷、单磷酸核苷、核酸、肽核酸、核苷或其类似物、免疫抑制细胞因子、免疫蛋白酶体表达诱导化合物、1,25-二羟基维生素D3或其类似物、脂多糖、内毒素、热休克蛋白、具有NADPH或NADP-硫氧还蛋白还原酶中任一的硫氧还蛋白、二硫苏糖醇、肾上腺素能受体激动剂如沙丁胺醇、肾上腺素受体拮抗剂如丁氧胺、调节粘附分子ICAM-1的表达的化合物、N-乙酰基-L-半胱氨酸、y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酸(还原的L-谷胱甘肽)、α-2-巨球蛋白、Foxp3基因表达诱导剂、黄酮类、异黄酮类、紫檀素类似物(pterocarpanoids)、芪类如白藜芦醇、速激肽受体拮抗剂、糜酶抑制剂、疫苗佐剂如CpG、氢氧化铝、磷酸钙、TLR-4激动剂(即MPL)和TLR-9激动剂或致耐受性佐剂如酵母聚糖、β-1,3-葡聚糖、调节性T细胞诱导物、用于将粒子接合到肠粘膜内层的粘膜粘合剂如凝集素、锌、锌盐、多糖、维生素和细菌裂解物或显示表面与抗体连接的粒子。

在一个优选的实施方案中，药物组合物被准备用于皮下施用，经鼻施用，经皮施用，淋巴内给药，口服给药，舌下给药，或用于肠内药物递送。

所有在此引用的参考文献，包括WO2008/000783和WO2012/172037，全部内容通过引用并入本文，包括本文表述的教导与其不一致之处。

图1：通过IgG免疫印迹(western-blot)检测免疫反应性。泳道1：分子量标记，泳道2：粗草花粉蛋白提取物，泳道3：纯化的过敏原变性提取物。膜被5％BSA和3％牛奶阻断。患者血清稀释至1/250。IgG的结合通过稀释至1/2500的山羊抗人IgGHRP检测，并通过TMB底物显现出来。过敏原1：±61-54kDa,过敏原2:±36-31kDa。

图2：通过IgE免疫印迹(western-blot)检测免疫反应性。泳道1：分子量标记，泳道2纯化的牧草花粉蛋白。膜被5％BSA和3％牛奶阻断。患者血清稀释至1/5。IgE的结合通过稀释至1/10,000的山羊抗人IgEHRP检测，并通过TMB底物显现出来。过敏原1：±61-54kDa,过敏原2:±36-31kDa。

图3：排除SECG25洗脱图谱的峰值。柱体积/样品体积比例是12。树脂用25mM的Tris.HCl、1.5M的尿素(pH值8.0)在9ml/min的流速下进行平衡。洗脱之后测试280nm处的吸光度。

图4：SDS-PAGE测定蛋白质谱。4–12％Bis-Tris凝胶。泳道1：分子量标记，泳道2：纯化的草花粉过敏原变性提取物。用考马斯亮蓝R-250进行染色。

图5：SDS-PAGE测定蛋白和多肽质谱。4–12％Bis-Tris凝胶。泳道1：分子量标记，泳道2：纯化的草花粉过敏原变性提取物(13μg)，泳道3：水解产物(13μg)。用考马斯亮蓝R-250进行染色。

图6：G50SEC洗脱图谱。柱用尿素2M、NaCl100mM平衡，pH值3.0。流速为15ml/分钟。柱体积/样品体积比例为10。洗脱后测试280nm处的吸光度。

图7：HPLC分析的曲线校准。将10μl的以下标准液(1mg/ml)注入BioSep-SECS2000柱：1.牛血清白蛋白(66kDa)，2.β-乳球蛋白(18.5kDa)，3.细胞色素C(12kDa)，4.胰高血糖素(3.5kDa)，5.1kDa的合成肽。

图8：体积排阻HPLC特征。柱：BioSep-SECS2000(PHENOMENEX)。洗脱缓冲液：Na₂HPO₄50mM–SDS0.5％(w/v)pH6.8。流速1ml/min。在214nm处检测。注射10μl样品。10kDa和1kDa限定之间的曲线下面积被用来计算感兴趣的肽的百分比。

图9：花粉衍生产品致敏性特性。花粉过敏志愿者的血液样品与浓度递增(0、1、10、100和1000毫微克/毫升)的花粉粗提取液、花粉纯化的蛋白质和花粉纯化肽中任一共同孵育。gp53蛋白的表达，通过流式细胞术用IgE阳性白细胞选通进行测定。结果表示为gp53阳性细胞在活化细胞中的％(平均值±2测定误差)。

