CN105092838A - 丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒、制备及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒、制备及使用方法。主要解决在临床感染病例和环境、食物源、禽畜动物源等标本中快速筛选甄别丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌技术难题。本发明的技术方案为：丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒，包括：1、沙门菌C群免疫兔抗血清；2、沙门菌H相免疫兔抗血清；3、沙门菌H相Vi免疫兔抗血清；4-6、卫矛醇、***糖、覃糖发酵管；7、粘液酸生化鉴别管；8、酒石酸钾生化鉴别管；9、灭菌矿物油；10、H相专用诱导软琼脂；11、诱导血清H:c和H:5因子。本发明主要用于在常规工作中筛选和鉴别丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌。

Description

丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒、制备及使用方法
技术领域
本发明涉及沙门菌属中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的鉴定，特别涉及丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒、制备及使用方法。
背景技术
沙门菌是重要的食源性感染性病原菌，在养殖动物和环境中广泛存在，有近2000多种血清型，其中和人感染有关的亚属Ⅰ的沙门菌多数依靠血清分型诊断，其中有些血清型的抗原式相同。如C群的6,7:c:1,5对应5个不同的血清型：丙型副伤寒、猪霍乱、猪霍乱孔成道夫变种、猪霍乱得揆忒变种、猪伤寒，尤以丙型副伤寒沙门菌6,7:c(Vi):1,5和猪霍乱具有非常重要的临床和动物兽医学诊断意义。但两者有完全相同O和H相抗原，因此很难凭借血清学方法鉴别。《中华人民共和国传染病防治法》对两者引发疾病的生物危害分级和公共卫生学意义不同：丙型副伤寒沙门菌属乙类病原菌，能导致伤寒样病例，有重要的临床和公共卫生意义；猪霍乱沙门菌属丙类传染病，其仅见于动物性（小猪）疫病和人类菌血症和深部感染病例，未见在人类的食源性暴发的病例报道，因此其公共卫生学意义相对较小。长期以来，临床实验室、公共卫生和动物兽医实验室由于两者在抗原上的相似性而无法鉴别和准确报告鉴定结果，或者因为抗原的诱导试验而延误正确的报告时间，直接影响国家传染病报告***对丙型副伤寒的精准病例统计和动物性传染病的诊断与流行评估。国外许多专业实验室通常使用荧光PCR（RT-PCR）方法检测oriC基因以区分丙型副伤寒和猪霍乱，但该技术需依赖分子诊断实验室的仪器配置和可靠的参比菌株作为对照，这对大多数国内基层实验室来说存在应用普及障碍。有鉴于此，我们设计了一种简易生化试验组成的试剂盒以满足临床、公共卫生和动物兽医学实验室在常规工作中主要筛选和鉴别丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌的技术需要，省时、省力，易于操作，综合费用低廉，具有很好的社会和经济效益。
发明内容
本发明的目的是公开一种主要针对丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌鉴别诊断试剂盒、制备及使用方法。主要解决在临床感染病例和环境、食物源、禽畜动物源等标本中快速筛选甄别丙型副伤寒和猪霍乱沙门菌技术难题。本发明利用血清诊断结合不同生化反应的组合初筛达到快速、简单的区分5种具有相同C群沙门菌抗原的分型效果。
本发明的技术方案为：丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒，包括：
