CN105106972A

CN105106972A - miR-338-5p及靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途

Info

Publication number: CN105106972A
Application number: CN201510492970.2A
Authority: CN
Inventors: 徐海燕; 马旭怡; 何小舟; 宋丹
Original assignee: First Peoples Hospital of Changzhou
Current assignee: First Peoples Hospital of Changzhou
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明涉及miR-338-5p及靶向作用于miR-338-5p核酸制剂在调节B淋巴细胞分泌IgG方面用途。miR-338-5p靶向负调控TRAF3，miR-338-5p靶向正调控NF-κB1。miR-338-5p激动剂和拮抗剂可以分别显著抑制或促进了CD20+B细胞分泌IgG的能力。miR-338-5p表达水平的改变导致受B细胞活化因子作用的B细胞分泌IgG能力发生显著变化，miR-338-5p是经靶向作用NF-κB1和TRAF3发挥作用的。

Description

miR-338-5p及靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途

技术领域

本发明涉及一种miRNA的新用途，特别涉miR-338-5p在调节B淋巴细胞产生IgG的新用途。

背景技术

对于器官移植受者来说，抗同种抗体导致的临床处理是最棘手的。

目前临床治疗抗体介导排斥反应主要是通过以下机制：抑制T/B细胞作用，如抗淋巴细胞抗体、霉酚酸脂、钙调神经蛋白抑制剂；清除循环抗体，如血浆置换或免疫吸附；阻断已生成抗体介导的初级或次级损伤，如静脉注射免疫球蛋白或巨细胞病毒免疫球蛋白；抑制或清除B细胞，如利妥昔单抗。迄今为止，临床上仍缺乏单一有效的治疗方法，绝大部分治疗方案是将不同的治疗方法进行组合以期达到较佳的治疗效果。目前临床治疗抗体介导排斥的局限体现在以下几个方面：

(1)抗体介导排斥的逆转是缓慢的而不是迅即的；

(2)费用昂贵；

(3)逆转率低于80％；

(4)治疗后出现慢性排斥的常见表现；

(5)治疗后，抗供者特异性抗体长期存在。

原因是不能有效地作用于成熟浆细胞。Bortezomib是蛋白酶抑制剂，清除产生抗体的浆细胞，抑制MAC形成。有治疗抗体介导排斥的成功病例。然而合适的治疗剂量及疗程尚待研究。肾移植患者应用后的副作用包括：胃肠道毒性、血小板减少症、贫血、低血压和感觉异常。

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是具有抗体活性的蛋白质，在人体免疫应答中起关键作用。作为B细胞的细胞表面受体，Ig在细胞的活化、分化或程序性细胞死亡等多种细胞活动过程中均扮演重要角色。Ig通常能同步实现其结合功能和发挥特异的生物效应。适量的高亲和力IgG的存在是再次体液性免疫应答的一个标志。

特异性识别自体组织抗原的Ig被称为自身抗体，过量自身抗体的存在将导致免疫损伤，是器官移植后排异反应、自身免疫病(如***性红斑狼疮、类风湿关节炎等)的发病机制。IgG是由浆细胞分泌产生的，浆细胞经B细胞发育、分化而来。因而Ig的产生受Ig基因本身的表达调控外，与B细胞存活、分化、发育等密切相关。成功的B细胞分化依赖于细胞信号转导过程的平衡和活化过程的精细调节。这些生命过程均需要相关基因的精细表达调控。

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子核酸，长约18-24碱基。到目前为止，公用miRNA数据库中已收录了千余种人类miRNA序列，其中三分之二已被实验证实。微小RNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度为60-80碱基的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成miRNA。miRNA与靶基因(mRNAs)3’-未翻译区(UTR)互补结合，通常在转录后水平抑制翻译和/或减弱mRNA稳定性，发挥抑制作用。但亦有研究认为，miRNAs可随着细胞周期的进程发挥或抑制或活化的作用。在发生增殖的细胞，扮演抑制作用，而在G1/G0静止期，将发挥活化作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出miR-338-5p及核酸制剂在调节B淋巴细胞分泌IgG方面用途。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是：miR-338-5p的新用途，所述新用途是指miR-338-5p在制备通过调节B淋巴细胞的功能用以治疗器官移植后抗体介导免疫排斥的药物中的用途。

