CN105102976A - 用于连续监测水中铬的微流控芯片及包含它的测铬装置 - Google Patents
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Abstract
根据本发明的一个方面的微流控芯片，包括：第一基板，形成有用于混合试样和试剂的还原通道、用于混合试剂的试剂混合通道、及一侧端部与所述还原通道和所述试剂混合通道并联连接而另一侧端部与排出口连接的检测通道；以及第二基板，具有面向所述检测通道且使光线透过的检测部，所述第二基板与所述第一基板结合。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用化学发光法连续监测存在于水中的铬浓度的微流控芯片及包含它的测铬装置。
背景技术
铬是主要用于合金、颜料、皮革、纺织工业、催化剂、木材防腐剂等的物质，由于具有化学稳定性多用作防止金属腐蚀的镀金材料。随着上述的工业生产活动的增加，铬的排放造成了地表水及地下水的污染。
天然铬离子以多种化合价形式存在，但水中只存在最稳定的铬(III)和铬(IV)。铬(III)是参与葡萄糖、胆固醇、脂肪等代谢的必要营养素，如果缺少铬(III)，体重就会减少，还会造成从血液中清除葡萄糖的功能受损。而且，如果铬(III)长时间接触皮肤，可能会导致过敏或者癌症。但是，铬(III)对水的溶解度以及对生物膜的渗透性较低，因此一般认为毒性不高。与此不同，铬(IV)对水的溶解度和迁移率较高，而且氧化能力和对生物膜的渗透性较高，会给肾、肝、肺等各种内脏器官带来不良影响，还会引起皮肤或黏膜的炎症。
如上所述，由于铬(III)和铬(IV)的不同特性和毒性，对这些各自的浓度准确地进行分析非常重要。尤其，铬(III)和铬(IV)根据环境通过氧化还原反应彼此容易被转化，因此需要对水质持续进行监测。根据韩国的水污染物排放标准，在水资源保护区内被允许的总铬浓度为0.5ppm，在其他地区则限制为2ppm以下，而铬(IV)的浓度在水资源保护区为0.1ppm，在其他地区则限制为0.5ppm以下。此外，美国环境保护局(EnvironmentalProtectionAgency，EPA)规定铬(IV)为致癌物质，饮用水中被允许的总铬浓度限制在0.1ppm以下。
在用于分析水中铬的现有技术中，利用化学发光反应的铬分析是测定如以下[反应式1]所示在碱性条件下及铬(III)催化剂存在下被过氧化氢氧化的鲁米诺(luminol，5-amino-2，3-dihydro-1，4-phthalazinedione)所发出的光线(425nm)的强度。此时发出的光线的强度与铬(III)的浓度成比例，因此通过测定光线的强度可以对铬(III)进行定量分析。
[反应式1]
对于铬(IV)而言，因为不直接参与鲁米诺的化学发光反应，所以在酸性条件下使用还原剂将铬(IV)还原成铬(III)后，对总铬浓度进行分析。铬(IV)被还原成铬(III)的反应如[反应式2]所示。
[反应式2]
通过化学发光法对铬(III)和铬(IV)进行分析的方法如下：首先，将试样与还原剂进行反应，使试样中的铬(IV)被还原成铬(III)后，再测定总铬浓度。同时，不使用还原剂测定铬(III)的浓度，再计算出总铬与铬(III)的浓度之差就可得到铬(IV)的浓度。现有技术适用所述的方法开发出了用于分析水中铬的微流控芯片，但是存在如下问题。
第一、在碱性条件下由过氧化氢引起的鲁米诺氧化反应由于反应速速非常快，为了有效地测定最大化学发光，需要尽量减小注入鲁米诺和过氧化氢的化学发光试剂混合通道的长度。而且，为了准确地分析铬(IV)的浓度，应当将试样中的铬(IV)100％还原成铬(III)，因而需要充分的反应时间。因此，应当设计成还原通道的长度相对长于化学发光试剂混合通道的长度。然而，在现有技术中，化学发光试剂混合通道的长度与用于使铬(IV)被还原成铬(III)的还原通道的长度相同，因此无法准确地检测出铬(III)和铬(IV)的浓度，而且检测灵敏度下降。
第二、利用鲁米诺的化学发光反应不仅在铬(III)的存在下产生，还会在其他金属离子(铁(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)等)的存在下产生。现有技术没有考虑到对这些干扰物质的效果，因此无法选择性分析试样中铬的浓度。
第三、因为与分析铬(III)时注入的蒸馏水混合的过程中试样的pH值发生变化，存在其他金属离子的现场试样中会生成铬(III)和金属离子的混合结晶，进而可能会发生铬(III)也一起沉淀的共沉淀现象。如果发生共沉淀现象，就会造成注入微流控芯片的试样中的铬(III)浓度减少，进而导致分析误差，所述沉淀还会造成微流控芯片被堵塞。
第四、为了分析铬(III)和铬(IV)，需要两个校准曲线(calibrationcurve，总铬和铬(III)的校准曲线)。
第五、由于微流控芯片用透明玻璃基板制作周围的光线进入检测器，因此检测灵敏度下降，还会导致装置运用变得困难。