本发明的方法由以下的非限制性实施例进一步举例说明。

图10：取25单独或与水包油乳状液(O/W乳液)、磷酸钙、磷酸铝、氢氧化铝组合处理的小鼠血清花生特异性IgG滴度演化。对照组用安慰剂注射。结果代表各组(n＝10)的花生特异性IgG滴度的中位数。

图11：取100花生肽单独或与水包油乳状液(O/W乳液)、磷酸钙、磷酸铝、氢氧化铝组合的多肽治疗的小鼠血清花生特异性IgG滴度演化。对照组用安慰剂注射。结果代表各组(n＝10)的花生特异性IgG滴度的中位数。

实施例

实施例1：提取

1％(w/v)花粉(ALLERGON公司，黑麦草)加入到碳酸氢钠(12.5mM)中，搅拌下孵育2h。然后将所述的溶液澄清，并以2％(w/v)加入硅藻土(ACROS)，通过0.2μm过滤器从而过滤。该样品构成了粗提取物。

提取物中过敏原的存在通过使用花粉过敏性病人的血清免疫印迹进行分析。IgG和IgE表位通过抗人IgG或IgE抗体显示。

如图1和2中所示，在提取物中有两种主要过敏原。

所述的粗提取物酸化至pH3.0，加入吐温20(0.1％,v/v)。该样品构成了酸化的提取物。

实施例2：过敏原蛋白的纯化

所述的过敏原提取物通过下述纯化：

-阳离子交换层析

将SartobindS-膜(SARTORIUS)用28x柱床体积(Bv)的碳酸氢钠12.5mM、柠檬酸盐30mM(pH值3.0)、吐温200.1％(v/v)平衡。所述的酸化的提取物上样至经平衡的膜上。该柱先用35xBv的碳酸氢钠12.5mM、柠檬酸盐的30mM(pH值3.0)、吐温200.1％(v/v)洗涤，然后用42xBv的碳酸氢钠12.5mM、柠檬酸盐30mM(pH值3.0)洗涤。蛋白用碳酸盐0.1M、氯化钠0.5M(pH9.15)洗脱。随后在280nm下经OD(检测)蛋白的存在。汇集所感兴趣的部分。

-硫酸铵沉淀

所述步骤在0-4℃下进行。

将一些达到90％饱和度的硫酸铵在搅拌下加到产物中。当所述的盐充分溶解后，结束搅拌。将悬浮液温育过夜，并在15分钟内以10,000g离心2次。每次将上清液小心丢弃。

-变性

将微丸以9mg/ml的浓度在尿素6M,DTT10mM、Tris.HCl0.1M(pH8.0)中重悬，并在37℃下孵育1h。

-在G25树脂中进行尺寸排阻层析(精葡聚糖(Sephadex)来自AMERSHAM公司)

将所述变性的样本上样至柱上，蛋白用Tris.HCl25mM、尿素1.5M(pH8.0)进行洗脱。

随后用OD在280nm下测定蛋白的存在。汇集感兴趣的部分，以构成纯化的变性过敏原提取物。

对纯化的过敏原提取物进行进一步分析。测定蛋白质含量(BCA测定)和干重，以评价所述蛋白质的纯度。伴随着糖类的去除(苔黑素测试)和OD₂₆₀/OD₂₈₀比例的降低，得到了纯化效率。

表1：非蛋白质成分的去除以形成纯化的提取物

如表1中所示，所述的纯化过程使得

-提取物中的蛋白的百分比从～15％增加至80％

-OD₂₆₀/OD₂₈₀比率趋向于0.5，代表纯净的蛋白

-碳水化合物的显著去除(残余含量可以代表蛋白质的碳水化合物部分)。

图4示出了所获纯化变性过敏原提取物典型的SDS-PAGE图。可以看出，6个蛋白至少代表了纯化提取物中的蛋白总重量60％。

实施例3：变性过敏原提取物的水解

使用以下方案水解萃取物：

所述的纯化的提取物酸化至pH2.0。在37℃下用2.5mg/ml花粉蛋白和1Eu.Ph.U胃蛋白酶(MERCK)消化337毫克的蛋白质2小时。

图5显示了纯化提取物(泳道2)和水解提取物(泳道3)的对比。如所见，对应于变性未消化蛋白的高分子量蛋白在用胃蛋白酶孵育后都消失了。

实施例4：纯化

为了去除MW≥10,000Da和MW≤1,000Da的肽，所述水解产物通过下述纯化

-在G50树脂中进行尺寸排阻层析(精葡聚糖来自AMERSHAM公司)

向水解产物中加入16.5％(v/v)的异丙醇和0.1M的NaCl。上述样本被立刻上样至G50柱上。洗脱所述的肽，汇集含所述肽的部分(MW≤10kDa)，如图中所示。

