CN105067814A - 解旋酶水解atp活性测定方法 - Google Patents

解旋酶水解atp活性测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解旋酶水解ATP活性测定方法。针对现有技术中测定解旋酶水解ATP活性采用放射性标记法，存在放射性物质使用风险、操作时间长的缺陷，本发明提供了一种测定解旋酶水解ATP活性的方法。本方法采用Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT等溶液混合制成反应液加入由解旋酶与ATP底物组成的解旋酶水解ATP体系，反应后加入由孔雀石绿、钼酸铵、吐温-20等溶液混合制成的反应终止液，显色后测定生成的蓝色络合物在650nm下的吸光度，计算解旋酶水解ATP生成的正磷酸浓度并由此计算出解旋酶水解ATP活性。本发明方法原理可靠，试剂及操作均为常规化学试剂，无放射性污染，安全性高；方法反应快捷、测定周期短；测定仪器常规，测算结果精度高，成本经济，且能够适用于批量样品测定。

Description

解旋酶水解ATP活性测定方法
技术领域
本发明涉及一种测定方法，特别是涉及一种测定解旋酶水解ATP活性的方法，属于酶活性测定方法领域。
背景技术
解旋酶是一类分子马达蛋白，在生物体内DNA复制、转录、修复和重组过程发挥重要作用。解旋酶通过水解ATP获取能量，用以解开双链DNA。因此测定解旋酶水解ATP的活性是研究生物体内DNA代谢的重要内容。
现有技术中，测定解旋酶水解ATP活性的方法是采用放射性标记法。其操作是首先对ATP进行放射性标记，当解旋酶水解放射性标记ATP时，生成放射性标记自由磷进入反应体系。通过自显影方法测定反应体系中放射性标记自由磷的量，用以表征解旋酶水解ATP的活性水平。该方法的主要技术缺陷在于需要电泳分离自由磷，耗时费力。并且放射性标记ATP的过程需要特别的安全防护操作。因而现有放射性标记法测定方法存在成本高、具有放射性污染、样品处理时间长、仪器等待时间长的不足，并且进一步限制了该方法对满足批量样品测定的需要。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种测定解旋酶水解ATP活性的方法。该方法是非放射性解旋酶水解ATP活性测定法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种解旋酶水解ATP活性测定方法，用于测定解旋酶对ATP的水解活性，其特征在于：依照如下步骤实施：
步骤S1、解旋酶水解ATP体系中加入反应液进行反应
向解旋酶水解ATP体系中加入反应液，混匀，制成反应体系，反应体系于37℃水浴孵育不低于10min，
所述解旋酶水解ATP体系包括解旋酶与ATP底物；
所述反应液是100mmol/LTris-HCl、250mmol/LNaCl、50mmol/LMgCl2、25mmol/LDTT的混合溶液；
步骤S2、终止反应
将反应体系迅速置于冰上，向其中加入反应终止液，混匀，终止反应；
所述反应终止液是溶液a:溶液b:溶液c(v/v)＝100:25:2的混合溶液再加入溶液a、溶液b、溶液c总体积3倍量的去离子水混合均匀；
所述溶液a是以3mol/L的浓硫酸为溶剂配制得所的0.12‰(w/v)孔雀石绿溶液，
所述溶液b是7.5％(w/v)钼酸铵溶液，
所述溶液c是11％(v/v)吐温-20；
步骤S3、显色
反应体系置于37℃水浴，孵育不低于15min；
步骤S4、测定吸光度计算活性
在650nm下测定吸光度，根据反应生成的蓝色络合物在650nm下的吸光度与磷标准曲线的关系计算活性。
上述解旋酶水解ATP活性测定方法，其原理在于：孔雀石绿与钼酸铵混合成一定酸度的显色液，在吐温20存在下可以与溶液中解旋酶水解ATP得到的正磷酸发生反应生成蓝色的络合物，络合物在一定波长下具有吸收峰。基于这一原理，本方法采用Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT等溶液混合制成反应液加入由解旋酶与ATP底物组成的解旋酶水解ATP体系，反应后加入由孔雀石绿、钼酸铵、吐温-20等溶液混合制成的反应终止液，显色后测定生成的蓝色络合物在650nm下的吸光度，计算解旋酶水解ATP生成的正磷酸浓度并由此计算出解旋酶水解ATP活性。