1、沙门菌C群免疫兔抗血清:组成成分：O:6、O:7；
2、沙门菌H相免疫兔抗血清，组成成分：H:c、H:5；
3、沙门菌H相Vi免疫兔抗血清，组成成分：H:Vi；
4-6、卫矛醇、***糖、覃糖发酵管，成分：蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，1.6%（v/v）溴甲酚紫酒精溶液0.1ml，卫矛醇、***糖或覃糖0.5g，蒸馏水100.0ml；
7、粘液酸生化鉴别管，成分：成分：蛋白胨1.0g，0.2%（v/v）溴麝香草酚蓝溶液1.2ml，粘液酸1.0g，蒸馏水100.0ml；
8、酒石酸钾生化鉴别管，成分：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml；
9、灭菌矿物油，成分：矿物油10ml；
10、H相专用诱导软琼脂，成分：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml；
11、诱导血清H:c和H:5因子：取经过交叉凝集素吸收后的H:c和H:5因子血清分装0.5ml/瓶。
本发明的有益效果是：标准化配方试剂盒可满足临床、公共卫生、环境食品、畜牧动物、兽医实验室在常规工作中针对丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱进行甄别与筛选的技术需要，省时、省力，易于操作，综合费用低廉，具有很好的社会和经济效益。
具体实施方式
丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒，包括：
1、沙门菌C群免疫兔抗血清:组成成分：O:6、O:7。制法：将O:6免疫抗原菌株（纽波特沙门菌）和O:7免疫抗原菌株（汤卜逊沙门菌）接种普通营养琼脂培养基，经36±1℃培养20h后收集菌苔，用生理盐水制成适宜浓度的菌液，置100℃水浴中煮沸2.5h，破坏鞭毛抗原后制成无鞭毛菌体抗原，按照第1d（50亿菌量）腹腔皮下注射、第3d（100亿菌量）耳静脉注射、第10d（200亿菌量）耳静脉注射、第17d（400亿菌量）耳静脉注射、第24d（800亿菌量）耳静脉注射菌液浓度与时间间隔程序免疫家兔、第25d对家兔行心脏无菌采血或者颈动脉无菌采血术采集兔血，置4℃待血块凝固收缩后分离血清。粗制的抗O血清需要吸收其他非特异性的抗原。血清吸收除去交叉凝集素：取粗制血清以生理盐水作10倍稀释与对应的菌株（按中国生物制品规程标准要求）做玻片凝集试验，如出现其他类属凝集素的交叉反应，必须在血清种加入交叉反应相关的吸收菌（吸收）除去这些交叉凝集素。方法：取粗制抗血清，先用5倍的生理盐水稀释，然后加入适量已洗涤过的吸收菌（吸收菌抗原制法同前：O:6的吸收菌为肯塔基沙门菌、O:7的吸收菌纽波特沙门菌），置36±1℃保温3h（每隔15min摇匀1次），取出置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清，将血清稀释10倍，并用交叉凝集菌株作玻片凝集试验检定。一次吸收不尽时，可以多次吸收，直至不出现交叉凝集。一般需要吸收多次才能制成。试剂盒配置血清分装2ml/瓶，工作稀释度为1:10。
2、沙门菌H相免疫兔抗血清，组成成分：H:c、H:5。制法：将H:c免疫抗原菌株（猪霍乱沙门菌粗糙型）和H:5免疫抗原菌株（汤卜逊沙门菌）复苏，单相或者双相抗原性提供玻片凝集测试达到一定的凝集效价后再接种质量百分含量0.8%软琼脂培养基，36±1℃培养20h后收集菌体，用生理盐水制成适宜浓度的菌液，加入质量百分浓度为0.5%甲醛溶液灭活制成免疫用抗原，按照第1d（50亿）腹腔皮下注射、第3d（100亿）耳静脉注射、第10d（200亿）耳静脉注射、第17d（400亿）耳静脉注射、第24d（800亿）耳静脉注射菌液浓度和时间间隔免疫家兔、第25d对家兔行心脏无菌采血或者颈动脉无菌采血术采集兔血，置4℃待血块凝固收缩后分离血清。