CN105087789A - 一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤：血浆cfDNA提取、BCR？H链的全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增、两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增、高通量测序、免疫组库精准信息分析。上述三次PCR扩增的引物分别如SEQ？ID？NO.1-28、SEQ？ID？NO.29-77、SEQ？ID？NO.78-79所示。本发明还提供了含有上述引物的检测血浆cfDNA中BCR和TCR的试剂盒。本发明方法以及试剂盒能够同时检测血浆cfDNA中BCR和TCR，实现精准信息分析和免疫组库各亚克隆的精确定量，在无创检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法
技术领域
本发明属于免疫组库测序技术领域，具体涉及一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法。
背景技术
得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域也已经被应用于T细胞和B细胞受体的免疫组库测序。
常规的T细胞和B细胞受体的免疫组库测序，主要基于2大策略，第一：基于细胞DNA通过TCR/BCR基因重排规律，在TCR(alpha/beta/gamma/delta链)和BCR(heavy/light链)的可变区(variable)基因设置上游引物，在连接区(joining)J基因或恒定区(constant)C基因设置下游引物，通过PCR扩增出目的链的PCR产物，但其往往存在扩增时的不均一性，从而影响结果的准确性；第二：基于细胞RNA，采用5’RACE技术，基于引入的接头序列进行第二次无偏好(bias)的PCR扩增。但是RNA样品处理复杂，重复性不如DNA检测结果，并不是一种理想的原材料。
血浆中循环游离DNA(cfDNA)，其来源主要是由细胞凋亡释放到血中。近年来肿瘤患者血液中游离ctDNA(Cell-freeCirculatingTumorDNA)的基因检测诊断已成为研究热点，而且相关基于血浆ctDNA的IG-seq检测正快速的发展中，其以血浆cfDNA/ctDNA作为第一原料，针对特异性免疫亚克隆扩增，以用于相关疾病的风险评估与预测，拓展了cfDNA这一“液体活检”标志物应用的广阔前景。但个别特异性克隆的分析研究，存在着局限性，其并不能完整全面的展现患者的疾病进展情况。同时针对DNA扩增不均一性调整的优化，目前分子标签编码技术的引入，不仅可以区分测序和扩增错误与参照序列中的罕见突变，而且可以进行精准的分子定量，从而最大化的实现了无偏好性的数据分析。
发明内容
本发明提供一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法以克服现有技术的不足。
本发明提供的检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤：
(1)血浆cfDNA提取；
(2)BCRH链全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增；
(3)步骤(2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增；
(4)高通量测序；
(5)免疫组库精准信息分析。
本发明方法的流程图见图1。
本发明方法中，步骤(2)中BCRH链全长多重PCR扩增采用的上游引物共22条，序列分别如SEQIDNO.1-22所示，下游引物共6条，序列分别如SEQIDNO.23-28所示；
TCRβ链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQIDNO.29-73所示，下游引物共4条，序列分别如SEQIDNO.74-77所示。
进一步地，步骤(2)中，各条上游引物的浓度相同，各条下游引物的浓度相同，且下游单个引物浓度为上游单个引物浓度的20倍。
优选地，步骤(2)中BCRH链全长多重PCR扩增条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
优选地，步骤(2)中TCRβ链CDR3多重PCR扩增条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
本发明方法的步骤(3)所述的两种扩增产物分别是指BCRH链全长多重PCR扩增产物中片段大小在300-350bp的片段回收纯化后的产物、以及TCRβ链CDR3多重PCR扩增产物中片段大小在200-250bp的片段回收纯化后的产物。
优选地，步骤(3)中将步骤(2)的两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增；所采用的引物序列如SEQIDNO.78-79所示。
步骤(3)中PCR反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
本发明的检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法中，步骤(5)的免疫组库精准信息分析包括以下步骤：
1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据***序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
3)对于每个DNA模板的dup簇(每个DNA模板扩增形成的系列重复片段)中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提高检测的准确性；
4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
5)根据4)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；
6)根据5)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。
上述步骤2)所述的汉明距离值不超过3是本发明信息分析的一个关键点，为了尽可能多的区分不同的亚克隆，需要尽量压缩汉明距离的容忍度，以得到更加全面的BCR和TCR的亚克隆类型。
另一方面，本发明提供了一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的***，包括以下操作单元：
(1)血浆cfDNA提取单元；
(2)BCRH链全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增单元；
(3)步骤(2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增单元；
(4)高通量测序单元；
(5)免疫组库精准信息分析单元。
所述单元(2)中BCRH链全长多重PCR扩增采用的上游引物共22条，序列分别如SEQIDNO.1-22所示，下游引物共6条，序列分别如SEQIDNO.23-28所示；
