CN105087753A - 接触表面微生物采样方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种接触表面微生物采样方法及检测方法，属于微生物检测技术领域。该采样方法包括以下步骤：1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样即可。检测方法还包括：将采样后的滤纸置于磷酸盐缓冲液中混匀，取样、计数，计算得到单位检测表面的微生物数量。本发明中采样方法操作简便、采样效能高，对接触表面微生物的机械损伤小，特别适用于大批量台面类接触表面的微生物采样，可显著提高采样效率。同时，检测方法的检测精密度和准确度高，且可显著提高检测效率。

Description

接触表面微生物采样方法及检测方法

技术领域

本发明涉及一种接触表面微生物采样方法，同时还涉及一种接触表面微生物检测方法，尤其是针对台面类接触表面微生物的采样和检测，属于微生物检测技术领域。

背景技术

在食品加工环境中食品表面上附着有各类微生物，其中食源性致病菌是引发公共卫生安全问题的重要生物危害。食品加工过程中人与食品、食品与食品、食品与设备等之间的接触会使得这些微生物相互交叉感染，而致病菌对食品尤其是已经过杀菌处理的食品的感染，会引发食品质量问题，威胁公共健康。因此，食品加工环境中食品接触表面上微生物的检测不仅是有关部门进行食品及公共卫生安全监测和防控的重要部分，同时也是生产企业实现对食品加工过程中微生物监控的重要手段。通过该监控手段企业可以验证或评估目标微生物控制程序的有效性，确保食品质量，推进安全体系的持续改进。

目前，环境接触表面微生物检测分析方法主要包括平板培养基直接接触培养法、ATP生物荧光法、蛋白质检测试剂盒法、荧光显微镜检法以及稀释平板计数法。其中平板培养基直接接触培养法采用直接接触取样的方法，其操作简单，不需要中间处理过程，但是采样效能低、漏检率大。ATP生物荧光法和蛋白检测试剂盒法是对接触表面存在的ATP或蛋白质物质信号进行检测的方法，但是接触表面残渣物质中存在的ATP或蛋白质会对检测结果产生干扰，特异性较差。荧光显微镜检法检测迅速，检测灵敏度和准确度高，但是对检测设备和检测人员的要求较高，推广有局限性。稀释平板计数法是当前食品加工场所应用最广泛的表面微生物检测方法，该方法包括表面微生物采样、样品检测前的转运或储藏、样品处理、样品检测等步骤，其中表面微生物样品的采集是检测的基础，也是检测方法的关键步骤。采样过程吸附获得表面微生物的效能、微生物采集工具释放微生物至检测体系的效能以及样品检测前转运或储藏条件对保持微生物数目和活性的效能等决定了检测方法的总效能。

稀释平板计数法常用的采样方法包括涂抹法和贴纸法。涂抹法是指用棉签等拭子类采集工具在规格板界定范围内左右上下涂抹取样的方法，但是就表面微生物实际采样状况而言，棉签拭子体积小，在大面积样本采样时操作费时费力，且采样操作过程难以标准化，结果精密度差。贴纸法是将一定面积的滤纸充分粘贴于待测表面并停留一定时间取样的方法，该方法较涂抹法操作简单，但是采样过程吸附获得表面微生物的效能较低，检测结果准确度低。因此，为提高检测过程标准化程度及检测方法的精密度、准确度和检测效率，实现食品加工过程中环境微生物的有效监测，有必要对接触表面微生物的采样方法作进一步改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种接触表面微生物采样方法，该方法操作简便，采样效能高(采样量大、损失小)。

同时，本发明还提供一种接触表面微生物检测方法，该方法操作简便，检测精密度、准确度和检测效率高。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

接触表面微生物采样方法，包括以下步骤：

1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；

2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样即可。

步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.05～0.15％，表面活性剂0.05～0.15％，氯化钠0.8～0.9％，余量为水。优选的，由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％，表面活性剂0.1％，氯化钠0.85％，余量为水。

步骤1)中所述表面活性剂优选吐温系列，可采用任意一种型号(如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80，优选吐温-80)或者多种型号的混合物。