可作为优选的是，所述调节B淋巴细胞的功能是指调节B淋巴细胞分泌IgG的能力。

可作为优选的是，所述B淋巴细胞为已处于B细胞活化因子(BAFF)刺激作用下B淋巴细胞。

靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，所述新用途是指在制备通过调节B淋巴细胞的功能用以治疗器官移植后抗体介导免疫排斥的药物中的用途。

可作为优选的是，所述调节B淋巴细胞的表达是指调节B淋巴细胞分泌IgG的能力。

可作为优选的是，所述B淋巴细胞为已处于BAFF刺激作用下B淋巴细胞。

miR-338-5p的新用途，所述新用途是指miR-338-5p在制备调节B淋巴细胞分泌IgG能力药物中的用途。

靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，所述新用途是指在制备调节B淋巴细胞分泌IgG能力药物中的用途。

本发明的有益效果是：

本发明通过利用生物信息学和现代生物学技术手段对miR-338-5p进行研究分析，发现miR-338-5p靶向作用于TRAF3和NF-κB1，可以调节已处于BAFF刺激作用下B细胞分泌IgG的能力。

这一结果表明可以将miR-338-5p及核酸制剂设计为小核酸药物，具备药物治疗的潜力。不仅仅是治疗抗体介导排斥的潜在药物，而且对于与BAFF信号增强显著相关的如***性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫病亦具有潜在的治疗作用。

附图说明

图1是miR-338-5p靶向调控TRAF3的双荧光素酶报告实验结果；

图2是miR-338-5p靶向调控NF-κB1的双荧光素酶报告实验结果；

图3是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及NF-κB1siRNA转染对CD20+B淋巴细胞表达NF-κB1mRNA水平的影响结果；

图4是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及NF-κB1siRNA转染对CD20+B淋巴细胞表达NF-κB1(p105/p50)蛋白水平的影响结果；

图5是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及NF-κB1siRNA转染对CD20+B淋巴细胞分泌IgG能力的影响结果；

图6是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及TRAF3siRNA转染对CD20+B淋巴细胞表达TRAF3mRNA水平的影响结果；

图7是miR-338-5p激动剂和拮抗剂、以及TRAF3siRNA转染对CD20+B细胞分泌IgG能力的影响结果；

图8是NF-κB1mRNA相对表达量与细胞培养上清中IgG浓度的相关性示意图；

图9是肾移植患者与健康对照人群血清中miR-338-5p表达水平的比较；

图10是血清可溶性BAFF与miR-338-5p水平相关性分析；

图11是血清miR-338-5p与血清抗HLAII抗体水平的相关性分析；

图12是血清可溶性BAFF与血清抗MICA抗体水平的相关性分析；

图13是血清可溶性BAFF与血清抗HLA&MICA抗体水平的相关性分析。

具体实施方式

实施例1

miR-338-5p的靶基因筛选及验证，miR-338-5p为公知序列，其序列可在miRBase数据库(http：//www.mirbase.org)中查询得到：

1、miR数据库搜索：搜索公用miR数据库，发现miR-338-5p的靶基因有608个，包括TRAF3和NF-κB1。TRAF3只受miR-338-5p调节，与其他差异miR不存在调控关系。构建了miR-338-5p的miR-Reg-Net，根据TargeScan分析和GO分析，TRAF3的3’-UTR含有miR-338-5p的互补位点，可能是miR-338-5p的靶基因；而NF-κB1的3’-UTR含有miR-338-5p的互补位点，亦可能是miR-338-5p的靶基因。