发明内容
技术问题
本发明提供一种为了通过化学发光法连续监测水中铬，不用进行分离过程可在连续流动状态下对铬(III)和铬(IV)以高效率、高灵敏度进行检测，而且可在没有干扰物质造成的影响的情况下对铬进行选择性检测的微流控芯片及包含它的测铬装置。
技术方案
根据本发明的一个方面的微流控芯片，第一基板，形成有用于混合试样和试剂的还原通道、用于混合试剂的试剂混合通道、及一侧端部与所述还原通道和所述试剂混合通道并联连接而另一侧端部与排出口连接的检测通道；以及第二基板，具有面向所述检测通道且使光线透过的检测部，所述第二基板与所述第一基板结合。
所述还原通道可更长于所述试剂混合通道，所述第一基板和第二基板能够由具有可吸光的颜色的材料形成，或者被染成可吸光的颜色。
所述第一基板上可形成有用于注入试样的试样注入口和用于注入还原剂的还原剂注入口，所述试样注入口以试样通道为中介体与还原通道连接，所述还原剂注入口以还原剂通道为中介体与还原通道连接，而且所述第一基板上可形成有用于注入第一试剂的第一试剂注入口和用于注入第二试剂的第二试剂注入口，所述第一试剂注入口通过第一试剂通道与试剂混合通道连接，所述第二试剂注入口通过第二试剂通道与试剂混合通道连接。
所述检测通道可重叠配置且一侧端部和另一侧端部交互连接，所述检测通道从中央越向两边侧端越减小，而且所述还原通道和所述试剂混合通道可重叠配置且一侧端部和另一侧端部交互连接。
根据本发明的另一个方面的测铬装置，包括：微流控芯片，包括第一基板及第二基板，其中第一基板形成有用于混合试样和试剂的还原通道、用于混合试剂的试剂混合通道、及一侧端部与所述还原通道和所述试剂混合通道并联连接而另一侧端部与排出口连接的检测通道，而第二基板具有面向所述检测通道且使光线透过的检测部，所述第二基板与所述第一基板结合；检测器，配置成面向所述检测部；以及供应部，用于向所述微流控芯片供应试样及试剂。
所述还原通道可更长于所述试剂混合通道，所述第一基板和第二基板能够由具有可吸光的颜色的材料形成，或者被染成可吸光的颜色。
所述第一基板上可形成有用于注入试样的试样注入口、用于注入还原剂的还原剂注入口、用于注入第一试剂的第一试剂注入口、及用于注入第二试剂的第二试剂注入口。
所述供应部可向所述试样注入口供应试样，向所述还原剂注入口供应亚硫酸钾，向所述第一试剂注入口供应溶解于碱性条件的缓冲溶液的鲁米诺，向所述第二试剂注入口供应溶解于碱性条件的缓冲溶液的过氧化氢。
所述供应部可将溴离子与所述第一试剂及所述第二试剂一起供应至所述微流控芯片，所述供应部可将乙二胺四乙酸(EDTA；ethylenediaminetetraaceticacid)与所述第一试剂及所述第二试剂一起供应至所述微流控芯片。
所述检测通道可重叠配置且一侧端部和另一侧端部交互连接，所述检测通道从中央越向两边侧端越减小。
有利效果
在本发明中，微流控芯片内制作还原通道以使试样中的铬(IV)能够均被还原成铬(III)，从而可以准确地分析铬(III)和铬(IV)。
而且，通过非对称的设计使注入化学发光试剂的试剂混合通道和注入试样的还原通道具有不同长度，藉以尽量减少在试剂混合通道中产生的化学发光的损失，从而可以低检测极限和高灵敏度对铬进行检测。
而且，在检测通道中包含于化学发光试剂的络合剂与试样相遇除去试样中存在的会产生干扰效果的金属离子，从而可以在连续流动状态下对铬进行选择性检测。
而且，分析铬(III)时由还原剂注入口注入试样，因此不会发生铬(III)的沉淀或者与干扰金属的共沉淀现象，从而可以准确地进行铬浓度的分析。
此外，铬(III)的校准曲线的斜率2倍于总铬的校准曲线的斜率，因此只用总铬的校准曲线就能分析铬(III)和铬(IV)的浓度，从而可以缩短分析时间。
本实施例的微流控芯片用吸光材料制成，以防周围的光线进入到检测器，从而可以得到高灵敏度的稳定的化学发光信号，容易应用于现场。
附图说明
图1是示出本发明一实施例的微流控芯片上板的俯视图。
图2是示出本发明一实施例的微流控芯片下板的俯视图。
图3是示出本发明一实施例的测铬装置的结构图。
图4a示出基于化学发光试剂中有无0.1M溴离子以及铬(IV)浓度的化学发光信号。
图4b示出基于化学发光试剂中有无0.1M溴离子的铬(IV)的校准曲线。
图5示出基于由黑色微流控芯片和透明微流控芯片得到的铬(IV)浓度的化学发光信号。
图6是对出现在检测通道的500ppb铬(III)的化学发光用冷却型CCD(CooledCCD)照相机进行观察的照片。
图7a示出基于试剂混合通道长度变化的铬(IV)的化学发光信号。
图7b示出基于试剂混合通道长度变化的铬(IV)的校准曲线。
图7示出化学发光信号，这些化学发光信号是在还原通道更长于试剂混合通道的微流控芯片(微流控芯片A)和还原通道与试剂混合通道的长度相同的微流控芯片(微流控芯片B)，用1000ppb总铬中铬(III)和铬(IV)的比例不同的标准试样来测定的。