步骤2)中所述停留采样的时间为10～60s，优选为30s。

接触表面微生物检测方法，包括以下步骤：

1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；

2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样；

3)将采样后的滤纸置于磷酸盐缓冲液中混匀，取样、计数，计算得到单位检测表面的微生物数量。

步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.05～0.15％，表面活性剂0.05～0.15％，氯化钠0.8～0.9％，余量为水。优选的，由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％，表面活性剂0.1％，氯化钠0.85％，余量为水。

步骤1)中所述表面活性剂优选吐温系列，可采用任意一种型号(如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80，优选吐温-80)或者多种型号的混合物。

步骤2)中所述停留采样的时间为10～60s，优选为30s。

步骤3)中所述磷酸盐缓冲液优选pH7.2的PBS缓冲液。

步骤3)中所述混匀优选漩涡振荡处理。

步骤3)中所述计数优选稀释平板计数法，如10倍稀释后于TSA-0.6％YE平板培养并计数。

本发明的有益效果：

本发明中采样方法操作简便、采样效能高(采样量大、损失小)，对接触表面微生物的机械损伤小，特别适用于大批量台面类接触表面的微生物采样，可显著提高采样效率。本发明采用含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的润湿液浸润滤纸，可解决干燥状态下微生物粘附于待测表面而不易被移除的难题，提高滤纸覆盖获取接触表面微生物的采样效能。其中表面活性剂优选吐温80，可促进微生物从吸附表面分离；同时，蛋白胨能保护接触表面已受损的微生物细胞再造破坏，减弱采样过程对微生物可能造成的机械损伤。

本发明中检测方法操作简便，检测精密度和准确度高，适用于大批量台面类接触表面的微生物检测，可显著提高检测效率。其中采用磷酸盐缓冲液保存采样滤纸，有利于维持待检测微生物所处环境的稳定性。

附图说明

图1为试验例中滤纸覆盖法和棉签拭子涂抹法对不同致病菌的检测结果；

图2为滤纸覆盖法对接触表面不同致病菌系列浓度污染水平的检测结果。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中接触表面微生物采样方法，步骤如下：

1)将无菌干燥滤纸(5cm×5cm)置于无菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％，表面活性剂0.1％，氯化钠0.85％，余量为水；

2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留30s采样即可。

接触表面微生物检测方法，步骤如下：

1)用无菌镊子将上述采样后的滤纸取下并置于10mLpH7.2的PBS缓冲液中，漩涡振荡混匀30s，使滤纸上的微生物充分释放洗脱至缓冲液中，得处理液备用；

2)取少量处理液进行10倍稀释，于TSA-0.6％YE平板上培养并计数(即稀释平板计数法)，再计算得到单位检测表面的微生物数量，计算公式如下：

a＝Log(4N/m)+n+1

式中：a表示每100cm²面积接触表面上致病菌对数值，单位为Log(CFU/100cm²)；n表示处理液10倍稀释次数；m表示取液量，单位为mL；N表示n次10倍稀释液取样量m时对应的平板菌落数CFU。

实施例2

本实施例中接触表面微生物采样方法，步骤如下：

1)将无菌干燥滤纸(5cm×5cm)置于无菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.05％，表面活性剂0.05％，氯化钠0.9％，余量为水；

2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留10s采样即可。

接触表面微生物检测方法同实施例1。

实施例3

本实施例中接触表面微生物采样方法，步骤如下：

1)将无菌干燥滤纸(5cm×5cm)置于无菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.15％，表面活性剂0.15％，氯化钠0.8％，余量为水；

2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留60s采样即可。

接触表面微生物检测方法同实施例1。

试验例

1、不锈钢接触表面金黄色葡萄球菌的滤纸覆盖法和棉签拭子涂抹法检测比较

待检测表面制作：将25μL新鲜培养的金黄色葡萄球菌ATCC6538菌液接种于钢板上，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用。

采样和检测方法：分别采用实施例1中采样方法及棉签拭子涂抹法完成待检测表面微生物采样，检测方法基本同实施例1，即将采样后的滤纸或棉签置于磷酸盐缓冲液中混匀。

计算和统计方法：均值和标准差采用Microsoftexcel计算，显著性分析采用SPSS13.0ANOVA，P>0.05，差异不显著。试验结果见图1。

2、不锈钢接触表面沙门氏菌的滤纸覆盖法和棉签拭子涂抹法检测比较

待检测表面制作：将25μL新鲜培养的沙门氏菌CMCC50035菌液接种于钢板上，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用。