2、双荧光素酶报告基因检测miR-338-5p对TRAF3和NF-κB1表达的调控作用：

(1)报告质粒载体的构建

分别将TRAF3和NF-κB1基因的3’-UTR克隆至载体pmiR-RB-ReportTM上的海肾荧光素酶基因(hRluc)下游位点，以海肾荧光素酶基因作为报告基因，以荧光素酶基因(hLuc)作为内参基因，通过检测海肾荧光素酶活性的相对变化来鉴定miR-338-5p对TRAF3和NF-κB1基因是否有调控作用。同时构建突变载体(以TRAF3和NF-κB1基因的3’-UTR定向突变体进行构建)。

(2)细胞转染

取5代以内对数生长期、生长状态良好的293T细胞，用DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)培养，以3×10⁴个/孔的细胞密度铺96孔板，分为4组：实验组1：3’-UTR报告载体+miR-338-5p模拟剂；实验组2：3’-UTR报告载体+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；实验组3：3’-UTR突变体报告载体+miR-338-5p模拟剂；实验组4：3’-UTR突变体报告载体+miR-338-5p模拟剂的阴性对照。

转染混合液的制备：(1)用25μl不含血清培养基I稀释25pmolmiRNA模拟剂(作用终浓度为50nM)，轻轻混匀，室温孵育5分钟；(2)用15μl不含血清培养基I稀释200ng重组质粒，轻轻混匀；(3)用10μl不含血清培养基I稀释1μl脂质体2000，轻轻混匀并室温孵育5分钟。

将上述三种试剂轻轻混匀，室温孵育20分钟。

吸除96孔培养板中的培养基，用无血清培养基I洗1-2遍，轻轻晃动，倾斜吸除，最后加50μlI培养基；将转染混合液加入相应细胞中，轻轻混匀；将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱中培养4-6小时，更换完全培养基，继续培养48小时后检测荧光素酶活性。

(3)荧光素酶活性测定

按LuciferaseAssaySystem说明书进行操作。

1)将试剂盒的荧光底物与缓冲液混合后分装，-80℃保存。使用前平衡至室温。终止液分装后-80℃保存。配置好的荧光底物使用前平衡至室温，并取适量加入终止液，现配现用。

2)取出待检测的培养板，吸去培养基，加入75μl/孔新鲜培养基，并加入75μl现配的荧光底物，涡旋振荡10分钟，利用荧光照度仪检测荧光值(hLuc值)。

3)加入现配的75μl终止液，振荡10分钟，利用荧光照度仪检测荧光值(hRluc值)。设空白对照孔(blank)。每孔最终荧光素相对比值＝(hRluc-blank)/(hLuc-blank)