图8a示出基于注入还原剂而得到的铬(III)和铬(IV)浓度的化学发光信号。
图8b示出注入还原剂而得到的铬(III)和铬(IV)的校准曲线。
图9a示出基于总铬和铬(III)浓度的化学发光信号。
图9b示出总铬和铬(III)的校准曲线。
图10示出基于混合有铬(III)和铁(II)的试样中有无EDTA以及有无还原剂的铬(III)的化学发光信号。
图11示出混合有铬(III)和铁(II)的试样中注入蒸馏水而得到的铬(III)的化学发光信号。
具体实施方式
下面，参照附图详细说明本发明的实施例，以使本发明所属领域的技术人员容易实施本发明。本发明能够以各种不同方式实施，并不限于下述实施例。
图1是示出本发明一实施例的微流控芯片上板的俯视图，图2是示出本发明一实施例的微流控芯片下板的俯视图。
本实施例的微流控芯片30包括上板(第一基板)10和下板(第二基板)20。上板10为方板形状，上板10上形成有试样注入口11、还原剂注入口12、第一试剂注入口13及第二试剂注入口14。而且，试样注入口11上形成有用于与试样注入管52结合的连结部31，还原剂注入口12上形成有用于与还原剂注入管53结合的连结部32。
第一试剂注入口13上形成有用于与试剂注入管54结合的连结部34，第二试剂注入口14上形成有用于与试剂注入管55结合的连结部35。
另外，上板10上形成有试样通道11a、还原剂通道12a、第一试剂通道13a、第二试剂通道14a、还原通道15、试剂混合通道16及检测通道17。试样注入口11与试样通道11a连接，还原剂注入口12与还原剂通道12a连接。通过试样注入口11注入含有铬的试样，通过还原剂注入口12注入用于还原铬(IV)的亚硫酸钾等还原剂。
试样通道11a和还原剂通道12a与还原通道15连接，在还原通道15中试样和还原剂被混合，包含在试样中的铬(IV)被还原剂还原成铬(III)。还原通道15重叠配置且一侧端部与另一侧端部交互连接。还原通道15的一侧端部与试样通道11a及还原剂通道12a连接，而另一侧端部与检测通道17连接。
第一试剂注入口13与第一试剂通道13a连接，第二试剂注入口14与第二试剂通道14a连接。可由第一试剂注入口13注入溶解于碱性条件缓冲溶液的鲁米诺、溴离子及EDTA，可由第二试剂注入口14注入溶解在用于溶解所述鲁米诺的碱性条件缓冲溶液中的过氧化氢、溴离子及EDTA。
第一试剂通道13a及第二试剂通道14a与试剂混合通道16连接，在试剂混合通道16中鲁米诺和过氧化氢被混合。试剂混合通道16重叠配置且一侧端部与另一侧端部交互连接。试剂混合通道16的一侧端部与第一试剂通道13a及第二试剂通道14a连接，而另一侧端部与检测通道17连接。
检测通道17的一侧端部与还原通道15和试剂混合通道16连接，而另一侧端部上形成有排出口18，以便排出用于反应的试剂和试样。排出口18上形成有连结部33，以便与排出管结合。
检测通道17重叠配置且一侧端部与另一侧端部交互连接。重叠的检测通道17的长度从中央越向两边侧端越减小，检测通道17的中心配置成与圆形检测部21的中心对齐。
检测通道17的一侧端部与还原通道15和试剂混合通道16并联连接，因此在检测通道中相遇的试样和试剂被混合，从而消除试样中的干扰效果，同时产生化学发光反应。
还原通道15的长度是试剂混合通道16长度的2倍至6倍。由此，铬(IV)可经还原通道15均被还原剂还原成铬(III)。而且，由于试剂混合通道16的长度形成得较短，使得在试剂混合通道16中发生的化学发光的损失减少到最低，从而能够以低检测极限和高灵敏度对铬进行检测。
连结部31、32、33、34、35由聚合物或管子(tubing)等形成，并且具有孔洞以便管或管道能够易于装卸地结合。
上板10可由具有吸光性的聚合物形成，特别是可由黑色聚二甲基硅氧烷(PDMS，polydimethylsiloxane)形成。但，上板10可由具有吸光性的各种颜色的材料形成，或者可被染成具有吸光性的颜色。
此外，在下板20中与上板10的检测通道17对应的下部形成有检测部21。下板20由黑色的PDMS形成，检测部21填充有透明PDMS以便由化学发光反应产生的光线透过。检测部21可通过在黑色PDMS形成孔洞后注入透明PDMS的方式形成。但，下板20被染色时，只有检测部不会被染色而形成为透明。
如上所述，当上板10和下板20形成为具有吸光性，就会吸收从外部射入的光线，从而可以得到稳定的化学发光信号，而且可以提高检测极限和灵敏度。
下面，对上板10和下板20的制造方法进行说明。在准备好的硅晶片上旋涂光刻胶后，放置光掩模的状态下照射紫外线，再经固化及显影而形成阳刻图案。
形成有阳刻图案的硅晶片上浇注黑色PDMS经固化后，将上板10从晶片分离就能得到形成有阴刻图案的黑色PDMS上板。下板20也采用与上板10相同的方法制造。
对于上板10和下板20，其结合部分通过电弧放电进行表面处理后，以上板10的检测通道17的中心与下板20的检测部21的中心对齐的方式进行结合。