粗制的抗H因子血清需要吸收其他非特异性的抗原。血清吸收除去交叉凝集素：取粗制血清以生理盐水作10倍稀释与对应的菌株（按中国生物制品规程标准要求）做玻片凝集试验，如出现其他类属凝集素的交叉反应，必须在血清种加入交叉反应相关的吸收菌（吸收）除去这些交叉凝集素。方法：取粗制抗血清，先用5倍的生理盐水稀释，然后加入适量已洗涤过的吸收菌（吸收菌抗原制法同前：H:c的吸收菌为猪霍乱沙门菌粗糙型、H:5的吸收菌为鼠伤寒沙门菌单相变种），置36±1℃保温3h（每隔15min摇匀1次），取出置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清，将血清稀释10倍，并用交叉凝集菌株作玻片凝集试验检定。一次吸收不尽时，可以多次吸收，直至不出现交叉凝集。一般需要吸收多次才能制成。试剂盒配置血清分装2ml/瓶，工作稀释度为1:10。
3、沙门菌H相Vi免疫兔抗血清，组成成分：H:Vi。制法：将H:Vi免疫抗原菌株（伤寒沙门菌6S株）复苏，单相或者双相抗原性提供玻片凝集测试达到一定的凝集效价后再接种质量百分含量0.8%软琼脂培养基，36±1℃培养20h后收集菌体，用生理盐水制成适宜浓度的菌液，加入质量百分浓度为0.5%甲醛溶液灭活制成免疫用抗原，按照第1d（50亿）腹腔皮下注射、第3d（100亿）耳静脉注射、第10d（200亿）耳静脉注射、第17d（400亿）耳静脉注射、第24d（800亿）耳静脉注射菌液浓度和时间间隔免疫家兔、第25d对家兔行心脏无菌采血或者颈动脉无菌采血术采集兔血，置4℃待血块凝固收缩后分离血清。免疫的Vi不需要吸收其他非特异性的抗原。试剂盒配置血清分装2ml/瓶，工作稀释度为1:10。
4、卫矛醇发酵管，成分：蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，1.6%（v/v）溴甲酚紫酒精溶液0.1ml，卫矛醇0.5g，蒸馏水100.0ml。制法：将蛋白胨、氯化钠加温溶于水中，调pH至7.6，加入溴甲酚紫溶液后过滤，继续加入卫矛醇，等完全溶解后分装试管，每管2.0ml，于115℃15min灭菌后备用。
5、***糖发酵管，***糖替代卫矛醇，其余同4。
6、覃糖发酵管，覃糖替代卫矛醇，其余同4。
7、粘液酸生化鉴别管，成分：成分：蛋白胨1.0g，0.2%（v/v）溴麝香草酚蓝溶液1.2ml，粘液酸1.0g，蒸馏水100.0ml。制法：除粘液酸外将上述成分混合，于121℃15min灭菌。取出趁热加入粘液酸，缓缓加入NaOH调pH至7.4，分装试管，每管3.0ml，最后需无菌试验验证。
8、酒石酸钾生化鉴别管，成分：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml。制法：将上述成分（除酚红外）混合，加热溶化，调整pH为7.8，加入酚红过滤后分装试管，每管约10.0ml，于115℃20min灭菌，直立凝固后备用。
9、灭菌矿物油，成分：矿物油10ml分装后置100℃烘烤2h。使用方法：用接种环或者接种针挑取纯培养物穿刺酒石酸钾试验管至深层，沿试管壁缓慢加入灭菌石蜡油约1ml后置36±1℃培养24-48h观察结果。阳性者呈黄色，阴性者颜色不变。
10、H相专用诱导软琼脂，成分：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml。制法：将上述成分混合，加热溶化，调整pH为7.4，分装5ml/支，于110℃15min灭菌备用。
11、诱导血清H:c和H:5因子：取经过交叉凝集素吸收后的H:c和H:5因子血清分装0.5ml/瓶。
使用方法
卫矛醇、***糖、覃糖发酵管使用方法：取纯培养物接种于糖发酵管，置36℃±1℃培养24h-48h，培养基由紫变色为黄者为阳性反应，不变色者为阴性反应，阴性最多可以延长至7天后判断结果。
粘液酸生化鉴别管使用方法：取新鲜培养物接种后置36℃±1℃培养24h观察结果，培养基由蓝绿色变色为黄色为阳性反应，不变色者为阴性反应。