测定结果如图1和图2所示。

在图1中，实验组1：表达野生型TRAF33’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；

实验组2：表达野生型TRAF33’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂；

实验组3：表达突变TRAF33’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；

实验组4：表达突变TRAF33’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂。

结果显示：与实验组1比较，实验组2的荧光素酶相对活力显著下调(P＜0.05)。实验组3与4之间没有显著差异。

在图2中，实验组1：表达野生型NF-κB13’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；

实验组2：表达野生型NF-κB13’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂；

实验组3：表达突变型NF-κB13’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂的阴性对照；

实验组4：表达突变型NF-κB13’-UTR序列的质粒+miR-338-5p模拟剂。

结果显示：与实验组1比较，实验组2的荧光素酶相对活力显著上调P＜0.05)。实验组3与4之间没有显著差异。

根据图1和及数据：miR-338-5p模拟剂显著下调了报告基因海肾荧光素酶的表达，即miR-338-5p靶向抑制TRAF3。

根据图2和及数据：miR-338-5p模拟剂显著上调了报告基因海肾荧光素酶的表达，即miR-338-5p靶向上调NF-κB1。

因此，TRAF3和NF-κB1受miR-338-5p的靶向调节。miR-338-5p靶向负调控TRAF3，miR-338-5p靶向正调控NF-κB1。

实施例2

从新鲜切除的扁桃体组织中分离纯化CD20+B淋巴细胞。

1、扁桃体组织的处理：

1)新鲜切除的扁桃体组织迅速置于冰盒，送至无菌室；

2)用75％酒精冲洗组织；

3)将组织置于含青/链霉素500U/ml、氟康唑300U/ml的PBS中漂洗30分钟；

4)将组织剪碎，置于200目不锈钢过滤网内，用研磨棒轻轻研磨，收集细胞悬液；

5)细胞计数并流式分析细胞表型。

(2)流式分析细胞表型：

1)取部分单细胞悬液，以荧光抗体(CD19、CD20、BAFF-R、CD3等)进行标记；

2)室温孵育30分钟；

3)用含0.05％BSA的PBS洗2遍；

4)加400μl鞘液上机检测。

(3)磁珠分选CD20+B淋巴细胞

1)根据流式检测结果得到的CD20+B淋巴细胞所占比例，取相应细胞数用以磁珠分选；

2)1000rpm离心5分钟，完全弃去上清；

3)每10⁷细胞加80μlMACS缓冲液，轻轻吹散，混匀；

4)每加80μlMACS缓冲液，对应加入20μlCD20标记磁珠；

5)混匀后，置于4℃冰箱孵育15分钟；

6)每10⁷细胞加1～2mlMACS缓冲液混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清；

7)每10⁸细胞重悬于500μlMACS缓冲液中；

8)选择LS分离柱和midiMACS分离器，安装好分选装置；

9)用3mlMACS缓冲液湿润分离柱，用废液罐收集自分离柱流出的废液；

10)将步骤7中的细胞悬液加入分离柱中，未标记的细胞流出，标记的目的细胞滞留在柱子上；

11)用3mlMACS缓冲液清洗离心管，将其加入分离柱，重复3次；

12)将分离柱从分离装置上取下，置于目的细胞收集管上，加5mlMACS缓冲液，迅速洗脱目的细胞；

13)离心，弃去上清，加无血清OPTI-MEM培养基重悬，使细胞密度为6×106个/ml；

14)计数细胞，分别用以直接转染miR-338-5p激动剂、拮抗剂及相应阴性对照；或间接转染TRAF3siRNA、NFkB1siRNA制剂；

15)直接转染管中加等体积OPTI-MEM培养基，稀释细胞密度至3×106个/ml；

16)取部分细胞进行流式检测细胞表型(CD20、BAFF-R等)。

实施例3

本实施例是将实施例2中所获得细胞进行转染试验，将待转染细胞置于96孔板中培养，密度为3×10⁵/孔，分成8组，每组12复孔。研究分组如下：

A、miR-338-5p激动剂组、miR-338-5p激动剂阴性对照组；

B、miR-338-5p拮抗剂组、miR-338-5p拮抗剂阴性对照组；

C、NF-κB1siRNA或TRAF3siRNA转染组、NF-κB1siRNA或TRAF3siRNA阴性对照转染组；

D、NF-κB1siRNA或TRAF3siRNA+miR-338-5p激动剂共转染组；

E、NF-κB1siRNA或TRAF3siRNA+miR-338-5p拮抗剂共转染组。

miR-338-5p激动剂及相应阴性对照、miR-338-5p拮抗剂及相应阴性对照、siRNA制剂的存贮浓度均为20μM。

转染时，将miR-338-5p相关制剂直接加入细胞悬液混匀，siRNA制剂通过脂质体2000进行转染。具体方法如下：

a、直接转染miR-338-5p激动剂/拮抗剂方法：

1)取98μl细胞悬液，添加2μl激动剂混匀；

2)激动剂阴性对照、拮抗剂、拮抗剂阴性对照转染方法同前。终浓度均为200nM；

b、脂质体2000转染TRAF3siRNA、NF-κB1siRNA及各自阴性对照：

1)0.25μl脂质体2000以25μlOPTI-MEM稀释，轻轻混匀，室温孵育5分钟；0.25μlsiRNA存贮液以25μlOPTI-MEM稀释，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