试样和还原剂经还原通道15移动到检测通道17，试剂经试剂混合通道16移动到检测通道17，从而引起化学发光反应。在检测通道17引起化学发光反应后的试样和试剂移动到排出口18。
图3是示出本发明一实施例的测铬装置的结构图。
参照图3可知，本实施例的测铬装置，包括插设于形成外形的壳体41内且配置在检测部21下方的检测器42、微流控芯片30以及向微流控芯片30供应试样和试剂的供应部51。壳体41形成为略呈长方体的箱子形状。壳体41由染成黑色的金属形成以便吸收光线，微流控芯片30固设于壳体41的上面。由此，阻断外部光线进入检测器42，进而只有经化学发光反应产生的光线通过检测部21射入检测器42。
另外，设于试样注入口11的连结部31上接设有试样注入管52，设于还原剂注入口12的连结部32上接设有还原剂注入管53。而且，设于第一试剂注入口13的连结部34上接设有第一试剂注入管54，设于第一试剂注入口14的连结部35上接设有第二试剂注入管55。
供应部51上设有蠕动泵，供应部51向试样注入管52供应试样，并向还原剂注入管53供应亚硫酸钾。而且，供应部51向第一试剂注入管54供应鲁米诺，并向第二试剂注入管55供应过氧化氢。
供应部51连续供应试剂和试样，所供应的试样和试剂反应后通过排出口18被排出。由此，本实施例的测铬装置可连续监测铬。
供应部51将溴离子与试剂一起供应到微流控芯片30，由此化学发光强度增加，进而提高测铬装置的灵敏度，测铬装置会具有更低的检测极限。而且，供应部51将EDTA与试剂一起供应。EDTA在碱性条件下与金属离子反应而形成络合物，由此除去参与试样所含鲁米诺的化学发光反应的其他金属离子，从而可以避免铬浓度的测定不准确。
检测器42接入电源61。而且，检测器42上接设对检测器42中产生的信号进行加工处理的数字万用表62，数字万用表62将处理后的信号传送到相连的计算机63。
[实验例1]
在实验例1中，利用本实施例的微流控芯片及包含它的测铬装置来测定了基于铬浓度的化学发光强度。化学发光试剂用于从试样检测出铬(III)，其在碱性条件下与铬(III)进行反应引起化学发光。化学发光试剂由鲁米诺和过氧化氢组成，化学发光的强度根据鲁米诺和过氧化氢的浓度会发生变化。
用于化学发光法的缓冲溶液制备方法如下：将30.09g的硼酸(H3BO3)、10.2g的溴化钾(KBr)、2.92g的EDTA((HOOCCH2)2HNCH2CH2NH(CH2COOH)2)溶解于蒸馏水中，再利用5M的氢氧化钾(KOH)溶液将pH值调成10.9，并使最终体积成为1L。化学发光试剂的制备方法如下：将0.02g的鲁米诺溶解于缓冲溶液并调整pH值达到10.9后，使最终体积成为100mL。氧化剂的制备方法如下：将0.868mL的过氧化氢溶解于所述缓冲溶液并调整pH值达到10.9后，使最终体积成为100mL。用于使铬(IV)被还原成铬(III)的还原剂其制备方法如下：将0.1104g的亚硫酸钾(K2SO3)溶解于蒸馏水并调整pH值达到2.5后，使最终体积成为100mL。铬(III)和铬(IV)的标准试样其制备方法如下：分别将硝酸铬九水合物(Cr(NO3)3·9H2O)和铬酸钾(K2CrO4)溶解于蒸馏水制备1000ppm的溶液后，通过稀释以5ppb、50ppb、125ppb、250ppb、500ppb、1000ppb的浓度分别进行制备。
化学发光试剂即鲁米诺通过第一试剂注入口13注入，而过氧化氢通过第二试剂注入口14注入。试样通过试样注入口11、还原剂通过还原剂注入口12分别予以注入。注入各溶液时使用的蠕动泵的流速为7.5μL/min。
图4a示出基于化学发光试剂中有无0.1M溴离子以及铬(IV)浓度的化学发光信号，图4b示出基于化学发光试剂中有无0.1M溴离子的铬(IV)的校准曲线。
本实验例中使用的标准试样为5ppb、50ppb、125ppb、250ppb、500ppb、1000ppb的铬(IV)，注入还原剂并使用添加0.1M溴离子的化学发光试剂和未添加溴离子的化学发光试剂，连续测定了基于各浓度的化学发光信号。溴离子会攻击碱性条件下金属离子、过氧化氢及鲁米诺反应而生成的复合体。由此，会生成更多的引起化学发光的激发态邻苯二甲胺(3-aminophthalate)，使得化学发光强度增加。如图4a所示，使用添加0.1M溴离子的化学发光试剂时，与使用未添加溴离子的化学发光试剂时相比，化学发光强度大为增加。
在图4b中，添加0.1M溴离子的化学发光试剂的校准曲线为y＝0.00100x+0.00289(R2＝0.9999)，而未添加溴离子的化学发光试剂的校准曲线为y＝0.000182x+0.000212(R2＝0.9999)。其中，y表示化学发光强度，x表示浓度，R2表示线性系数。这种校准曲线是使用由待分析物质制备的标准试样，从低浓度开始按照浓度顺序测定化学发光强度后，将基于待分析物质浓度的化学发光强度的关系用线来表示的。
如图4b所示，使用添加0.1M溴离子的化学发光试剂时，与使用未添加溴离子的化学发光试剂时相比，校准曲线的斜率增加约5.5倍。