-用1kDa膜透滤(超滤纸盒OmegaPES来自PALL)

所述的肽10x浓缩，对10体积的Tris.HCl50mM(pH7.4)透滤，最终浓缩至2.5x。所述的样品构成了纯化的过敏原水解产物。

净化的效率通过尺寸排阻HPLC控制。BioSep-SECS2000柱(PHENOMENEX)用Na₂HPO₄50mM–SDS0.5％(w/v)(pH6.8)以1ml/min的速率进行平衡。在214nm处检测多肽。

10kDa和1kDa的限定通过如图7中所示例的标准曲线计算。

如图8中所示，具有1,000Da和10,000Da之间的分子量的多肽代表了纯化的水解产物中约75％的所有肽。

实施例5：过敏原性的减少

对花粉粗提取物的过敏原性质(根据实施例1)、纯化的花粉蛋白质(根据实施例2)和纯化的花粉肽(根据实施例4)，通过测量其诱导嗜碱性粒细胞脱粒能力进行了评估。

对花粉过敏志愿者处得到的新鲜人血液样本进行了体外测试，样本与浓度递增的花粉粗提物、纯化蛋白和纯化多肽一同进行孵育。通过采用流式细胞术对进行了测定活化细胞(例如IgE阳性细胞)细胞膜的gp53蛋白标记的表达进行测量，从而对嗜碱性粒细胞脱粒进行了评估。这种蛋白通常存在于静息细胞的颗粒膜中，并出现在经细胞活化的细胞表面(由于颗粒膜与胞质膜的融合)。因此，其可以凭借标记的特异性抗gp53抗体检测。如图9所示，纯化肽的过敏原性比纯化的蛋白质低约30倍，且比花粉粗提物的过敏原性低100倍。

实施例6：佐剂效力

为了分析佐剂的效果，对花生肽或变性花生蛋白连同不同佐剂的免疫原性进行了分析。

小鼠处理

对7周龄的雌性空白Balb/c小鼠用花生肽(100μg)或花生蛋白(25μg)单独或与不同的佐剂组合进行皮下注射，每周一次，连续6周：角鲨烯基水包油乳剂，氢氧化铝(每次注射500μgAl³⁺)，磷酸铝(每次注射500μgAl³⁺)以及磷酸钙(每次注射200μgCa²⁺)。一组接受安慰剂溶液的小鼠也被包括在研究中。在第0、14、28、49和63天收集血样，测量处理诱导的免疫球蛋白水平。

免疫球蛋白G(IgG)的剂量对于动物血清中的花生蛋白是特定的。

微量滴定板经花生蛋白(2μg/ml)的碳酸盐缓冲液溶液涂覆，在4℃下过夜，并用含非相关蛋白的PBS0.05％吐温的溶液在37℃下洗涤并封闭1小时。用连续稀释的血清样品(1/100至1/4374000)将孔在37℃下温育1小时。结合IgG用耦合到辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG进行检测(在37℃下孵育1小时)。洗涤后，用TMB基质孵育板，用1MH₃PO₄停止反应。在450nm和650nm下检测吸光度。

该结果由花生特异性IgG滴度表示，其对应于提供0,3光密度的血清稀释度的倒数。

花生多肽的制备

花生过敏原和水解肽的制备按照在WO2012/172037记载的方法进行，通过引用并入本文。

结果

如图10中所示，蛋白单独处理诱导了花生特异性IgG的生成(在实验开始后第49天的中位数滴度为150.000)。额外的铝盐佐剂使上述生成加倍。磷酸钙使其大幅降低(中位数IgG滴度为15.000)。水包油乳液使治疗-小鼠的血清中花生特异性IgG的量增加了七倍多(中位数IgG滴度1.100.000)。

在单独或用磷酸钙和磷酸铝吸附的100μg花生肽注射6次后，没有观察到花生特异性IgG产生(图11)。基线滴度被固定在100，对应于最小的血清稀释度的值。添加了水包油乳剂或氢氧化铝的肽治疗剂从治疗开始后的第49天起增加了花生特异性IgG的中位数滴度。

Claims

1.过敏原制剂，含有在水包油乳剂中的过敏原。

2.如权利要求1所述的过敏原制剂，包含可代谢的油、水和一种或多种表面活性剂。

3.如权利要求2所述的过敏原制剂，其特征在于，所述的可代谢的油选自下组：角鲨烯、角鲨烷、大豆油、芝麻油和Miglyol810油。

4.如权利要求2或3所述的过敏原制剂，其特征在于，所述的一种或多种表面活性剂选自下组：吐温80、CAMPULPOE-O-低PV表面活性剂、SOLITOLHS15表面活性剂、PLURONICF68嵌段共聚合物、胆酸钠、丙三氧基脱氧胆酸、鞘磷脂、鞘氨醇、1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三氧基-3-磷脂酰乙醇胺、L-a-磷脂酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3胆碱磷酸和蛋磷脂酰胆碱或其混合物。