酒石酸钾生化鉴别管使用方法：用接种环或者接种针挑取纯培养物穿刺酒石酸钾试验管至深层，沿试管壁缓慢加入灭菌石蜡油1ml后置36±1℃培养24-48h观察结果，阳性者呈黄色，阴性者颜色不变。
待检菌株经过生化、质谱等简单或者***的鉴定确认为沙门菌者（确认硫化氢阳性或者阴性），其新鲜培养物分别与O:6、O:7和H:c、H:5进行玻片凝集，若见O和H相均有明显、粗颗粒的凝集反应，其6,7:c:1,5抗原式成立时，应立即取5种生化鉴别管进行接种或穿刺后置36±1℃培养24-48h后取出观察结果；若H相仅有1相凝集较好，另1相阴性者，需取1支H相诱导软琼脂加热溶解后倾倒于直径5cm的无菌平面中，待冷却至50℃左右加入1滴H相凝集的血清作为诱导血清，轻微混匀后于4℃放置20min取出，以3点或者5点法将待检菌接种于诱导琼脂平板表面，置36±1℃中16-24h培养，经单相诱导的培养物若呈蔓延生长则取边缘培养物与预期血清进行玻片凝集，若确认6,7:c:1,5抗原式，应立即取5种生化鉴别管进行接种或穿刺后置36±1℃培养24-48h后取出观察结果；若单相凝集至第3代仍无法确认6,7:c:1,5抗原式者不适用生化鉴定方式。生化结果符合表1者可以报告相对应的沙门菌血清型。
结果判断：
当血清型符合6,7:c:1,5，且Vi玻片凝集者，硫化氢阳性、酒石酸钾阴性者可以判断为丙型副伤寒沙门菌；
当血清型符合6,7:c:1,5，Vi玻片不凝集者，且硫化氢阴性、酒石酸钾阳性者可以判断为猪霍乱沙门菌；
当血清型符合6,7:c:1,5，Vi玻片不凝集者，若硫化氢和酒石酸钾均为阳性，则卫矛醇、粘液酸、***糖、覃糖同时阴性者判断为猪霍乱孔成道夫变种沙门菌、反之若糖发酵全部阳性的判断为猪霍乱得揆忒变种沙门菌、糖发酵有阴有阳者判断为猪伤寒沙门菌。生化鉴别结果见表1。
表1C群5种相同抗原式沙门菌的生化鉴别
6,7:c:1,5 硫化氢 卫矛醇 粘液酸 ***糖 覃糖 酒石酸钾
丙型副伤寒(Vi) + + - + +or(+) -
猪霍乱 - - - - - +
猪霍乱孔成道夫变种 + - - - - +
猪霍乱得揆忒变种 + + + + + +
猪伤寒 (+) (+) - (+) + -
注：（+）大多数结果为阳性。

Claims (3)

1.丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒，其特征是：包括
1）、沙门菌C群免疫兔抗血清：含沙门菌O:6、O:7因子抗体的稀释血清；
2）、沙门菌H相免疫兔抗血清：分别含沙门菌H相c和5因子抗体的稀释血清；
3）、沙门菌H相免疫兔抗血清：含沙门菌Vi因子抗体的稀释血清；
4）、卫矛醇发酵管：成分：蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，1.6%体积百分含量溴甲酚紫酒精溶液0.1ml，卫矛醇0.5g，蒸馏水100.0ml；
5）、***糖发酵管：成分：蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，1.6%体积百分含量溴甲酚紫酒精溶液0.1ml，***糖0.5g，蒸馏水100.0ml；
6）、覃糖发酵管：成分：蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，1.6%体积百分含量溴甲酚紫酒精溶液0.1ml，覃糖0.5g，蒸馏水100.0ml；
7）、粘液酸生化鉴别管：成分：成分：蛋白胨1.0g，0.2%体积百分含量溴麝香草酚蓝溶液1.2ml，粘液酸1.0g，蒸馏水100.0ml；
8）、酒石酸钾生化鉴别管：成分：蛋白胨10.0g，酒石酸钾钠10.0g，氯化钠5.0g，酚红0.024g，琼脂15.0g，蒸馏水1000.0ml；
9）、灭菌矿物油，成分：矿物油10ml；
10）、H相专用诱导软琼脂：成分：胰大豆胨蛋白胨10.0g，酪蛋白5.0g，硝酸钾1.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水1000.0ml；