而且，添加0.1M溴离子时，检测极限为0.32ppb，与未添加溴离子时的检测极限1.3ppb相比，具有大约低4倍的检测极限。因此，通过化学发光试剂中添加0.1M溴离子能够以更高的灵敏度和低检测极限对铬进行检测。
[实验例2]
在本实验例2中，将上板10和下板20均用黑色PDMS制作和用透明PDMS制作的微流控芯片适用于测铬装置，并测定了总铬的化学发光强度。本实验例是在暗室进行的。
图5示出基于由黑色微流控芯片和透明微流控芯片得到的铬(IV)浓度的化学发光信号。
如图5所示，用透明PDMS制作的微流控芯片由于外部光线进入检测器，本底信号(backgroundsignal)的强度和信号的噪声大为增加，由铬(IV)标准试样(5ppb、50ppb、125ppb、250ppb、500ppb、1000ppb)得到的化学发光信号也因周围的光线和化学发光反应中产生的光线的散射而导致信号不稳定且噪声大。
而且，随着本底信号强度大大增加，50ppb以下的铬(III)的化学发光信号无法与本底信号区别。如上所述，对于由使用透明PDMS制作的微流控芯片得到的化学发光信号，随着本底信号的强度和噪声的增加，检测极限变高，且可检测的铬的浓度范围缩小。
反观使用黑色PDMS制作的微流控芯片，由于阻断了外部光线进入检测器，本底信号的强度和噪声降低，化学发光信号非常稳定。测铬装置通过使用由黑色PDMS制作的微流控芯片有效地阻断了外部光线，从而能够以更高的灵敏度和低检测极限对铬进行检测，还能扩大可检测的铬的浓度范围。
[实验例3]
在本实验例3中，将500ppb铬(III)由试样注入口注入，并用冷却型CCD(CooledCCD)照相机观察了化学发光。图6是对出现在检测通道的500ppb铬(III)的化学发光用冷却型CCD(CooledCCD)照相机进行观察的照片。化学发光在检测通道17的中间部分出现得最为强烈，而起始部分和末尾部分的化学发光强度相对弱于中间部分。这一结果表明，微流控芯片的设计和试剂的条件得到优化，使得能够测定从化学发光出现至消失由化学发光反应产生的大部分光线，从而可进行高灵敏度的铬检测。
[实验例4]
在本实验例4中，将还原通道的长度固定成一定长度100cm，而改变试剂混合通道16的长度分别为0cm、20cm、60cm、100cm，并测定了化学发光强度。
图7a示出基于试剂混合通道长度变化的铬(IV)的化学发光信号，图7b示出基于试剂混合通道长度变化的铬(IV)的校准曲线。
本实验例中使用的标准试样为5ppb、50ppb、125ppb、250ppb、500ppb、1000ppb的铬(IV)，注入还原剂连续测定了基于各浓度的化学发光信号。碱性条件下由过氧化氢引起的鲁米诺氧化反应的反应速度非常快，因此化学发光试剂即鲁米诺和过氧化氢即使在没有起催化作用的铬(III)的情况下，也在试剂混合通道16进行反应而引起化学发光。因此，如图7a所示，试剂混合通道16的长度越长，在检测通道17发生的化学发光的强度越降低，图7b是由图7a得到的校准曲线，随着试剂混合通道16的长度变长，校准曲线的斜率减小。然而，如果没有试剂混合通道16，将试剂直接注入检测通道时(试剂混合通道为0cm)，因为与还原通道15的长度之差会产生大的压力差，致使化学发光信号很不稳定，在图7b的校准曲线上500ppb铬(IV)的化学发光强度超出线性范围。
检测装置的灵敏度取决于校准曲线的斜率和测定的重现性。在图7b中，除了试剂混合通道16的长度为0cm的情形之外，对于其他情形可以假设测定的重现性相同。因此，基于试剂混合通道16长度的铬检测灵敏度取决于校准曲线的斜率，所以试剂混合通道16的长度为20cm时最高。
[实验例4]
本实验例4中，为了确认铬(IV)被还原成铬(III)的还原率，准备总铬浓度同为1000ppb且铬(III)和铬(IV)的比例不同分别为3∶7、5∶5、7∶3的标准试样，将该标准试样分别依次注入微流控芯片A和微流控芯片B，并测定了化学发光信号。
图7示出化学发光信号，这些化学发光信号是在还原通道更长于试剂混合通道长的微流控芯片A(还原通道15：100cm，试剂混合通道16：20cm)和还原通道和试剂混合通道的长度相同的微流控芯片B(还原通道15：20cm，试剂混合通道16：20cm)，用1000ppb总铬中铬(III)和铬(IV)的比例不同的标准试样来测定的。
对于微流控芯片A，试样中包含的铬(IV)均被还原成铬(III)，虽然试样中的铬(III)和铬(IV)的成分比不同，但显示出相同的化学发光强度。
对于微流控芯片B，试样中包含的铬(IV)只有一部分被还原成铬(III)，因此具有不同成分比的试样分别显示出不同的化学发光强度。
如上所述，根据本发明，由于还原通道15的长度比试剂混合通道16的长度更长，可以准确地测定铬(IV)的浓度。
[实验例5]