在优选条件下，上述方法可加以优化：对于反应体系的优化在于解旋酶水解ATP体系中ATP浓度不大于500umol/L，且以500umol/L为优。对反应操作的优化在于加入反应液后，反应体系置于37℃水浴条件孵育10min。对于终止反应操作的优化在于步骤S2中，反应终止液加入量为反应终止液:反应体系(v/v)＝4:1。对于显色操作的优化在于步骤S3中反应体系置于37℃水浴条件孵育15min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)与现有技术采用放射性标记法测定解旋酶水解ATP活性法相比，本发明方法在测定过程中不使用放射性同位素，所使用均为常规常用化学试剂，无操作危险、无污染风险，安全性高；(2)由于不使用放射性元素，本发明方法无需放射性标记法中电泳分离的繁琐操作，不需要过夜曝光步骤，化学反应迅速，整个测定过程仅需半个小时，在保证测定精度的前提下大大节约了时间成本；(3)现有放射性测定法由于测量时间较长以及电泳胶孔数量的限制，而无法适用于批量样本的快速测定。而本发明可用于批量检测解旋酶ATP水解活性，效率大为提高；(4)本发明方法中不使用放射性元素材料，且测定仪器常规，降低了成本。
附图说明
图1是磷标准曲线。
图2是DnaB解旋酶的ATP水解活性。
图3是DnaG对DnaB的ATP水解活性的影响。
图4是ssDNA对DnaB的ATP水解活性的影响。
图5是反应液吸收光谱图。
图6是ATP-Na2浓度对吸光度的影响。
图7是解旋反应时间对吸光度的影响。
图8是显色时间对吸光度的影响。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
涉及使用的溶液、试剂、设备
反应液：100mmol/LTris-HCl、250mmol/LNaCl、50mmol/LMgCl2、25mmol/LDTT，混匀
溶液a：以3mol/L的浓硫酸为溶剂配制所得0.12‰(w/v)孔雀石绿溶液
溶液b：7.5％(w/v)钼酸铵溶液
溶液c：11％(v/v)吐温-20
反应终止液：溶液a:溶液b:溶液c(v/v)＝100:25:2的混合溶液，再加入溶液a、溶液b、溶液c总体积3倍量的去离子水，混匀。反应终止液仅可存放一天，每次使用需当天配制。
磷标准溶液：磷酸二氢钠溶液，浓度分别为50umol/L、100umol/L、150umol/L、200umol/L、250umol/L
解旋酶溶液：嗜热脂肪芽孢杆菌DnaB解旋酶(指代解旋酶六聚体)溶液
引物酶:DnaG引物酶
ATP溶液：500umol/LATP-Na2溶液
ssDNA溶液：ssDNA(即16bp的寡聚核苷酸T)溶液
多功能酶标仪：ThermoVaioskanFlash全波长多功能酶标仪
96孔板：Costar359996孔细胞培养板
实施例一
如图1～图2所示，采用本发明方法测定解旋酶水解ATP活性。
1、磷标准曲线的制作
分别量取5种浓度的磷酸二氢钠溶液各40uL，另以蒸馏水作为空白对照。各处理在37℃水浴条件下孵育10min，分别加入160ul反应终止液，混匀，37℃水浴条件下孵育15min，使用多功能酶标仪测定650nm处吸光度。
以测得的吸光度值(OD)为纵坐标，以磷酸二氢钠溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1：磷标准曲线)。经计算，磷标准曲线的回归方程为：y＝0.0037x-0.008，相关系数0.9991。表明溶液中的正磷酸浓度在0umol/L～250umol/L内与吸光度有着良好的相关性。
2、解旋酶水解ATP活性测定
配制反应体系：量取8uL反应液加入ATP溶液，混匀，加入解旋酶溶液，加入超纯水，分别配制成解旋酶浓度为5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L、20nmol/L、25nmol/L、30nmol/L的反应体系各40uL。
各反应体系分别于37℃水浴孵育10min，迅速置于冰上，分别加入160ul反应终止液，混匀，分别于37℃水浴孵育显色，显色时间15min。
显色后将反应体系转移至96孔板上，使用酶标仪测定各反应体系650nm处吸光度。
根据磷标准曲线方程计算各反应体系中解旋酶活性。解旋酶的ATP水解活性(s-1)指单位时间内单位摩尔数的解旋酶单体水解的ATP浓度。测定进行三次重复，结果稳定，数据再现性良好。以解旋酶浓度为横坐标，水解得到的正磷酸浓度为纵坐标，结果见图2(图2：DnaB解旋酶的ATP水解活性)。
图2同时表明，当反应体系中DnaB浓度为5nmol/L～30nmol/范围内时，随着DnaB浓度的增大，在10min内水解得到的磷酸根浓度程线性提高，测定数据灵敏度高。该结果与现有技术采用放射性同位素标记法测定结果相近(见参考文件1)。
实施例二
本发明方法在反应体系中存在引物酶DnaG时的测定效果。