11）、H相c和5因子诱导血清：含有诱导血清H:c、H:5因子。
2.根据权利要求书1所述的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒，其特征是：
1）、卫矛醇、***糖、覃糖发酵管的制法：将蛋白胨、氯化钠加温溶于水中，调pH至7.6，加入溴甲酚紫溶液后过滤，继续加入卫矛醇、***糖或覃糖，等完全溶解后分装试管，每管2.0ml，于115℃15min灭菌后备用；
2）、粘液酸生化鉴别管制法：除粘液酸外将所述成分混合，于121℃15min灭菌，取出趁热加入粘液酸，缓缓加入NaOH调pH至7.4，分装试管，每管3.0ml，最后经无菌试验阴性者备用；
3）、酒石酸钾生化鉴别管制法：除酚红外将所述成分混合，加热溶化，调整pH为7.8，加入酚红过滤后分装试管，每管约10.0ml，于115℃20min灭菌，直立冷却；
4）、H相专用诱导软琼脂制法：将所述成分混合，加热溶化，调整pH为7.4，分装5ml/支，于110℃15min灭菌备用；
5）、H相b因子诱导血清制法：取经过交叉凝集素吸收后的H:b因子，用于制备单相诱导的软琼脂平板。
3.权利要求1所述的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌鉴定试剂盒的使用方法，其特征是：包括以下步骤
1）、卫矛醇、***糖、覃糖发酵管使用方法：取纯培养物接种于糖发酵管，置36℃±1℃培养24h-48h，培养基由紫变色为黄者为阳性反应，不变色者为阴性反应，阴性最多可以延长至7天后判断结果；
2）、粘液酸生化鉴别管使用方法：取新鲜培养物接种后置36℃±1℃培养24h观察结果，培养基由蓝绿色变色为黄色为阳性反应，不变色者为阴性反应；
3）、酒石酸钾生化鉴别管使用方法：用接种环或者接种针挑取纯培养物穿刺酒石酸钾试验管至深层，沿试管壁缓慢加入灭菌石蜡油1ml后置36±1℃培养24-48h观察结果，阳性者呈黄色，阴性者颜色不变；
4）、H相专用诱导软琼脂使用方法：取待检培养物以3点或者5点法接种，置36℃±1℃培养24h，以H相Vi、c、5因子血清进行凝集，若c和5有任意1相不凝集者，继续制备H相诱导软琼脂平板的单相菌诱导平板：即在直径5cm的无菌塑料平皿中加入液化的H相诱导软琼脂，待冷却至50℃以下后加入1滴已经出现玻片凝集的H相抗血清，轻轻混匀后待冷却后于4℃放置20min后，仍以3点或者5点法取前1代的诱导培养物接种于此单相诱导的软琼脂平板中，至3代仍未见第2相者，可以报告为单相菌或者排除为丙型副伤寒或猪霍乱沙门菌；
5）、H相b因子诱导血清使用方法同4；
6）结果判断：
当血清型符合6,7:c:1,5，且Vi玻片凝集者，硫化氢阳性、酒石酸钾阴性者判断为丙型副伤寒沙门菌；
当血清型符合6,7:c:1,5，Vi玻片不凝集者，且硫化氢阴性、酒石酸钾阳性者判断为猪霍乱沙门菌；
当血清型符合6,7:c:1,5，Vi玻片不凝集者，若硫化氢和酒石酸钾均为阳性，则卫矛醇、粘液酸、***糖、覃糖同时阴性者判断为猪霍乱孔成道夫变种沙门菌、反之若糖发酵全部阳性的判断为猪霍乱得揆忒变种沙门菌、糖发酵有阴有阳者判断为猪伤寒沙门菌。
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KR20090079742A (ko) * 2008-01-18 2009-07-22 포항공과대학교 산학협력단 패턴인식형 다중생물분자 검출판
CN103725780A (zh) * 2013-12-18 2014-04-16 广东省微生物研究所 一种检测和鉴定沙门氏菌1,4,[5],12:i:-的方法
CN104105795A (zh) * 2011-12-28 2014-10-15 3M创新有限公司 检测沙门氏菌属微生物的方法

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