TCRβ链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQIDNO.29-73所示，下游引物共4条，序列分别如SEQIDNO.74-77所示。
单元(3)中是将单元(2)的两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增；所采用的引物序列如SEQIDNO.78-79所示。
单元(5)的免疫组库精准信息分析包括以下步骤：
1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据***序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提高检测的准确性；
4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
5)根据4)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；
6)根据5)的结果进行其他相关分析。
本发明提供了上述检测***在检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库中的应用。
本发明提供了上述方法以及上述检测***在制备疾病筛查试剂盒中的应用。
进一步地，所述的疾病为肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病。
本发明提供了上述方法以及上述检测***在制备评价免疫***功能例如干细胞和/或器官移植的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的引物组合，含有3组引物，第一组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO.1-28所示；第二组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO.29-77所示；第三组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO.78-79所示。
上述第一组、第二组引物在本发明的实施例中统称为PCR1引物体系，第三组引物称为PCR2引物体系，PCR1引物体系是基于BCR和TCR分别进行设计，目的是将全长的BCRH链以及TCRBeta链CDR3区全部扩增出。BCR的免疫多态性基于V(D)J区片段的重组排列；TCRCDR3区刚好覆盖TRBV-Junction-TRBD-Junction-TRBJ区域，由于变异最大，从而直接决定了TCR的抗原特异性。
PCR2引物体系为BCR/TCR第二轮PCR时的通用引物，其基于PCR1产物为模板，通过引物引入测序标签以及测序序列，完成文库的构建。
针对BCR和TCR的PCR1的引物结构：从5’端到3’端均依次包含接头序列、特异性的标签序列和BCR/TCR扩增的上下游引物。
BCR扩增的上下游引物设计：根据对BCRV基因7大类家族ORF(分别为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4)的同源性分析，以V基因的leader区设计的上游引物(总共22条，如SEQIDNO.1-22所示)和根据BCRmIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD的C区基因序列的特征分别设计的至少一种下游引物(总共6条，如SEQIDNO.23-28所示)。详情见表1。
TCR扩增上下游引物设计：人TCRβ链V基因家族包含45个功能性基因家族和7个ORF，根据52个基因的同源性总共设计45条上游引物(如SEQIDNO.29-73所示)；而人TCRβ链的C基因高度同源，因此设计4条不同的通用下游引物(如SEQIDNO.74-77所示)，随机与46条上游引物配对，以避免由于血浆片段随机断裂原因导致扩增失败，提高片段扩增的成功率。详情见表2。
PCR1上下游引物均具有的特点为：(1)接头序列以现有成熟的Illumina平台为参考设计，上游引物为34bp，下游引物为33bp；(2)特异性的标签序列：根据数据经验分析显示设置为7个随机碱基组成的序列，将更有利于获得较高的数据利用率。其产生的47种标签组合，完全满足对每个DNA模板分子的标记。(3)基于血浆片段平均170bp的特点，为更有效实现对血浆片段的扩增，上下游引物长度尽量控制在16bp左右。
BCR和TCR-PCR2的引物结构：PCR2引物体系中，上下游引物的基础引物序列分别与PCR1引物体系的产物两端的接头序列互补，同时其上游引物只包含测序序列，而下游引物则包含测序序列以及测序标签——8个已知固定碱基(index)，用于进行混合测序样品间的区分。详情见表3。
本发明提供了上述引物组合在制备疾病筛查试剂盒或诊断试剂中的应用。
本发明提供了一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的试剂盒，其含有本发明所述的引物组合。
本发明提供的检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库方法具有全面、高效、精准、便捷的特点，相对于现有技术，本发明引入标签编码技术并进行优化，基于7个随机碱基构成的唯一标签，同时设定每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，满足对每个模板进行了标记，实现更高的数据利用效率，不仅可以矫正测序和PCR中引入的错误，而且根据对每个模板的唯一标记，可以最大化的实现无偏好性的数据分析，实现免疫组库各亚克隆的精准定量。本发明方法通过检测血浆中不同亚克隆细胞凋亡释放到血中DNA片段的BCR和TCR的基因序列，分析其多态性，为免疫***疾病的早期筛查与愈后指导用药提供技术支持。另一方面，本发明设计的引物几乎囊括了针对所有BCRH链VDJ的免疫多态性以及TCRBeta链CDR3区的免疫多态性的序列，从而可以更全面准确的进行免疫状态的评估，可用于制备检测恶性肿瘤、自身免疫***疾病的试剂盒，也可用于干细胞移植和器官移植领域对机体的免疫功能进行全面评价，在无创检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程图。
图2为采用本发明检测方法对肺腺癌患者血浆cfDNA的TCR免疫多态性检测结果。
图3为采用本发明检测方法对肺腺癌患者血浆cfDNA的BCR聚类分析检测结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中采用的测序装置为IlluminaHiSeq2500，本发明测序步骤中，不限于该测序装置。
实施例1检测血浆cfDNA中BCR和TCR的引物的设计
BCR的免疫多态性基于V(D)J区片段的重组排列。TCRCDR3区刚好覆盖TRBV-Junction-TRBD-Junction-TRBJ区域，由于变异最大，从而直接决定了TCR的抗原特异性。针对BCR和TCR基因序列分别进行引物设计，目的是将全长的BCRH链以及TCRBeta链CDR3区全部扩增出。