配制40ul反应体系，其中反应液8uL，加入DnaB解旋酶溶液至反应体系中DnaB浓度10nmol/L，加入DnaG溶液至反应体系中DnaG浓度分别至0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L、40nmol/L、50nmol/L、60nmol/L、100nmol/L、150nmol/L，加入超纯水定容，形成各处理梯度浓度。反应体系分别于4℃静置1h，加入ATP-Na2溶液至反应体系中ATP-Na2浓度500umol/L；反应体系分别置于37℃水浴条件下孵育10min。反应终止和显色操作同实施例一。以引物酶DnaG浓度为横坐标，以反应速率为纵坐标绘制曲线，DnaG引物酶对解旋酶活性的影响如图3(图3：DnaG对DnaB的ATP水解活性的影响)。
图3显示，随着DnaG浓度的增大，解旋酶的ATP水解活性逐渐增大，当DnaG浓度达到约40nmol/L，随着引物酶浓度的提高，解旋酶的ATP水解活性的上升趋势逐渐减缓。
本测试例表明，当另外一个蛋白(引物酶DnaG)存在时，采用本发明方法测定显示解旋酶水解ATP活性提高。该测定结果与现有技术中测定结论相一致(见参考文件2～4)，进一步说明本方法可用于解旋酶水解ATP活性的测试。
实施例三
本发明方法在反应体系中存在ssDNA时的测定效果。
配制40ul反应体系，其中反应液8uL，加入DnaB解旋酶溶液至反应体系中DnaB浓度10nmol/L，加入ssDNA溶液至反应体系中ssDNA浓度分别为0.5umol/L、1umol/L、1.5umol/L、2.5umol/L、12.5umol/L、25umol/L，加入超纯水定容，形成各处理的梯度浓度。
反应体系分别于4℃静置1h，加入ATP-Na2溶液至反应体系中ATP-Na2浓度为500umol/L；反应体系分别置于37℃水浴条件下孵育10min。反应终止和显色步骤同实施例一。以ssDNA浓度((dT)16)为横坐标，以反应速率为纵坐标绘制曲线，ssDNA浓度对解旋酶活性的影响如图4(图4：ssDNA对DnaB的ATP水解活性的影响)。
图4显示，当ssDNA浓度小于2.5umol/L时，随着ssDNA浓度的增大，解旋酶的ATP水解活性显著增高，当ssDNA浓度达到2.5umol/L后，解旋酶的ATP水解活性随ssDNA浓度提高不再增大，呈平稳趋势。
本测试例表明，当反应体系中存在ssDNA时，采用本发明方法测定显示解旋酶水解ATP活性提高。该测定结果与现有技术中测定结论相一致(见参考文件2)，进一步说明本方法可用于解旋酶水解ATP活性的测试。
测试例一
吸收波长的优化选择。
配制200umol/L磷酸二氢钠溶液40uL，置于37℃条件下水浴孵育10min，加入160ul反应终止液，混匀，于37℃水浴孵育显色15min。用酶标仪扫描550nm～750nm波长下的吸光度。以测得的吸光度值(OD)为纵坐标，以扫描波长为横坐标，绘制反应液吸收光谱扫描曲线图见图5(图5：反应液吸收光谱图)。
图5显示，反应液在650nm吸收波长下OD值最大，显色灵敏度最高。
测试例二
ATP底物(ATP-Na2)浓度的优化选择(检测ATP底物自身，即未加入解旋酶情况下的水解情况)。
在测定过程中，ATP-Na2本身存在着少量的水解，产生背景影响测量结果，需要选择合适的ATP-Na2浓度。
配制40uLATP-Na2溶液，浓度分别为125umol/L、250umol/L、375umol/L、500umol/L、625umol/L、875umol/L、1125umol/L、1500umol/L、1875umol/L，分别置于37℃下水浴孵育10min，迅速置于冰上，加入160ul反应终止液，混匀，分别于37℃水浴孵育显色15min。用多功能酶标仪扫描650nm波长下的吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，结果如图6(图6：ATP-Na2浓度对吸光度的影响)。
图6显示，反应体系中ATP浓度在125umol/L～500umol/L范围内时，ATP-Na2自身水解得到的磷酸不足以影响吸光度；当ATP浓度大于500umol/L时，吸光度随着ATP浓度的提高呈近正比上升。底物浓度过大会产生一定的吸收值干扰实验结果，但底物浓度过小不足以使酶反应达到饱和。由此确定本发明测定方法中，反应体系中ATP度物浓度500umol/L为优化测定条件。
测试例三
解旋酶反应时间的优化选择。
解旋酶水解ATP的反应时间是影响效率的一个重要因素，反应时间过短容易造成操作误差大，反之则会限制测定进度。
