CN105067814A - 解旋酶水解atp活性测定方法 - Google Patents

解旋酶水解atp活性测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105067814A
CN105067814A CN201510443439.6A CN201510443439A CN105067814A CN 105067814 A CN105067814 A CN 105067814A CN 201510443439 A CN201510443439 A CN 201510443439A CN 105067814 A CN105067814 A CN 105067814A
Authority
CN
China
Prior art keywords
atp
solution
unwindase
reaction
reaction system
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510443439.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王刚刚
杨牧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Institute of Biology of CAS
Original Assignee
Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Institute of Biology of CAS filed Critical Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority to CN201510443439.6A priority Critical patent/CN105067814A/zh
Publication of CN105067814A publication Critical patent/CN105067814A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G01N33/5735—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种解旋酶水解ATP活性测定方法。针对现有技术中测定解旋酶水解ATP活性采用放射性标记法，存在放射性物质使用风险、操作时间长的缺陷，本发明提供了一种测定解旋酶水解ATP活性的方法。本方法采用Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT等溶液混合制成反应液加入由解旋酶与ATP底物组成的解旋酶水解ATP体系，反应后加入由孔雀石绿、钼酸铵、吐温-20等溶液混合制成的反应终止液，显色后测定生成的蓝色络合物在650nm下的吸光度，计算解旋酶水解ATP生成的正磷酸浓度并由此计算出解旋酶水解ATP活性。本发明方法原理可靠，试剂及操作均为常规化学试剂，无放射性污染，安全性高；方法反应快捷、测定周期短；测定仪器常规，测算结果精度高，成本经济，且能够适用于批量样品测定。

Description

解旋酶水解ATP活性测定方法
技术领域
本发明涉及一种测定方法，特别是涉及一种测定解旋酶水解ATP活性的方法，属于酶活性测定方法领域。
背景技术
解旋酶是一类分子马达蛋白，在生物体内DNA复制、转录、修复和重组过程发挥重要作用。解旋酶通过水解ATP获取能量，用以解开双链DNA。因此测定解旋酶水解ATP的活性是研究生物体内DNA代谢的重要内容。
