CN105076163B - 小檗碱作为农用杀菌剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于农药应用技术领域，涉及小檗碱的新用途，具体的说是涉及小檗碱作为农用杀菌剂的新用途。小檗碱作为农用杀菌剂的新用途，所述的农用杀菌剂的新用途是在防治植物病原菌引起的植物病害的用途。本发明通过研究发现小檗碱对多种植物病原菌具有较好的抑制作用，为把小檗碱开发成为一种新农药提供了理论基础。

Description

小檗碱作为农用杀菌剂的新用途

技术领域

本发明属于农药应用技术领域，涉及小檗碱的新用途，具体的说是涉及小檗碱作为农用杀菌剂的新用途。

背景技术

小檗碱又称黄连素。是一种常见的异喹啉生物碱，分子式C₂₀H₁₈NO₄，其结构如下：

小檗碱存在于小檗科等四个科十个属的许多植物中。1826年M.-E.夏瓦利埃和G.佩尔坦从Xanthoxylonclava树皮中首次获得。小檗碱为一种季铵生物碱。从***中可析出黄色针状晶体；熔点145℃；溶于水，难溶于苯、***和氯仿。主要用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等肠道感染、眼结膜炎、化脓性中耳炎等有效。近来还发现本品有阻断α-受体，抗心律失常作用。

小檗碱对溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌，***和弗氏、志贺氏痢疾杆菌等均有抗菌作用，并有增强白血球吞噬作用，对结核杆菌、鼠疫菌也有不同程度的抑制作用，对大鼠的阿米巴菌也有抑制效用。小檗碱在动物身上有抗箭毒作用，并具有末梢性的降压及解热作用。小檗碱的盐酸盐(俗称盐酸黄连素)已广泛用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定疗效。中医常用黄连、黄柏、三颗针及十大功劳等作清热解毒药物，其中主要有效成分即小檗碱。

目前，小檗碱主要用于医药领域，而有关小檗碱的活性物质在农用抑菌活性方面的研究较少。有报道指出，小檗碱能抵抗引起植物根腐病的多种瘤梗孢的侵染；邓业成等研究发现，狭叶十大功劳根茎提取物对梨褐斑病具有较好的抑制作用，其有效中浓度为1.798g/L。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的是拓展小檗碱的用途，为小檗碱作为农用杀菌剂的用途提供理论基础。

本发明提供的技术方案为：

小檗碱作为农用杀菌剂的新用途，所述的农用杀菌剂的新用途是在防治植物病原菌引起的植物病害的用途。

作为优选，所述的植物病原菌包括植物病原真菌和植物病原细菌。

作为优选，所述的植物病原真菌为玉米小斑病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、烟草疫霉病菌、柑橘绿霉病菌和烟草白绢病菌。

作为优选，所述的植物病原细菌为水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、李细菌性穿孔病菌、核桃黑斑病菌和柑橘溃疡病菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明使用的小檗碱是从狭叶十大功劳中提取、分离得到的，为将狭叶十大功劳开发成一种植物源杀菌剂奠定了基础，丰富了具有杀菌作用的植物品种。

2.发明人对小檗碱抑制多种植物病原菌的活性进行了深入研究，实验结 果发现小檗碱对多种植物病原菌具有较好的抑制作用，本发明为把小檗碱开发成为一种新农药提供了理论基础。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

发明人通过大量的筛选试验，发现小檗碱对多种农业植物病原菌具有较好的抑制作用，这从以下生物测定实例可以清楚看出。

实施例1：小檗碱对植物病原真菌的抑制作用

参照慕立义(1991)的菌丝生长速率法，测试供试样品对不同植物病原真菌菌丝生长速率的影响。

(1)供试菌种的活化：将供试真菌接种于9cm的PSA平板培养皿中，于28℃恒温培养箱中培养，待菌落长至培养皿的2/3，用直径为7mm的灭菌打孔器于菌落边缘打孔，制成直径为7mm的菌饼，备用。

(2)带毒平板培养基的制备：称取适量的供试样品，用甲醇将其完全溶解后，用灭菌水稀释制成样品溶液，吸取样品溶液加至定量为100mL的热融化并冷却至50℃左右的PSA热培养基中，充分混匀，倒入直径9cm培养皿中，制成厚薄一致的带毒培养基，充分凝固备用。

(3)对照设置：①空白对照(CK1)：灭菌水对照；②溶剂对照(CK2)：以能够溶解供试样品且对真菌生长无明显影响的溶剂作为溶剂对照。

(4)处理步骤：分别挑取供试菌种的菌饼，倒置于带毒平板培养基的中央，每皿接一个菌饼，每个处理3次重复，作好标记。将处理皿放置于28℃ 恒温培养箱中培养，定时观察菌落生长状况。待对照组菌落的直径达培养皿直径的2/3以上时，用十字交叉法测量菌落直径，作好记录。利用下列公式，计算活性物质对植物病原真菌的抑菌率：

