CN105106195A - Caseabalansin E在制备治疗***癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Caseabalansin?E在制备治疗***癌药物中的应用,属于药物领域。研究发现Caseabalansin?E对***癌细胞株PC3和DU145有抑制作用,且抑制作用具有浓度—时间依赖性关系,可以进一步研究开发成制备治疗***癌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及化合物CaseabalansinE的新用途,具体涉及CaseabalansinE在制备治疗***癌药物中的应用。
背景技术
BoWang等人首次分离纯化出化合物CaseabalansinE,并将成果发表在著名天然产物杂志(CytotoxicClerodaneDiterpenoidsfromtheLeavesandTwigsofCaseariabalansae,J.Nat.Prod.,2013,76,1573-1579)。
目前尚未有该化合物关于治疗***癌的活性报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CaseabalansinE的医药用途。
上述目的是通过如下技术方案实现的:
CaseabalansinE在制备治疗***癌药物中的应用,所述CaseabalansinE化学结构式如下,
进一步地,所述***癌为***癌PC3和DU145。
附图说明
图1:不同浓度CaseabalansinE作用72h后PC3和DU145存活率;
图2:10.0mg/LCaseabalansinE作用不同时间后PC3和DU145存活率。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
实施例1:CaseabalansinE的分离制备及结构确证
CaseabalansinE的制备方法同文献报道的制备方法(CytotoxicClerodaneDiterpenoidsfromtheLeavesandTwigsofCaseariabalansae,J.Nat.Prod.,2013,76,1573-1579)。
结构确证:白色无定形固体,分子式为C27H42O6,不饱和度为7。核磁共振氢谱数据δH(ppm,DMSO-d6,600MHz):H-1(1.79,d,J=14.5),H-1(1.91,m),H-2(5.35,br,s),H-3(5.89,d,J=4.1),H-6(3.31,m),H-7(1.74,dt,J=12.6,3.1),H-7(1.38,q,J=12.6),H-8(1.65,m),H-10(2.33,dd,J=14.5,3.2),H-11(1.41,m),H-12(2.46,m),H-12(1.87,m),H-14(6.32,dd,J=17.6,10.8),H-15(5.14,d,J=17.6),H-15(4.44,d,J=10.8),H-16(5.00,s),H-16(4.92,s),H-17(0.89,d,J=7.7),H-18(5.31,br,s),H-19(5.46,s),H-20(0.88,s),H-2’(2.41,m),H-3’(1.62,m),H-3’(1.42,m),H-4’(0.90,t,J=7.4),H-5’(1.35,d,J=6.9),6-OMe(3.17,s),18-OMe(3.20,s);核磁共振碳谱数据δC(ppm,DMSO-d6,150Hz):27.8(CH2,1-C),68.1(CH,2-C),121.1(CH,3-C),149.2(C,4-C),54.8(C,5-C),83.2(CH,6-C),32.0(CH2,7-C),37.6(CH,8-C),38.2(C,9-C),37.0(CH,10-C),31.4(CH2,11-C),25.1(CH2,12-C),148.6(C,13-C),140.5(CH,14-C),112.3(CH2,15-C),115.5(CH2,16-C),15.6(CH3,17-C),104.7(CH,18-C),99.3(CH,19-C),25.9(CH3,20-C),177.7(C,1’-C),42.0(CH,2’-C),27.2(CH2,3’-C),11.6(CH3,4’-C),16.3(CH3,5’-C),57.4(CH3,6-OMe),55.5(CH3,18-OMe)。结构确证数据与文献报道一致,因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的CaseabalansinE。
实施例2:CaseabalansinE的药理作用试验
一、材料和仪器
***癌细胞株PC3(ArCC-CRL-1435)、***癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。CaseabalansinE自制,HPLC归一化纯度大于98%,用二甲基亚矾(DMSO)配制成浓度为1.0g/L的储存液备用。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自Hyelone公司。青/链霉素为上海先锋药业产品。胰蛋白酶购自华美生物工程公司。二甲基亚砜(DMSO)购自上海华舜生物工程公司。琼脂(Agarose)、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)为Sigma公司产品。十二烷基磺酸钠(SDs)、三氯甲基烷基甲烷(Tris)Tris-Hcl、Tritonx-100为Promega公司产品。丙烯酞胺、过硫酸钱(AP)购于苏州化学试剂厂产品。
CO2细胞培养箱(ShellLab),倒置相差显微镜(Nikon),超净工作台(苏州净化设备厂),流式细胞仪(BD),F039300A型酶标仪(Sunrise),高压蒸汽灭菌器(HirayamaHA-300MD),低温超速离心机(Kubota3740),万向摇床(江苏麒麟医用仪器厂TS-92),电泳仪(Gibco公司),LXJ-Ⅱ型离心机(上海医用分析仪器厂),DK600型电热恒温水浴箱(上海精密试验设备公司),电子天平(METTLERTOLEDO),台式干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),紫外分光光度仪(Beckman)。
二、试验方法
1、细胞培养与养护
1.1细胞培养
细胞株培养于肿瘤医院中心实验室。培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,另添加谷氨酞胺(2mmol/L)和抗生素(l00U/青霉素和100mg/L链霉素),置37℃、饱和湿度、含5%CO2气体的培养箱中培养。
1.2细胞传代