2)将稀释好的脂质体2000和siRNA混合，室温孵育20分钟；

3)取细胞悬液50μl，加入脂质体与siRNA混合液，轻轻混匀；

4)设miR-338-5p激动剂组和拮抗剂组，每孔分别加入miR-338-5p激动剂或拮抗剂各2μl，混匀；

5)细胞板置37℃，5％CO2培养箱中培养4～6小时；

然后，每孔添加新鲜的完全培养基100μl，同时加入抗IgM抗体2μg/ml和重组人BAFF蛋白200ng/ml、或仅加入抗IgM抗体2μg/ml作用。

至培养第4天时，离心取上清，ELISA法检测IgG水平；收集细胞，提取总RNA或总蛋白，real-timePCR法或westernblot法检测TRAF3和NF-κB1表达水平。

实施例4

ELISA法检测细胞培养上清中IgG水平：

1)IgG标准品稀释；

2)加样：分别设空白孔(此孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释5倍)。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻混匀；

3)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟；

4)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20稀释后备用；

5)洗涤：小心揭掉封板膜，甩干弃液体。每孔加满洗涤液，静置30秒后，甩弃拍干，如此重复5次；

6)加酶：每孔中加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

7)孵育：同第3步；

8)洗涤：同第5步；

9)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(10)终止：每孔加终止液50μl终止反应(此时由蓝色立转黄色)；

(11)测定：以空白孔调零，450nm波长下检测各孔吸光度值。测定反应在加入终止液后15分钟内进行。

real-timePCR法检测TRAF3mRNA水平。

以提取的总RNA为模板进行逆转录反应，生成cDNA。以cDNA为模板进行real-timePCR反应。反应参数同前。

westernblot法检测细胞中NF-κB1表达水平改变

以BCA法对提取的总蛋白进行蛋白定量。Westernblot法检测NF-κB1蛋白(p105、p50)表达，以β-actin为内参。

1)蛋白样品与6×上样缓冲液混匀，于100℃水浴中变性5分钟，室温冷却备用；

2)PAGE凝胶的配制；

3)每孔上样18μl。样品于浓缩胶层电泳时给予电压80v，待样品移动至分离胶上缘时，增加电压至120v。

4)待样品电泳至分离胶下缘时，停止电泳，剥离分离胶，4℃下转膜至硝酸纤维素膜1小时。

5)封闭：以5％脱脂奶粉室温下封闭1小时；

6)洗膜：以TBST洗膜3-4次，每次10分钟；

7)一抗孵育：以兔抗人NF-κB1p105/p50单克隆抗体(1∶1000)4℃孵育过夜；

8)洗膜：以TBST洗膜3-4次，每次10分钟；

9)二抗孵育：以羊抗兔IgG多抗(1∶5000)室温下孵育1小时；

10)洗膜：以TBST洗膜3-4次，每次10分钟；

11)ECL显影；

12)X胶片曝光。

13)利用BIO-Rad凝胶成像***扫描X线片，以QuantityOne图像分析软件对条带的吸光度值和面积，将p105、p50蛋白条带与内参蛋白条带吸光度值的比值作为p105、p50的相对表达量。

上述试验结果如图3、图4、图5、图6、图7、图8所示：

在图3中，1：空白组；2：agomiR转染组；3：agomiR的阴性对照转染组；4：antagomiR转染组；5：antagomiR的阴性对照转染组；6：NF-κB1siRNA转染组；7：NF-κB1siRNA的阴性对照转染组；8：NF-κB1siRNA联合agomiR共转染组；9：NF-κB1siRNA联合antagomiR共转染组。agomiR：miR-338-5p激动剂；antagomiR：miR-338-5p拮抗剂。a：P＜0.05；b：P＜0.01，与空白组比较；d：P＜0.01，与第3组比较；f：P＜0.01，与第5组比较；h：P＜0.01，与第7组比较。