在小檗碱浓度为0.1g/L下，采用上述的菌丝生长速率法测试小檗碱对16种植物病原真菌的抑菌效果。结果表明，小檗碱对15种植物病原真菌具有一定的抑菌作用(表1)。其中，小檗碱对玉米小斑病菌表现为完全抑制(抑制率达100％)，对香蕉弯孢霉叶斑病菌和烟草疫霉病菌的抑制作用较强，抑制率在80％以上，对柑橘绿霉病菌和烟草白绢病菌也有较好的抑制作用，抑制率在60％以上，但对茉莉叶点霉叶斑病菌、杧果拟盘多毛孢叶枯病菌、猕猴桃棒孢霉、烟草棒孢霉叶斑病菌、烟草灰霉病菌、甘蓝黑斑病菌、香蕉炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、西瓜枯萎病菌及柑橘树脂病菌的抑制作用一般或较差，抑制率在6％～44％之间，对水稻纹枯病菌几乎没有抑制作用。与清水处理相比，所用的溶剂对照对供试病原菌无抑制作用。

表1小檗碱对植物病原真菌的抑菌活性

实施例2：小檗碱对细菌的抑制作用

参照抑菌圈法中的琼脂打孔扩散法，操作步骤如下：

(1)菌液的制备：将供试细菌于NA培养基中划线活化，于28℃恒温培养箱中培养48h，再用灭菌环挑取培养好的细菌至NA液体培养中，置于28℃、120r/m振荡培养箱中振荡培养24h，备用。

(2)带菌培养基的制备：将定量为100mL的NA培养基热融化完全，待其冷却至45℃左右，吸取1mL培养好的细菌悬浮液注入培养基中，充分摇匀，均匀倒入直径为9cm培养皿中，每皿约25mL NA培养基，凝固后备用。

(3)样品溶液制备：取完全溶解的样品溶液，用灭菌水稀释配制成需要的浓度，备用。

(4)对照设置：(a)药剂对照(CK1)：以100mg/L医用链霉素作为阳性对照；(b)清水对照(CK2)：灭菌水对照；(c)溶剂对照(CK3)：以溶解供试样品的溶剂作为溶剂对照。

(5)处理步骤：将直径为5mm的打孔器用酒精灯火焰灭菌消毒，待其冷却后，在带菌培养基上打孔，每皿打3-4孔(呈三角形或四方形)，用灭菌的牙签挑走小孔里的培养基。将配置好的样品溶液和对照溶剂依次有序的注入小孔中，每孔45μL，做好标记，每个处理3次重复。将处理好的皿置于28℃恒温培养箱中培养48h后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

在浓度为1g/L下，测试小檗碱对7种植物病原细菌、2种常用植物病害生防细菌及大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这2种常见人体致病菌的抑菌活性。

表2小檗碱对细菌的抑菌活性

如表2所示，小檗碱对6种植物病原细菌均具有一定的抑菌活性，其中对水稻白叶枯病菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到32.00mm；其次为水稻细菌性条斑病菌和李细菌性穿孔病菌，抑菌圈直径分别为14.17mm和13.17mm；对核桃黑斑病菌、金黄色葡萄球菌和柑橘溃疡病菌的抑菌圈直径在3-10mm之间；对生防菌枯草芽孢杆菌B47和B96的生长几乎没有影响，抑菌圈直径分别为1.50mm和0.83mm；对魔芋软腐病菌和大肠杆菌没有抑菌效果。

实施例3：小檗碱对水稻细菌性条斑病菌的毒力

参照杜连祥(2005)OD值法测定样品对供试细菌的毒力。

(1)菌种制备：菌种活化方法同上，利用紫外分光光度仪测试病原菌的吸光度，将菌液稀释至1×109cfu/mL，备用。

(2)样品溶液制备：取完全溶解的样品溶液，用灭菌水稀释配制成需要的浓度，分别加入50mL的液体NA瓶内(对照组含有等量的溶样溶剂)，制得不同浓度的含药液体培养基，备用。

(3)吸取0.5mL菌液到50mL液体NA培养内，制成含菌量为1×107cfu/mL菌悬液。混合均匀后于28℃，130r/m条件下培养24h，待测。

(4)用含有相同样品浓度的未接菌的培养液做空白(对照组用含等量溶样溶剂的培养液做空白)进行调零，分别测定处理的OD600值。按下列公式 计算抑菌率：

利用OD值法，通过预备试验，将小檗碱按公比1.68设计了五个浓度，分别为1、1.68、2.83、4.76和8mg/L；对照药剂为硫酸铜，也设计了五个浓度，分别为2.4、2.76、3.174、3.651和4.198mg/L。

表3小檗碱对水稻细菌性条斑病菌的毒力

如表3所示，小檗碱和硫酸铜对水稻细菌性条斑病菌的EC50分别为2.9008和2.9929，与对照药剂硫酸铜相比，小檗碱对水稻细菌性条斑病菌的抑菌活性更强。

实施例4：1％小檗碱微乳剂

将原药小檗碱溶于有机溶剂及助溶剂中，待溶解完全后，加入乳化剂，搅拌均匀，使之形成均一的混合体系，然后向体系中滴加水相，搅拌形成透明的W/O型微乳，再于55℃条件下水浴搅拌，使之形成O/W型微乳，即制成1％小檗碱微乳剂。