在本实验例5中，为了确认浓度范围大的铬(IV)是否100％还原成铬(III)，将5ppb、50ppb、125ppb、250ppb、500ppb、1000ppb的铬(III)及铬(IV)标准试样分别依次注入试样注入口11，将还原剂注入还原剂注入口12，并测定了化学发光信号。
图8a示出注入还原剂而得到的基于铬(III)和铬(IV)浓度的化学发光信号，图8b示出注入还原剂而得到的铬(III)和铬(IV)的校准曲线。
如图8a所示，各浓度的铬(III)和铬(IV)显示出几乎相同的化学发光强度。
在图8b中，铬(III)的校准曲线为y＝0.00100x-0.00115(R2＝0.9999)，铬(IV)的校准曲线为y＝0.00100x+0.00127(R2＝0.9999)。其中，y表示化学发光强度，x表示浓度，R2表示线性系数。
铬(III)和铬(IV)的校准曲线其斜率相同，y轴截距有非常微小的差异，因此将各自的校准曲线示于一个图上的结果，如图8b所示两个校准曲线重叠。
从图8的结果可知，微流控芯片和包含它的化学发光检测装置可以将浓度范围(5～1000ppb)大的铬(IV)100％还原成铬(III)，因此可以准确地检测出铬(III)和铬(IV)的浓度，不会有分析误差。
[实验例6]
本实验例6测定了分别由5ppb、50ppb、125ppb、250ppb、500ppb、1000ppb的总铬和铬(III)标准试样得到的基于浓度的化学发光信号。
图9a示出基于总铬和铬(III)浓度的化学发光信号，图9b示出总铬和铬(III)的校准曲线。
对于相同浓度的试样，铬(III)的化学发光强度为总铬化学发光强度的2倍。如图8a所示，注入还原剂时，相同浓度的铬(III)和铬(IV)具有几乎类似的化学发光强度。然而，在本实验例6中，分析铬(III)时，由试样注入口11和还原剂注入口12注入试样，而分析总铬时，仅由试样注入口11注入试样，并由还原剂注入口12注入还原剂，因此试样的浓度被稀释为1/2，所以相同浓度的铬(III)的化学发光强度为总铬的化学发光强度的2倍。
图9b是将图9a所示基于浓度的化学发光信号分别针对总铬和铬(III)重复三次而得到校准曲线，可知重现性非常高，因而相对标准偏差非常小。在图9b中，铬(III)的校准曲线为y＝0.00200x+0.00112(R2＝0.9999)，总铬的校准曲线为y＝0.00100x+0.00289(R2＝0.9999)。其中，y表示化学发光强度，x表示浓度，R2表示线性系数。
根据本实验例6可知，铬(III)校准曲线的斜率为总铬校准曲线的斜率的2倍。利用这种关系，通过总铬校准曲线分析现场试样中存在的总铬和铬(III)、铬(IV)的浓度的结果与通过两个校准曲线(总铬和铬(III)的校准曲线)来计算的结果类似(表2)。如上所述，本发明的测铬装置仅通过总铬校准曲线可以准确地分析总铬和铬(III)、铬(IV)，可大大减少分析时间。
从本实验例6得到的总铬和铬(III)各自的检测极限为0.32ppb、0.13ppb。而且，线性段为5ppb～1000ppb包含法律限制浓度，因此不用进行试样的稀释或浓缩等预处理就可以进行铬检测。
[实验例7]
对于鲁米诺化学发光反应，除了铬(III)之外，其他金属离子(钴(II)、铁(II)、铜(II)、镍(II)等)也参与反应，金属离子包括铬对水的溶解度和迁移率很大程度上依赖pH值。例如，酸雨等原因会引起水的酸化，使水的pH值降至4.0～4.5导致金属离子的浓度增加，干扰金属离子造成的影响会变得更加严重。本实验例7的目的是确认，水的酸化导致pH值变化时，是否还可以在没有其他金属离子造成的干扰效果的情况下对铬进行选择性检测。
对于干扰金属离子造成的效果，使用EDTA就可以消除。EDTA在碱性条件下与金属离子反应而形成络合物，形成络合物的金属离子不会参与化学发光。相反，铬(III)与EDTA反应时比起其他金属离子以相对较慢的速度形成络合物，因此可适用于对试样中铬的选择性分析。
图10示出基于混合有铬(III)和铁(II)的试样中有无EDTA以及有无还原剂的铬(III)的化学发光信号，在图10中，(a)是由仅溶解有500ppb铬(III)的试样测定的化学发光信号，作为其他试样的化学发光强度的基准，将(a)的化学发光强度设定为100％。
在图10中，(b)是对溶解有500ppb铬(III)和5ppm铁(II)的试样使用未加入EDTA的鲁米诺、过氧化氢进行分析的化学发光强度，显示出117％的化学发光强度。化学发光强度增加17％是因扰物质即5ppm铁(II)而产生的。
在图10中，(c)是注入与(b)相同的试样并注入溶解有鲁米诺、过氧化氢的缓冲溶液中分别溶解10mM的EDTA而成的试剂进行测定的化学发光信号，显示出与(a)相同的100％的化学发光强度。从所述结果可知，使用10mM的EDTA就可以在没有5ppm铁(II)造成的干扰效果的情况下对铬(III)进行选择性检测。