以超纯水配制40uL反应体系，其中反应液8uL，解旋酶浓度20nmol/L，ATP-Na2浓度500umol/L。反应体系于37℃水浴孵育，孵育时间分别为2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、18min、22min，其余操作同测试例二。以反应时间为横坐标，吸收值为纵坐标，绘制曲线如图7(图7：解旋反应时间对吸光度的影响)。
图7显示，在该反应条件下，解旋酶的反应时间在22min内的测量范围内衰减较为缓慢，为了确保较高的实验效率，同时操作误差的影响降到最低，确定10min作为最佳反应时间。
测试例四
显色时间的优化选择。
反应终止液(即显色液)与解旋酶水解ATP得到的正磷酸反应形成络合物并不是在短时间内完成的，需要一定的反应时间，设计实验以确定完全显色需要的最小时间。
配制同测试例三的反应体系40uL。反应体系置于37℃下水浴孵育10min，迅速置于冰上，加入160ul反应终止液，混匀，分别于37℃水浴孵育显色。用多功能酶标仪在650nm波长下分别测定显色时间为1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、12min、14min、18min、22min、26min时的吸收值。以反应时间为横坐标，吸收值为纵坐标绘图，结果如图8(图8：显色时间对吸光度的影响)。
图8显示，当显色时间小于10min时，OD随着显色时间的延长迅速提高；当显色时间在10min～15min质检时，曲线呈平缓上升趋势；当显色时间大于15min后，曲线几乎不再上升，表示此时反应已达到饱和。因此，选择15min作为显色时间。
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Claims (10)

1.解旋酶水解ATP活性测定方法，用于测定解旋酶对ATP的水解活性，其特征在于：依照如下步骤实施：
步骤S1、解旋酶水解ATP液中加入反应液进行反应
向解旋酶水解ATP液中加入反应液混合均匀制成反应体系，反应体系于37℃水浴孵育不低于10min；
所述解旋酶水解ATP液包括解旋酶与ATP底物；
所述反应液是100mmol/LTris-HCl、250mmol/LNaCl、50mmol/LMgCl2、25mmol/LDTT的混合溶液；
步骤S2、终止反应
将反应体系迅速置于冰上，向其中加入反应终止液，混匀，终止反应；
所述反应终止液是溶液a:溶液b:溶液c(v/v)＝100:25:2的混合溶液再加入溶液a、溶液b、溶液c总体积3倍量的去离子水混合均匀；
所述溶液a是以3mol/L的浓硫酸为溶剂配制所得的0.12‰(w/v)孔雀石绿溶液，
所述溶液b是7.5％(w/v)钼酸铵溶液，
所述溶液c是11％(v/v)吐温-20；
步骤S3、显色
反应体系置于37℃水浴，孵育不低于15min；
步骤S4、测定吸光度计算活性
在650nm下测定吸光度，根据反应生成的蓝色络合物在在650nm下吸光度与标准曲线的关系计算活性。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，反应体系中ATP浓度不大于500umol/L。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，反应体系中ATP浓度是500umol/L。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述ATP底物是ATP-Na2。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，37℃水浴孵育10min。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S2中，反应终止液加入量为反应终止液:反应体系(v/v)＝4:1。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S3中，反应体系置37℃水浴孵育15min。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S3中，显色时间15min。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述解旋酶是嗜热脂肪芽孢杆菌DnaB解旋酶。
10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述反应体系还包括ssDNA溶液。
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