采样、检测方法以及计算、统计方法同试验例1，试验结果见图1。

3、不锈钢接触表面单核细胞增生李斯特菌的滤纸覆盖法和棉签拭子涂抹法检测比较

待检测表面制作：将25μL新鲜培养的单核细胞增生李斯特菌ATCC27708菌液接种于钢板上，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用。

采样、检测方法以及计算、统计方法同试验例1，试验结果见图1。

从图1可以看出，滤纸覆盖法对应检测表面金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌的采样获得量均大于棉签拭子涂抹法，且更接近于接种量；对于沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌，滤纸覆盖法对应的采样获得量显著大于棉签拭子涂抹法。表明本发明中滤纸覆盖法的检测结果较为准确，可用于接触表面致病菌的采样和检测。

4、不锈钢接触表面金黄色葡萄球菌系列浓度梯度水平污染的检测

待检测表面制作：将新鲜培养的金黄色葡萄球菌ATCC6538菌液稀释成若干浓度梯度，分别取25μL，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用。

采样和检测方法：同实施例1。

计算方法：均值和标准差采用Microsoftexcel计算。试验结果见图2。

5、不锈钢接触表面沙门氏菌系列浓度梯度水平污染的检测

待检测表面制作：将新鲜培养的沙门氏菌CMCC50035菌液稀释成若干浓度梯度，分别取25μL，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用。

采样、检测方法以及计算方法同试验例4，试验结果见图2。

6、不锈钢接触表面单核细胞增生李斯特菌系列浓度梯度水平污染的检测

待检测表面制作：将新鲜培养的单核细胞增生李斯特菌ATCC27708菌液稀释成若干浓度梯度，分别取25μL，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用。

采样、检测方法以及计算方法同试验例4，试验结果见图2。

从图2可以看出，滤纸覆盖法难能稳定检测不同浓度水平污染接触面上金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。表明本发明中滤纸覆盖法的程序规范，操作简单、方便，检测结果稳定，适用于食品加工场所操作台面类表面致病菌的采样检测，可提高大批量采样台面类的采样和检测效率。

7、实施例1～3中接触表面微生物检测方法比较

待检测表面制作：分别在不锈钢接触表面接种金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌，方法同上，接种量见下表1。

采样、检测方法：分别采用实施例1～3中接触表面微生物检测方法。各检测方法对不同致病菌的检测结果见下表1。

表1实施例1～3中检测方法对不同致病菌的检测结果

注：同一菌种各处理结果上标注不同字母者存在显著性差异(P<0.05)。

从表1可以看出，由于实施例2对应检测方法的覆盖停留时间为10s，故三种致病菌的获得量均小于实施例1和实施例3。同时，润湿液中蛋白胨和表面活性剂含量略高且覆盖停留时间较长的实施例3对应检测方法的获得量较实施例1并未显著增加，故润湿液组成和采样停留时间优先参照实施例1。

Claims (10)

1.接触表面微生物采样方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；

2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样即可。

2.根据权利要求1所述的采样方法，其特征在于：步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.05～0.15％，表面活性剂0.05～0.15％，氯化钠0.8～0.9％，余量为水。

3.根据权利要求2所述的采样方法，其特征在于：所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％，表面活性剂0.1％，氯化钠0.85％，余量为水。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的采样方法，其特征在于：步骤1)中所述表面活性剂选自吐温系列中的任意一种或多种。

5.根据权利要求4所述的采样方法，其特征在于：所述表面活性剂为吐温-80。

6.接触表面微生物检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；

2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样；

3)将采样后的滤纸置于磷酸盐缓冲液中混匀，取样、计数，计算得到单位检测表面的微生物数量。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.05～0.15％，表面活性剂0.05～0.15％，氯化钠0.8～0.9％，余量为水。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％，表面活性剂0.1％，氯化钠0.85％，余量为水。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述表面活性剂选自吐温系列中的任意一种或多种。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中所述停留采样的时间为10～60s。