现有技术中，测定解旋酶水解ATP活性的方法是采用放射性标记法。其操作是首先对ATP进行放射性标记，当解旋酶水解放射性标记ATP时，生成放射性标记自由磷进入反应体系。通过自显影方法测定反应体系中放射性标记自由磷的量，用以表征解旋酶水解ATP的活性水平。该方法的主要技术缺陷在于需要电泳分离自由磷，耗时费力。并且放射性标记ATP的过程需要特别的安全防护操作。因而现有放射性标记法测定方法存在成本高、具有放射性污染、样品处理时间长、仪器等待时间长的不足，并且进一步限制了该方法对满足批量样品测定的需要。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种测定解旋酶水解ATP活性的方法。该方法是非放射性解旋酶水解ATP活性测定法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种解旋酶水解ATP活性测定方法，用于测定解旋酶对ATP的水解活性，其特征在于：依照如下步骤实施：
步骤S1、解旋酶水解ATP体系中加入反应液进行反应
向解旋酶水解ATP体系中加入反应液，混匀，制成反应体系，反应体系于37℃水浴孵育不低于10min，
所述解旋酶水解ATP体系包括解旋酶与ATP底物；
所述反应液是100mmol/LTris-HCl、250mmol/LNaCl、50mmol/LMgCl2、25mmol/LDTT的混合溶液；
步骤S2、终止反应
将反应体系迅速置于冰上，向其中加入反应终止液，混匀，终止反应；
所述反应终止液是溶液a:溶液b:溶液c(v/v)＝100:25:2的混合溶液再加入溶液a、溶液b、溶液c总体积3倍量的去离子水混合均匀；
所述溶液a是以3mol/L的浓硫酸为溶剂配制得所的0.12‰(w/v)孔雀石绿溶液，
所述溶液b是7.5％(w/v)钼酸铵溶液，
所述溶液c是11％(v/v)吐温-20；
步骤S3、显色
反应体系置于37℃水浴，孵育不低于15min；
步骤S4、测定吸光度计算活性
在650nm下测定吸光度，根据反应生成的蓝色络合物在650nm下的吸光度与磷标准曲线的关系计算活性。
上述解旋酶水解ATP活性测定方法，其原理在于：孔雀石绿与钼酸铵混合成一定酸度的显色液，在吐温20存在下可以与溶液中解旋酶水解ATP得到的正磷酸发生反应生成蓝色的络合物，络合物在一定波长下具有吸收峰。基于这一原理，本方法采用Tris-HCl、NaCl、MgCl2、DTT等溶液混合制成反应液加入由解旋酶与ATP底物组成的解旋酶水解ATP体系，反应后加入由孔雀石绿、钼酸铵、吐温-20等溶液混合制成的反应终止液，显色后测定生成的蓝色络合物在650nm下的吸光度，计算解旋酶水解ATP生成的正磷酸浓度并由此计算出解旋酶水解ATP活性。
在优选条件下，上述方法可加以优化：对于反应体系的优化在于解旋酶水解ATP体系中ATP浓度不大于500umol/L，且以500umol/L为优。对反应操作的优化在于加入反应液后，反应体系置于37℃水浴条件孵育10min。对于终止反应操作的优化在于步骤S2中，反应终止液加入量为反应终止液:反应体系(v/v)＝4:1。对于显色操作的优化在于步骤S3中反应体系置于37℃水浴条件孵育15min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)与现有技术采用放射性标记法测定解旋酶水解ATP活性法相比，本发明方法在测定过程中不使用放射性同位素，所使用均为常规常用化学试剂，无操作危险、无污染风险，安全性高；(2)由于不使用放射性元素，本发明方法无需放射性标记法中电泳分离的繁琐操作，不需要过夜曝光步骤，化学反应迅速，整个测定过程仅需半个小时，在保证测定精度的前提下大大节约了时间成本；(3)现有放射性测定法由于测量时间较长以及电泳胶孔数量的限制，而无法适用于批量样本的快速测定。而本发明可用于批量检测解旋酶ATP水解活性，效率大为提高；(4)本发明方法中不使用放射性元素材料，且测定仪器常规，降低了成本。
附图说明
图1是磷标准曲线。
图2是DnaB解旋酶的ATP水解活性。
图3是DnaG对DnaB的ATP水解活性的影响。
图4是ssDNA对DnaB的ATP水解活性的影响。
图5是反应液吸收光谱图。
图6是ATP-Na2浓度对吸光度的影响。
图7是解旋反应时间对吸光度的影响。
图8是显色时间对吸光度的影响。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
涉及使用的溶液、试剂、设备
反应液：100mmol/LTris-HCl、250mmol/LNaCl、50mmol/LMgCl2、25mmol/LDTT，混匀
溶液a：以3mol/L的浓硫酸为溶剂配制所得0.12‰(w/v)孔雀石绿溶液