在图10中，(d)是在与(c)相同的条件下由两个试样注入口中的一个注入口注入还原剂而得到的化学发光信号，显示出相当于50％的化学发光强度。50％的化学发光强度是因为还原剂的注入导致试样的浓度被稀释为1/2。从所述结果可知，使用10mM的EDTA时，即使注入pH值为2.5的还原剂也不会对化学发光信号产生影响。
从图10的结果可知，即使在酸化导致干扰金属离子的浓度变高时，不用进行分离过程使用EDTA也可以对铬(III)和铬(IV)进行选择性检测。
[实验例8]
本实验例8是为了确认分析铬(III)时注入蒸馏水是否产生沉淀物而进行的，将溶解有500ppb铬(III)和5ppm铁(II)的溶液pH值调成4.5准备好试样，由试样注入口11和还原剂注入口12注入该试样，确认此时的化学发光信号，以及由试样注入口11注入溶解有500ppb铬(III)和铁(II)的溶液且由还原剂注入口12注入蒸馏水，确认此时的化学发光信号。
现有技术在检测试样中的铬(III)时由两个注入口中的一个注入口注入了蒸馏水(pH5.8～6.2)。对于所述的情形，由于在还原通道20试样和蒸馏水被混合的过程中试样的pH值改变，可能会导致铬(III)的沉淀。
图11示出混合有铬(III)和铁(II)的试样中注入蒸馏水而得到铬(III)的化学发光信号。在图11中，(a)是将500ppb铬(III)由试样注入口11和还原剂注入口12注入而得到的化学发光信号，将其化学发光强度设定为100％。在图11中，(b)是将溶解有pH4.5的500ppb铬(III)和5ppm铁(II)的试样由试样注入口11和还原剂注入口12分别注入而得到的化学发光信号，图11中显示化学发光强度比(a)高17％。在图11中，只有(d)是通过试剂中添加EDTA而得到的化学发光信号。因此，图11的(b)中化学发光强度增加17％是因5ppm铁(II)造成的干扰效果而产生的。
在图11中，(c)是由试样注入口注入溶解有500ppb铬(III)和5ppm铁(II)的试样且由还原剂注入口注入蒸馏水而得到的化学发光信号。如果试样没有因蒸馏水的注入而受到任何影响，则由于试样的浓度被稀释为1/2，应当显示58.5％的化学发光强度。然而，在图11中，(c)显示出17.3％的化学发光强度。这表明在还原通道中pH4.5的试样与蒸馏水混合后pH值变高，进而产生铬(III)的沉淀现象或铁和铬的共沉淀现象，导致化学发光强度减少41.2％。在图11中，(d)是通过与(c)相同的方法注入试样和蒸馏水并注入溶解有EDTA的试剂而得到的化学发光信号，表示试样中以溶解状态残留的铁(II)被EDTA除去，造成5.4％的化学发光强度减少。从所述结果可知，通过化学发光法检测铬(III)时，如果注入蒸馏水就会发生分析误差，这种情况下即使注入EDTA也无法消除其他金属离子造成的干扰效果。
[实验例9]
在本实验例9中，使用未添加EDTA的试剂和添加10mM的EDTA的试剂，对参与鲁米诺化学发光反应的铁(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及混合有铬的pH4.5的试样进行了化学发光检测。
对于溶解有500ppb的铬(III)以及所述干扰金属离子分别溶解有500ppb或5ppm的试样，利用硝酸将pH值调成4.5。此时，用于调整pH值的硝酸溶液的体积为试样体积的1/1000以下，可以忽略试样中铬和干扰金属的浓度变化。而且，对于溶解有500ppb的总铬(包含250ppb的铬(III)和250ppb的铬(IV))以及干扰金属离子分别溶解有500ppb或5ppm的试样，利用硝酸将pH值调成4.5。
化学发光试剂是通过添加10mM的EDTA的缓冲溶液和未添加EDTA的缓冲溶液中分别加入鲁米诺和过氧化氢来制备的。
[表1]
[表1]示出各试样的化学发光强度，是对于溶解有500ppb的铬(III)和干扰金属离子的试样，将500ppb铬(III)试样的化学发光强度设定为100％，对于溶解有500ppb总铬和干扰金属离子的试样，将500ppb的总铬试样的化学发光强度设定为100％，并注入未添加EDTA的化学发光试剂和添加10mM的EDTA的化学发光试剂时，对于各试样的化学发光强度。化学发光强度右侧括号内的值是针对各试样三次测定化学发光强度而得到的相对标准偏差。
当注入未添加EDTA的试剂时，由于试样中存在的干扰金属离子测到的化学发光强度超过100％。然而，使用添加10mM的EDTA的化学发光试剂时，在检测通道中干扰金属离子被EDTA除去，因而化学发光强度与500ppb的铬(III)、500ppb的总铬标准试样相同，对于干扰金属离子的浓度为铬浓度的10倍(5ppm)的试样，也可以在没有干扰效果的情况下对500ppb的铬(III)和总铬进行选择性分析。
[实验例10]
本实验例10是为了确认本实施例的检测装置的性能而进行的，分析了在工厂收集的试样中总铬和铬(III)、铬(IV)的浓度。将经具有0.45μmpore的过滤器过滤的试样注入微流控芯片，并测定了铬浓度。