在图4中，A为Westernblot法检测p50和p105蛋白的表达。(1：空白组；2：agomiR转染组；3：agomiR的阴性对照转染组；4：NF-κB1siRNA转染组；5：NF-κB1siRNA联合agomiR转染组。agomiR：miR-338-5p激动剂。B为p50和p105蛋白的半定量分析。a：P＜0.05，与第1组比较；b：P＜0.01，与第1组比较；c：P＜0.05，与第3组比较)。

在图5中，1：空白组；2：agomiR转染组；3：agomiR的阴性对照转染组；4：antagomiR转染组；5：antagomiR的阴性对照转染组；6：NF-κB1siRNA转染组；7：NF-κB1siRNA的阴性对照转染组；8：NF-κB1siRNA联合agomiR共转染组；9：NF-κB1siRNA联合antagomiR共转染组。agomiR：miR-338-5p激动剂；antagomiR：miR-338-5p拮抗剂。

a：P＜0.05；b：P＜0.01，与空白组比较；d：P＜0.01，与第3组比较；f：P＜0.01，与第5组比较；h：P＜0.01，与第7组比较。)

在图6中，A：与未感染组及激动剂阴性对照组比较，激动剂处理沉默了约40％TRAF3mRNA的表达；

B：与未感染组、拮抗剂阴性对照组比较，拮抗剂处理上调了约30％TRAF3mRNA的表达；

C：与未感染组、siRNA阴性对照组比较，TRAF3siRNA沉默了约70％TRAF3mRNA的表达；

D：与未感染组、激动剂阴性对照组及siRNA阴性对照组比较，TRAF3siRNA+激动剂共处理沉默了约80％TRAF3mRNA的表达。*P＜0.05；**P＜0.01。P＜0.05被认为具有统计意义。

结果显示，miR-338-5p激动剂和拮抗剂可以显著改变CD20+B细胞中NF-κB1基因的表达。

在图7中，A：与未感染组及激动剂阴性对照组比较，激动剂处理使B细胞分泌IgG水平显著升高；

B：与未感染组、拮抗剂阴性对照组比较，拮抗剂处理使B细胞分泌IgG水平显著降低；

C：与未感染组、siRNA阴性对照组比较，TRAF3siRNA处理使B细胞分泌IgG水平显著升高；

D：与未感染组、激动剂阴性对照组、siRNA阴性对照组比较，TRAF3siRNA和miR-338-5p激动剂共刺激使B细胞分泌IgG水平显著升高。*P＜0.05；料P＜0.01。P＜0.05被认为具有统计意义。

如图8所示，重组BAFF蛋白与抗IgM抗体共培养体系的培养上清中IgG与NF-κB1mRNA呈显著正相关(r＝0.705，P＜0.05)。

同时，NF-κB1siRNA可以显著降低B细胞中NF-κB1的表达、显著降低B细胞分泌IgG水平；NF-κB1siRNA与miR-338-5p激动剂或拮抗剂共转染体系中，NF-κB1siRNA下调了激动剂对NF-κB1表达的促进作用及对IgG分泌的促进作用、提高了拮抗剂对NF-κB1mRNA的干扰效率及增强了拮抗剂对IgG分泌的抑制作用。

通过Pearson法分析显示，BAFF+抗IgM抗体共培养体系中，细胞培养上清中IgG与NF-κB1mRNA水平呈显著正相关，相关系数为0.705。

miR-338-5p激动剂和拮抗剂可以显著改变以抗IgM抗体和重组BAFF共培养的CD20+B细胞中TRAF3mRNA水平。

并且miR-338-5p激动剂可以显著促进共培养CD20+B细胞分泌IgG的能力。Pearson相关性分析显示，共培养CD20+B细胞培养上清中IgG水平与TRAF3mRNA水平呈显著负相关，相关系数为-0.962(P＜0.001)。