溶液b：7.5％(w/v)钼酸铵溶液
溶液c：11％(v/v)吐温-20
反应终止液：溶液a:溶液b:溶液c(v/v)＝100:25:2的混合溶液，再加入溶液a、溶液b、溶液c总体积3倍量的去离子水，混匀。反应终止液仅可存放一天，每次使用需当天配制。
磷标准溶液：磷酸二氢钠溶液，浓度分别为50umol/L、100umol/L、150umol/L、200umol/L、250umol/L
解旋酶溶液：嗜热脂肪芽孢杆菌DnaB解旋酶(指代解旋酶六聚体)溶液
引物酶:DnaG引物酶
ATP溶液：500umol/LATP-Na2溶液
ssDNA溶液：ssDNA(即16bp的寡聚核苷酸T)溶液
多功能酶标仪：ThermoVaioskanFlash全波长多功能酶标仪
96孔板：Costar359996孔细胞培养板
实施例一
如图1～图2所示，采用本发明方法测定解旋酶水解ATP活性。
1、磷标准曲线的制作
分别量取5种浓度的磷酸二氢钠溶液各40uL，另以蒸馏水作为空白对照。各处理在37℃水浴条件下孵育10min，分别加入160ul反应终止液，混匀，37℃水浴条件下孵育15min，使用多功能酶标仪测定650nm处吸光度。
以测得的吸光度值(OD)为纵坐标，以磷酸二氢钠溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1：磷标准曲线)。经计算，磷标准曲线的回归方程为：y＝0.0037x-0.008，相关系数0.9991。表明溶液中的正磷酸浓度在0umol/L～250umol/L内与吸光度有着良好的相关性。
2、解旋酶水解ATP活性测定
配制反应体系：量取8uL反应液加入ATP溶液，混匀，加入解旋酶溶液，加入超纯水，分别配制成解旋酶浓度为5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L、20nmol/L、25nmol/L、30nmol/L的反应体系各40uL。
各反应体系分别于37℃水浴孵育10min，迅速置于冰上，分别加入160ul反应终止液，混匀，分别于37℃水浴孵育显色，显色时间15min。
显色后将反应体系转移至96孔板上，使用酶标仪测定各反应体系650nm处吸光度。
根据磷标准曲线方程计算各反应体系中解旋酶活性。解旋酶的ATP水解活性(s-1)指单位时间内单位摩尔数的解旋酶单体水解的ATP浓度。测定进行三次重复，结果稳定，数据再现性良好。以解旋酶浓度为横坐标，水解得到的正磷酸浓度为纵坐标，结果见图2(图2：DnaB解旋酶的ATP水解活性)。
图2同时表明，当反应体系中DnaB浓度为5nmol/L～30nmol/范围内时，随着DnaB浓度的增大，在10min内水解得到的磷酸根浓度程线性提高，测定数据灵敏度高。该结果与现有技术采用放射性同位素标记法测定结果相近(见参考文件1)。
实施例二
本发明方法在反应体系中存在引物酶DnaG时的测定效果。
配制40ul反应体系，其中反应液8uL，加入DnaB解旋酶溶液至反应体系中DnaB浓度10nmol/L，加入DnaG溶液至反应体系中DnaG浓度分别至0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L、40nmol/L、50nmol/L、60nmol/L、100nmol/L、150nmol/L，加入超纯水定容，形成各处理梯度浓度。反应体系分别于4℃静置1h，加入ATP-Na2溶液至反应体系中ATP-Na2浓度500umol/L；反应体系分别置于37℃水浴条件下孵育10min。反应终止和显色操作同实施例一。以引物酶DnaG浓度为横坐标，以反应速率为纵坐标绘制曲线，DnaG引物酶对解旋酶活性的影响如图3(图3：DnaG对DnaB的ATP水解活性的影响)。
图3显示，随着DnaG浓度的增大，解旋酶的ATP水解活性逐渐增大，当DnaG浓度达到约40nmol/L，随着引物酶浓度的提高，解旋酶的ATP水解活性的上升趋势逐渐减缓。
本测试例表明，当另外一个蛋白(引物酶DnaG)存在时，采用本发明方法测定显示解旋酶水解ATP活性提高。该测定结果与现有技术中测定结论相一致(见参考文件2～4)，进一步说明本方法可用于解旋酶水解ATP活性的测试。