表2是将试样中总铬和铬(III)、铬(IV)浓度的分析结果与通过原子吸光光度法和吸光法分析的结果进行对比的表格，原子吸光光度法只能分析总铬浓度，检测极限为20ppb。而且，吸光法采用紫外线可见光分光光度计测定由铬(IV)与1，5-二苯基卡巴肼(1，5-diphenylcarbazide)的反应生成的红色络合物在540nm波长下的吸收度并进行了分析，由于没有其他物质造成的干扰效果，在铬(IV)分析中是选择性高的分析方法。
对根据本实验例10的试样中的铬，使用本实施例的微流控芯片通过化学发光法进行分析的结果，试样1、试样2、试样3中包含的总铬的浓度分别为137ppb、112ppb、128ppb，类似于通过原子吸光光度法分析的结果，对各试样分析三次的结果得到比原子吸光光度法更低的相对标准偏差。
[表2]
对于通过化学发光法分析的铬(III)的浓度，试样1、试样2、试样3分别为27ppb、20ppb、28ppb，类似于从通过原子吸光光度法分析的总铬浓度减去通过吸光法分析的铬(IV)浓度而算得的铬(III)浓度。对于铬(IV)的浓度，利用总铬和铬(III)浓度的计算值与通过吸光法分析的铬(IV)浓度类似。如上所述，利用本实施例的测铬装置分析，可以准确地测定总铬和铬(III)、铬(IV)的浓度。
上面说明了本发明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述内容，在权利要求书和说明书及其附图范围内可以各种变形方式实施，毋庸置疑这些均属于本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种微流控芯片，包括：
第一基板，形成有用于混合试样和试剂的还原通道、用于混合试剂的试剂混合通道、及一侧端部与所述还原通道和所述试剂混合通道并联连接而另一侧端部与排出口连接的检测通道；以及
第二基板，具有面向所述检测通道且使光线透过的检测部，所述第二基板与所述第一基板结合。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，
所述还原通道更长于所述试剂混合通道。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其中，
所述第一基板和第二基板由具有可吸光的颜色的材料形成，或者被染成可吸光的颜色。
4.根据权利要求2所述的微流控芯片，其中，
所述第一基板上形成有用于注入试样的试样注入口和用于注入还原剂的还原剂注入口，所述试样注入口以试样通道为中介体与还原通道连接，所述还原剂注入口以还原剂通道为中介体与还原通道连接。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其中，
所述第一基板上形成有用于注入第一试剂的第一试剂注入口和用于注入第二试剂的第二试剂注入口，所述第一试剂注入口通过第一试剂通道与试剂混合通道连接，所述第二试剂注入口通过第二试剂通道与试剂混合通道连接。
6.根据权利要求2所述的微流控芯片，其中，
所述检测通道重叠配置且一侧端部和另一侧端部交互连接，所述检测通道从中央越向两边侧端越减小。
7.根据权利要求2所述的微流控芯片，其中，
所述还原通道和所述试剂混合通道重叠配置且一侧端部和另一侧端部交互连接。
8.一种测铬装置，包括：
微流控芯片，包括第一基板及第二基板，其中第一基板形成有用于混合试样和试剂的还原通道、用于混合试剂的试剂混合通道、及一侧端部与所述还原通道和所述试剂混合通道并联连接而另一侧端部与排出口连接的检测通道，而第二基板具有面向所述检测通道且使光线透过的检测部，所述第二基板与所述第一基板结合；
检测器，配置成面向所述检测部；以及
供应部，用于向所述微流控芯片供应试样及试剂。
9.根据权利要求8所述的测铬装置，其中，
所述还原通道更长于所述试剂混合通道。
10.根据权利要求9所述的测铬装置，其中，
所述第一基板和第二基板由具有可吸光的颜色的材料形成，或者被染成可吸光的颜色。
11.根据权利要求9所述的测铬装置，其中，
所述第一基板上形成有用于注入试样的试样注入口、用于注入还原剂的还原剂注入口、用于注入第一试剂的第一试剂注入口、及用于注入第二试剂的第二试剂注入口。
12.根据权利要求11所述的测铬装置，其中，
所述供应部向所述试样注入口供应试样，向所述还原剂注入口供应亚硫酸钾，向所述第一试剂注入口供应溶解于碱性条件的缓冲溶液的鲁米诺，向所述第二试剂注入口供应溶解于碱性条件的缓冲溶液的过氧化氢。
13.根据权利要求12所述的测铬装置，其中，
所述供应部将溴离子与所述第一试剂及所述第二试剂一起供应至所述微流控芯片。
14.根据权利要求12所述的测铬装置，其中，
所述供应部将乙二胺四乙酸与所述第一试剂及所述第二试剂一起供应至所述微流控芯片。
15.根据权利要求9所述的测铬装置，其中，
所述检测通道重叠配置且一侧端部和另一侧端部交互连接，所述检测通道从中央越向两边侧端越减小。
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