①于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁,即可传代。传代前用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。②用吸管吸去培养瓶中的旧培养液,用PBS清洗3次。③加入0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶液2mL进行消化,静置约5分钟,并不时在倒置相差显微镜下观察,当胞质回缩,细胞之间不再连接成片时,加入适量含血清之新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。④用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液,吸入10mL离心管中平衡离心(1000转/分)5分钟。⑤弃去上清液,加入2mL培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液,1:2~3分装入新培养瓶,添加培养液适量于孵箱中继续培养。
2、细胞形态学观察
倒置显微镜观察:将对数生长期PC3和DU145细胞接种于6cm培养皿,培养24h后加入10.0mg.L-1,CaseabalansinE处理24,48,72h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变并记录。
3、细胞毒试验(CCK-8法)
①培养瓶中的细胞消化成单细胞悬液,细胞计数后按照3×104个细胞/孔接种于96孔板,每孔加0.lmL培养基,常规培养于37℃、含5%CO2气体的培养箱中。②试验分组:设阴性对照组(有细胞但不加药,0.1%DMSO),空白对照组(无细胞仅有培养液),CaseabalansinE分别2.5mg/L,5.0mg/L,10.0mg/L和20.0mg/L共6组。③24小时后观察细胞贴壁生长良好,分别按上述试验分组向96孔板内加药,每组设6-8个重复孔。④加药后将96孔板移入37℃、含5%CO2气体的培养箱中继续分别培养24、48和72小时。⑤每组试验结束时每孔加入CCK-810μL,37℃培养箱中继续培养4小时后酶标仪检测450每孔的吸光度(OD)值,测定波长为450nm,参考波长为600nm。⑥按照以下公式计算出细胞存活率(cellviability),然后绘制成图表,存活率为50%时的值即为IC50。细胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。其中As为试验孔,Ac为对照孔,Ab为空白孔。
4、集落形成试验
①取对数生长期细胞,计数后以3×l02个接种于6孔板,每孔加2mL培养基,常规培养于37℃、含5%CO2气体的培养箱中。②24h后观察细胞贴壁生长良好,分别加入不同浓度(0,2.5,5.0,10.0,20.0mg/L)CaseabalansinE处理,每组设3个重复孔。③加药后将6孔板移入37℃、含5%CO2气体的培养箱中继续14天。④10%甲醇固定,Giemsa染色,计算每孔集落数(≥50个细胞的计为一个集落)。⑤计算集落形成率:集落总数/接种细胞数×100%。
三、结果及结论
1、CaseabalansinE对PC3和DU145细胞形态的影响
镜下见对照组细胞贴壁生长,相邻细胞融合成片,细胞呈类圆形或梭形,体积较大,排列紧密,边缘光滑,胞质饱满,核膜、核仁等结构轮廓明显,细胞生长迅速;经10.0mg/LCaseabalansinE处理后,细胞密度逐渐降低,生长速度明显减慢至几乎停滞,细胞逐渐脱落并漂浮于培养液中。细胞体积缩小,胞膜皱缩,成小圆形或不规则形态,胞内多见小颗粒状物质。药物作用时间越长,细胞形态学改变越明显。
2、细胞毒试验
不同浓度CaseabalansinE对***癌细胞株PC3和DU145的生长均有抑制作用。2.5,5.0,10.0,20.0mg/LCaseabalansinE作用两种细胞24,48和72h后的存活率如下表所示(表l及表2)。其中,10.0mg/LCaseabalansinE作用于PC3和DU145细胞24,45,72h后的细胞存活率分别为56.2%,42.5%,24.3%和50.8%,32.6%,20.7%;2.5,5.0,10.0,20.0mg/L,CaseabalansinE作用两种细胞72h后的存活率分别为54.3%,37.7%,24.3%,13.2%和52.4%,32.8%,20.7%,11.2%(见图1及图2)。两因素方差分析示不同浓度与不同时间处理组之间差别具有统计学意义(P<0.05),提示CaseabalansinE对PC3和DU145的生长抑制作用呈时间浓度依赖。
3、集落形成试验
试验显示,对照组PC3和DU145的集落形成率分别为67.7和64%,而2.5,5.0,10.0,20.0mg/LCaseabalansinE处理组分别为60.7%,51.3,39.3%,27.0%和49.7%,34.0%,27.7%,15.7%(见表3)。这进一步证实了CaseabalansinE对PC3和DU145细胞具有增殖抑制作用。
结论,本试验中通过CCK-8法和集落形成试验来验证CaseabalansinE对***癌细胞株PC3和DU145的作用,且抑制作用具有浓度——时间依赖性关系。CaseabalansinE可能成为晚期***癌治疗中的一个具有潜力的选择。
表1不同浓度CaseabalansinE作用于PC3后的细胞存活率
时间/浓度 | 2.5mg/L | 5.0mg/L | 10.0mg/L | 20.0mg/L |
24h | 0.825 | 0.731 | 0.562 | 0.422 |
48h | 0.69 | 0.53 | 0.425 | 0.226 |
72h | 0.543 | 0.377 | 0.243 | 0.132 |
表2不同浓度CaseabalansinE作用于DU145后的细胞存活率
时间/浓度 | 2.5mg/L | 5.0mg/L | 10.0mg/L | 20.0mg/L |
24h | 0.809 | 0.604 | 0.508 | 0.375 |
48h | 0.646 | 0.481 | 0.326 | 0.173 |
72h | 0.542 | 0.328 | 0.207 | 0.112 |
表3不同浓度CaseabalansinE作用下PC3和DU145的集落形成率
Claims (2)
1.CaseabalansinE在制备治疗***癌药物中的应用,所述CaseabalansinE化学结构式如下,
2.根据权利要求1所述的CaseabalansinE在制备治疗***癌药物中的应用,其特征在于:所述***癌为***癌PC3和DU145。
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CN105330714A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-02-17 | 杨飞杰 | 一种新的柠檬苦素类化合物及其制备方法和治疗***癌的医药用途 |
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CN105712878A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-06-29 | 温州统益生物医药科技有限公司 | 一种二萜化合物及其制备方法 |
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