BCR/TCR-PCR1的引物结构：从5’端到3’端均依次包含接头序列、特异性的标签序列和BCR/TCR扩增的上下游引物。
BCR扩增的上下游引物设计：根据对BCRV基因7大类家族ORF(分别为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4)的同源性分析，以V基因的leader区设计的上游引物(总共22条，见表1的B-PCR1上游引物，或如SEQIDNO.1-22所示)和根据BCRmIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mIgD的C区基因序列的特征分别设计的至少一种下游引物(总共6条，见表1的B-PCR1下游引物，或如SEQIDNO.23-28所示)。
TCR扩增上下游引物设计：人TCRβ链V基因家族包含45个功能性基因家族和7个ORF，根据52个基因的同源性总共设计45条上游引物(见表2的T-PCR1上游引物，或如SEQIDNO.29-73所示)；而人TCRβ链的C基因高度同源，因此设计4条不同的通用下游引物(见表2的T-PCR1下游引物，或如SEQIDNO.74-77所示)，随机与46条上游引物配对，以避免由于血浆片段随机断裂原因导致扩增失败，提高片段扩增的成功率。
表1BCR-PCR1引物体系
表2TCR-PCR1引物体系
BCR/TCR-PCR2的引物结构：PCR2上下游引物的基础引物序列分别与PCR1的产物两端的接头序列互补，同时其上游引物只包含测序序列，而下游引物则包含测序序列以及测序标签——8个已知固定碱基(index)，以用于进行混合测序样品间的区分。详情见表3。
表3BCR/TCR-PCR2引物体系
引物名称 引物序列(5’→3’)
PCR2上游引物 aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct
PCR2下游引物 caagcagaagacggcatacgagatxxxxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct
实施例2检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库方法的建立
1、血浆cfDNA提取：
1.1提取血浆抽取受检者外周血2管(5mL/管)于EDTA抗凝管中，轻柔上下颠倒(防止细胞破裂)，6-8次充分混匀，在采血当天4-6小时内进行以下处理；在4℃条件下1600g离心10分钟，离心后将上清(血浆)分装到多个1.5mL/2mL离心管中，在吸取过程中不能吸到中间层白细胞；在4℃条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，将上清(血浆)转移到新的1.5mL/2mL离心管中，不能吸到管底白细胞，即得到分离后所需血浆。
1.2血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到-80℃冰箱中，避免反复冻融。
1.3血浆cfDNA/ctDNA的提取与定量：取分离出的血浆约2-3ml，按照QIAampCirculatingNucleicAcidKit(Qiagen)提取试剂说明书，进行血浆cfDNA的提取。Qubit(Invitrogen，theQuant-iTTMdsDNAHSAssayKit)定量所提取的DNA，总量约为30～50ng。
2、分别进行BCR/TCR多重PCR1扩增
2.1分别将实施例1中的表1和表2中的上下游引物进行混合，形成BCR和TCR上下游引物MIX，且下游单个引物浓度为上游单个引物浓度的20倍。
2.2BCRH链全长多重PCR1反应扩增，基于QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒进行操作：
上述PCR反应体系中，B-PCR1上游引物序列分别如SEQIDNO.1-22所示，B-PCR1下游引物序列分别如SEQIDNO.23-28所示，其中B-PCR1上、下游引物Mix中各条引物为等体积等浓度混合。
BCRH链全长多重PCR扩增条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
2.3TCRβ链CDR3区多重PCR1反应扩增，基于QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒进行操作：
上述PCR反应体系中，TCRCDR3PCR1上游引物序列分别如SEQIDNO.29-74所示，TCRCDR3PCR1下游引物序列分别如SEQIDNO.75-78所示，其中上、下游引物Mix中各条引物为等体积等浓度混合。
TCRβ链CDR3多重PCR扩增条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
2.4使用TBE-PAGE胶电泳上述扩增获得的PCR产物，分别获取片段大小在300bp或190bp左右的片段，按照QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)试剂说明书进行产量回收，获取BCR/TCRPCR1的扩增产物，之后采用Qubit(Invitrogen，theQuant-iTdsDNABRAssayKit)进行定量。
3、扩增产物等比例混合进行PCR2扩增：针对同一样品，等比例各取50ngBCR和TCR的PCR1纯化产物，进行PCR2扩增，反应体系如下：
PCR反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
PCR2上、下游引物序列分别如SEQIDNO.79、80所示。
4、上机测序：采用IlluminaHiSeq2500PE101+8+101程序进行上机测序，测序实验按照制造商提供的操作说明书(参见Illumina/Solexa官方公布cBot)进行上机测序操作。
5、免疫组库精准信息分析：
1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据***序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提高检测的准确性；
4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
5)根据4)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；
6)根据5)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。
9.测序结果分析
通过1例肺腺癌术后患者的血浆样品，基于以上方法步骤进行检测：
9.1患者TCR免疫多态性：见图2。结果说明，患者T淋巴细胞各V、J基因亚型分布较均一，最高克隆占比0.60％——T淋巴细胞组库多样性良好。
9.2患者BCR聚类分析结果(Lineage分析)：见图3。结果说明，Lineage基本呈散在分布,预示B细胞组库多样性良好。