5.如权利要求1至4任一所述的过敏原制剂，其特征在于，所述的过敏原为过敏原提取物、纯化的过敏原提取物、变性的过敏原提取物或水解的过敏原提取物。

6.如权利要求5所述的过敏原制剂，其中所述的过敏原制剂是由包括以下步骤的方法得到的：

a)提取含有过敏原蛋白的天然过敏原来源，从而形成提取物，

c)对所述的纯化的提取物进行变性从而形成纯化的变性提取物，

d)精炼纯化的变性提取物，除去杂质，形成精炼的变性提取物。

e)任选地对变性的过敏原进行水解，从而形成过敏原水解产物，

f)任选地纯化所述的过敏原水解产物，从而去除分子量在10,000Da以上和1,000Da以下的多肽，从而获得纯化的水解产物，其中70％、优选地为80％的多肽在10,000Da和1,000Da之间

所述的纯化的变性提取物包括蛋白，其中最丰富的(w/w)、共同构成了所有蛋白至少60％(w/w)的蛋白，为至少两种蛋白，且所有蛋白形成纯化的变性提取物的至少60％(w/w)的干重。

7.如权利要求5所述的过敏原制剂，其中所述的水解的过敏原是由包括以下步骤的方法得到的：

a)提取包括过敏原蛋白的过敏原来源，从而形成提取物，

e)任选地用第二变性剂对精炼的变性提取物进行变性，形成变性的过敏原混合物，和

f)任选地水解变性过敏原的混合物，以形成水解的过敏原。

8.如权利要求6或7中所述的过敏原制剂，其中所述的提取是在不含有盐或含有选自下组的盐的溶液中进行的：碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、TRIS和HEPES。

9.如权利要求6至8任一所述的过敏原制剂，其中所述提取物的纯化包含一种或多种选自离子交换层析步骤、凝胶过滤或尺寸排阻层析步骤、沉淀步骤，疏水相互作用层析步骤，伪亲和或亲和层析步骤，或透滤步骤。

10.如权利要求6至9中任一所述的过敏原制剂，其中，所述提取物的至少一个纯化步骤用含有表面活性剂和/或变性剂的溶液进行。

11.如权利要求6至10中任一所述的过敏原制剂，其中，所述的变性用选自下组的变性剂进行：离液剂、还原剂及其混合物，优选选自尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇、硫代甘油、β-巯基乙醇及其混合物。

12.如权利要求11所述的过敏原制剂，其中尿素的浓度为大于4M，优选大于5M，和/或氯化胍的浓度为大于3M，优选为大于4M。

13.如权利要求6至12中任一所述的过敏原制剂，其中，水解是用酶进行，优选为胃蛋白酶，胰蛋白酶或糜蛋白酶。

14.如权利要求6至13中任一所述的过敏原制剂，其中，水解在离液剂的存在下进行，优选选自尿素和氯化胍。

15.如权利要求6至14中任一所述的过敏原制剂，其中过敏原水解产物经纯化去除分子量在10,000Da以上和1,000Da以下的多肽，其中所述肽的去除是通过尺寸排阻色谱法和/或通过超滤进行。

16.如权利要求15所述的过敏原制剂，其中所述的尺寸排阻层析步骤在离液剂的存在下进行，优选地选自尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇和其混合物。

17.如权利要求1至16中任一所述的过敏原制剂，其中所述过敏原选自：花粉过敏原、牛奶过敏原、毒液过敏原、蛋过敏原、野草过敏原、牧草过敏原、树过敏原、灌木过敏原、花卉过敏原、蔬菜过敏原、谷物过敏原、真菌过敏原、水果过敏原、浆果过敏原、坚果过敏原、种子过敏原、大豆过敏原、鱼过敏原、贝类过敏原、海鲜过敏原、肉过敏原、香料过敏原、昆虫过敏原、螨过敏原包括屋尘螨霉菌过敏原、动物变应原、鸽蜱过敏原、蠕虫过敏原、软珊瑚过敏原、动物皮屑过敏原、线虫过敏原、橡胶树过敏原中。

18.含有如权利要求1至17中任一所述的过敏原制剂的药物产品。

19.如权利要求1至16中任一所述的过敏原制剂用于过敏治疗或预防的用途。

20.一种试剂盒，包括一个容器的水包油乳液，和一个容器，包含过敏原的溶液。

21.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述的过敏原可以是过敏原提取物、纯化的过敏原提取物、变性的过敏原提取物或水解的过敏原提取物。