结果证明：miR-338-5p激动剂和拮抗剂分别显著抑制或增强了CD20+B细胞分泌IgG的能力。miR-338-5p表达水平的改变导致B细胞分泌IgG能力发生显著变化，miR-338-5p是经靶向作用NF-κB1和TRAF3发挥作用的。

同时可以想到的是：如果直接增高或降低细胞内miR-338-5p的表达，也是可以达到促进或抑制了CD20+B细胞分泌IgG的能力的。

靶向作用于miR-338-5p的核酸制剂分为两大类：miRNA模拟物或激动剂和miRNA抑制剂或拮抗剂。

实施例5

为进一步验证miR-338-5p表达水平与BAFF表达水平及IgG水平的相关性，进行肾移植患者血清中miR-338-5p、可溶性BAFF(sBAFF)及抗同种抗体水平的检测。

1、采用HumanBAFF/BLys/TNFSF13BImmunoassay试剂盒，按试剂盒操作说明检测肾移植患者血清中可溶性BAFF(sBAFF)的水平，以健康体检者为对照。

(1)试剂准备、标准品制备；

(2)每孔加100μl样本稀释液；

(3)每孔加对应的标准品、样本、对照品各50μl，用膜覆盖，防止孔间污染。室温、摇床孵育3小时，转速为500左右；

(4)吸弃反应液，用洗液洗涤、拍干，重复3次；

(5)每孔加200μlBAFF/BLysConjugate，用新膜覆盖，室温、摇床孵育1小时，转速同上；

(6)重复步骤4；

(7)每孔加200μl底物反应液，避光室温孵育30分钟；

(8)每孔加50μl终止液，观察孔内颜色变化，由蓝变黄；

(9)30分钟内450nm波长下检测每孔的吸光度值。

2、Luminex检测肾移植患者血清抗HLA-I、-II抗体，抗MICA抗体水平。

采用OneLambda公司LABScreenMix(LSM12)试剂盒检测血清抗HLAI、II，抗MICA抗体。操作如下：

(1)将待测样本列在表格上；

(2)将待测样本12000rpm离心5分钟，去除聚合物。准备空板，在每孔中加入2μl微珠，确保微珠加入前已充分混匀。然后每孔加入14μl1×PBS；

(3)参照表格在对应孔中加入离心后的血清样本7μl，样本得到稀释，总体积为21μl；

(4)用封口膜封严，并用混匀器混匀；

(5)室温避光孵育30分钟，孵育过程中轻轻混匀几次；

(6)清洗：孵育结束后，每孔加入180μl1×Labscreenwashbuffer，封口膜封严，用混匀器混匀，3500rpm离心5分钟，离心后检查微球是否沉入孔底，快速将洗液甩入废物箱中；