综合性分析显示：患者术后总体免疫状态良好。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (20)

1.一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤：
(1)血浆cfDNA提取；
(2)BCRH链全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增；
(3)步骤(2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增；
(4)高通量测序；
(5)免疫组库精准信息分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中BCRH链全长多重PCR扩增采用的上游引物共22条，序列分别如SEQIDNO.1-22所示，下游引物共6条，序列分别如SEQIDNO.23-28所示；
TCRβ链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQIDNO.29-73所示，下游引物共4条，序列分别如SEQIDNO.74-77所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，各条上游引物的浓度相同，各条下游引物的浓度相同，且下游单个引物浓度为上游单个引物浓度的20倍。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中BCRH链全长多重PCR扩增条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中TCRβ链CDR3多重PCR扩增条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共8个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的两种扩增产物分别是指BCRH链全长多重PCR扩增产物中片段大小在300-350bp的片段回收纯化后的产物、以及TCRβ链CDR3多重PCR扩增产物中片段大小在200-250bp的片段回收纯化后的产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将步骤(2)的两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增；所采用的引物序列如SEQIDNO.78-79所示。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共15个循环；72℃终延伸60s；4℃保持。
9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)的免疫组库精准信息分析包括以下步骤：
1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据***序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提高检测的准确性；
4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
5)根据4)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；
6)根据5)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。
10.一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的***，包括以下操作单元：
(1)血浆cfDNA提取单元；
(2)BCRH链全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增单元；
(3)步骤(2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增单元；
(4)高通量测序单元；
(5)免疫组库精准信息分析单元。
11.如权利要求10所述的***，其特征在于，所述单元(2)中BCRH链全长多重PCR扩增采用的上游引物共22条，序列分别如SEQIDNO.1-22所示，下游引物共6条，序列分别如SEQIDNO.23-28所示；
TCRβ链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQIDNO.29-73所示，下游引物共4条，序列分别如SEQIDNO.74-77所示。
12.如权利要求10所述的***，其特征在于，单元(3)中是将单元(2)的两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增；所采用的引物序列如SEQIDNO.78-79所示。
13.如权利要求10所述的***，其特征在于，单元(5)的免疫组库精准信息分析包括以下步骤：
1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据***序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提高检测的准确性；
4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
5)根据4)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；
6)根据5)的结果进行其他相关分析。
14.权利要求10-13任一所述的***在检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的应用。
15.权利要求1-9任一所述的方法或权利要求10-13任一所述的***在制备疾病筛查试剂盒中的应用。
16.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病。
17.权利要求1-9任一所述的方法或权利要求10-13任一所述的***在制备评价免疫***功能试剂盒中的应用。
18.一种用于检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的引物组合，含有3组引物，第一组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO.1-28所示；第二组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO.29-77所示；第三组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO.78-79所示。
19.权利要求18所述的引物组合在制备疾病筛查试剂盒或诊断试剂中的应用。
20.一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的试剂盒，其含有权利要求18所述的引物组合。
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