实施例5：1％小檗碱微乳剂对水稻细菌性条斑病的防治效果

设1％小檗碱微乳剂有效成分0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L三个处理，以20％叶枯唑可湿性粉剂有效成分0.44g/L为药剂对照，以清水处理为空白对照，共五个处理，每处理3次重复。选择分蘖期水稻，采用以下两种方法对水稻叶片接种病原菌：

(1)针刺接种法：取5号昆虫针两颗，用橡皮胶头固定，两针之间距离控制在0.5cm左右。用针蘸取菌液(1.0x108cfu/mL)，以叶脉为界分左右两边刺穿叶片接种。每重复接种15片叶或3丛水稻植株，保湿培养48h后，施药防治。常规管理10d、15d或20d后测量病斑长度，按下列公式计算防治效果。

防治效果(％)＝(1－处理病斑长度/对照病斑长度)×100

(2)微伤口喷雾接种法：将欲接种水稻植株聚拢排放，用表面光滑均一的铁杆轻轻拍赶水稻叶片，使植株、叶片之间相互接触、摩擦，造成微伤口，然后使用喷雾器将浓度为1×108cfu/mL的菌液均匀喷洒于水稻叶片的正面和背面，以不流液为度。每重复6丛水稻植株，保湿培养48h后，施药防治，常规管理15d后，根据空白对照发病情况，按照病害分级调查的方法统计数据。水稻细菌性条斑病的病害分级标准如下：

0级：叶面无病斑；

1级：叶面仅有小点半透明水渍状病斑，占叶面积的1％以下；

3级：叶面有零星短而窄条病斑，占叶面积的1％～5％；

5级：叶面病斑较多，占叶面积的6％～25％；

7级：叶面病斑较密，占叶面积的26％～50％；

9级：叶面病斑分布在50％以上，叶片变橙褐色，卷曲、枯死。

药效计算方法：试验调查的数据共有病情指数(以下简称病指)和防治效果(以下简称防效)2种，按照下列公式计算试验结果；

表4针刺法接种试验中小檗碱对水稻细菌性条斑病的防治效果

如表4所示，不同浓度的小檗碱对水稻细菌性条斑病的防治效果不同，在三个浓度中，浓度为0.5g/L的时候防效最高，药后10d时防治效果达到94.06％，与叶枯唑相比，差异未达到显著水平，但在药后20d药效有所降低，防治效果为89.04％，明显低于叶枯唑在浓度为0.44g/L时的防治效果。在药后10d时，小檗碱三个浓度处理的防治效果差异不大，没有达到显著水平。在药后20d时，在5％平准下，三个浓度处理之间的防治效果均达到了显著水平。

表5喷雾法接种试验中1％小檗碱微乳剂对水稻细菌性条斑病的防治效果

如表5所示，喷雾接种法的防治效果不如针刺法的防治效果好，但三个浓度之间的防治效果和针刺法防治效果的高低顺序相似，都是浓度越高防效越好。其中小檗碱0.5g/L和0.1g/L处理之间的差异不显著，并且与0.44g/L叶枯唑的防治效果相当。

实施例6：小檗碱对水稻细菌性条斑病的持效期、保护作用及治疗作用

表6 1％小檗碱微乳剂对水稻细菌性条斑病的持效期、预防及治疗效果

如表6所示，1％小檗碱微乳剂喷雾处理21d、17d、14d、11d、7d、3d后及施药当天，采用针刺法接种，以及接种后3d、7d后喷施小檗碱等9个处理中，以喷施小檗碱当天接菌的处理对水稻细菌性条斑病的防治效果最好，防效达74.84％，但与喷施小檗碱3d、7d、11d后再接菌的防效相比未达差异极显著水平；施药后21d再接菌的防治效果最差，防效只有34.74％。说明虽然小檗碱对水稻细菌性条斑病的防治效果随着用药时间的延长而降低，但持效期较长；接种3d后施药的防治效果(63.67％)虽然低于施药7d后接菌的防效(70.77％)，但未达差异显著水平；接菌后7d施药与药后14d 再接菌的防治效果相当，分别为53.45％和53.44％，这说明小檗碱对水稻细菌性条斑病有较好的保护效果和治疗效果，保护效果优于治疗效果。

综上所述，小檗碱对多种农业植物病原菌具有较好的抑制作用，尤其是对水稻细菌性条斑病菌的防治效果较为显著，为把小檗碱开发成为一种新的植物源杀菌剂提供了一种新的思路。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (1)

1.小檗碱作为农用杀菌剂的新用途，其特征在于：所述的农用杀菌剂的新用途是在防治植物病原菌引起的植物病害的用途；所述的植物病原菌为植物病原细菌；所述的植物病原细菌为水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、李细菌性穿孔病菌、核桃黑斑病菌和柑橘溃疡病菌。