(7)重复步骤6两次，一共清洗3次；

(8)在清洗过程中稀释二抗，按每管50μl的量用1×洗液将PE-羊抗人IgG按1∶100的比例稀释；

(9)每孔加入50μl二抗，用混匀器混匀；

(10)室温避光孵育30分钟，孵育过程中轻轻混几次；

(11)二次孵育后，3500rpm离心5分钟，然后将二抗甩去；

(12)清洗：重复步骤6两次；

(13)清洗完成后，每孔加入60μl1×PBS，用混匀器混匀样本，将样本转移到读板中，上机读取结果；

(14)统计分析各样本各抗体的平均荧光强度(MFI)值。

3、荧光定量PCR检测血清miR-338-5p水平。

miR-338-5p的real-timePCR扩增反应：

Hsa-miR-338-5p引物混合物(10μmol/L)0.4μl

Uni-miR-qPCR引物(10μmol/L)0.8μl

ROX参照染料II(50x)0.4μl

DNA模板2μl

加水至20μl

反应程序：

50℃2min；

95℃10min、95℃15s为1个循环，进行40个循环；

60℃1min，

进行解离曲线分析。

如图9所示：与健康对照人群比较，肾移植患者血清miR-338-5p水平显著降低(2.79±2.50vs0.09±0.12，P＜0.001)。

ROC分析显示，miR-338-5p的曲线下面积是0.99，其asymptoticsignificance值是0.000。

如图10所示，对血清miR-338-5p与血清sBAFF、各同种抗体进行相关性分析。Spearman法分析显示，所有研究对象血清miR-338-5p与sBAFF呈负相关，相关系数为-0.51。

如图11所示，研究人群血清miR-338-5p与血清抗HLAII抗体水平呈负相关，相关系数＝-0.322。

如图12所示，研究人群血清可溶性BAFF水平与血清抗MICA抗体水平呈负相关，相关系数＝-0.579。

如图13所示，当HLA&MICA抗体MFI值大于1000时，与sBAFF呈显著负相关，相关系数为-0.428。

上述结果表明：在肾移植患者血清中miR-338-5p水平降低时，抗HLAII抗体水平增高。与实施例4中得出结论相应证。

综上所有实施例，可以明确得出miR-338-5p及靶向作用于miR-338-5p制剂具备促进或抑制了CD20+B细胞分泌IgG的能力。

同时，由于IgG免疫球蛋白(ImmunoglobulinG，IgG)是具有抗体活性的蛋白质，在人体免疫应答中起关键作用。作为B细胞的细胞表面受体，Ig在细胞的活化、分化或程序性细胞死亡等多种细胞活动过程中均扮演重要角色。IgG占血清总免疫球蛋白的75％以上，并且其合成速度很快。Ig一方面能够与一组恒定的特异性物质(如Fc受体、信号转导分子、补体的级联成分等)结合，另一方面，Ig具有识别一类特定抗原决定簇的基本序列。Ig通常能同步实现其结合功能和发挥特异的生物效应。适量的高亲和力IgG的存在是再次体液性免疫应答的一个标志。特异性识别自体组织抗原的Ig被称为自身抗体，过量自身抗体的存在将导致免疫损伤，是器官移植后排异反应、自身免疫病(如***性红斑狼疮、类风湿关节炎等)的发病机制。也可以得知，miR-338-5p及靶向作用于miR-338-5p核酸制剂不仅具备制备成治疗抗体介导免疫排斥的药物的用途，还具有制备成治疗***性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫病的药物的用途。

本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

Claims

1.miR-338-5p的新用途，其特征在于：所述新用途是指miR-338-5p在制备通过调节B淋巴细胞的功能以治疗器官移植后抗体介导免疫排斥的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述miR-338-5p的新用途，其特征在于：所述调节B淋巴细胞的功能是指调节B淋巴细胞分泌IgG的能力。

3.根据权利要求1或2所述miR-338-5p的新用途，其特征在于：所述B淋巴细胞为已处于B细胞活化因子刺激作用下B淋巴细胞。

4.靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，其特征在于：所述新用途是指在制备通过调节B淋巴细胞的功能以治疗器官移植后抗体介导免疫排斥的药物中用途。

5.根据权利要求4所述靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，其特征在于：所述调节B淋巴细胞的功能是指调节B淋巴细胞分泌IgG的能力。

6.根据权利要求4或5所述靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，其特征在于：所述B淋巴细胞为已处于BAFF刺激作用下B淋巴细胞。

7.miR-338-5p的新用途，其特征在于：所述新用途是指miR-338-5p在制备调节B淋巴细胞分泌IgG能力药物中的用途。

8.靶向作用于miR-338-5p核酸制剂的新用途，其特征在于：所述新用途是指在制备调节B淋巴细胞分泌IgG能力药物中的用途。