实施例三
本发明方法在反应体系中存在ssDNA时的测定效果。
配制40ul反应体系，其中反应液8uL，加入DnaB解旋酶溶液至反应体系中DnaB浓度10nmol/L，加入ssDNA溶液至反应体系中ssDNA浓度分别为0.5umol/L、1umol/L、1.5umol/L、2.5umol/L、12.5umol/L、25umol/L，加入超纯水定容，形成各处理的梯度浓度。
反应体系分别于4℃静置1h，加入ATP-Na2溶液至反应体系中ATP-Na2浓度为500umol/L；反应体系分别置于37℃水浴条件下孵育10min。反应终止和显色步骤同实施例一。以ssDNA浓度((dT)16)为横坐标，以反应速率为纵坐标绘制曲线，ssDNA浓度对解旋酶活性的影响如图4(图4：ssDNA对DnaB的ATP水解活性的影响)。
图4显示，当ssDNA浓度小于2.5umol/L时，随着ssDNA浓度的增大，解旋酶的ATP水解活性显著增高，当ssDNA浓度达到2.5umol/L后，解旋酶的ATP水解活性随ssDNA浓度提高不再增大，呈平稳趋势。
本测试例表明，当反应体系中存在ssDNA时，采用本发明方法测定显示解旋酶水解ATP活性提高。该测定结果与现有技术中测定结论相一致(见参考文件2)，进一步说明本方法可用于解旋酶水解ATP活性的测试。
测试例一
吸收波长的优化选择。
配制200umol/L磷酸二氢钠溶液40uL，置于37℃条件下水浴孵育10min，加入160ul反应终止液，混匀，于37℃水浴孵育显色15min。用酶标仪扫描550nm～750nm波长下的吸光度。以测得的吸光度值(OD)为纵坐标，以扫描波长为横坐标，绘制反应液吸收光谱扫描曲线图见图5(图5：反应液吸收光谱图)。
图5显示，反应液在650nm吸收波长下OD值最大，显色灵敏度最高。
测试例二
ATP底物(ATP-Na2)浓度的优化选择(检测ATP底物自身，即未加入解旋酶情况下的水解情况)。
在测定过程中，ATP-Na2本身存在着少量的水解，产生背景影响测量结果，需要选择合适的ATP-Na2浓度。
配制40uLATP-Na2溶液，浓度分别为125umol/L、250umol/L、375umol/L、500umol/L、625umol/L、875umol/L、1125umol/L、1500umol/L、1875umol/L，分别置于37℃下水浴孵育10min，迅速置于冰上，加入160ul反应终止液，混匀，分别于37℃水浴孵育显色15min。用多功能酶标仪扫描650nm波长下的吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，结果如图6(图6：ATP-Na2浓度对吸光度的影响)。
图6显示，反应体系中ATP浓度在125umol/L～500umol/L范围内时，ATP-Na2自身水解得到的磷酸不足以影响吸光度；当ATP浓度大于500umol/L时，吸光度随着ATP浓度的提高呈近正比上升。底物浓度过大会产生一定的吸收值干扰实验结果，但底物浓度过小不足以使酶反应达到饱和。由此确定本发明测定方法中，反应体系中ATP度物浓度500umol/L为优化测定条件。
测试例三
解旋酶反应时间的优化选择。
解旋酶水解ATP的反应时间是影响效率的一个重要因素，反应时间过短容易造成操作误差大，反之则会限制测定进度。
以超纯水配制40uL反应体系，其中反应液8uL，解旋酶浓度20nmol/L，ATP-Na2浓度500umol/L。反应体系于37℃水浴孵育，孵育时间分别为2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、18min、22min，其余操作同测试例二。以反应时间为横坐标，吸收值为纵坐标，绘制曲线如图7(图7：解旋反应时间对吸光度的影响)。
图7显示，在该反应条件下，解旋酶的反应时间在22min内的测量范围内衰减较为缓慢，为了确保较高的实验效率，同时操作误差的影响降到最低，确定10min作为最佳反应时间。
测试例四
显色时间的优化选择。
反应终止液(即显色液)与解旋酶水解ATP得到的正磷酸反应形成络合物并不是在短时间内完成的，需要一定的反应时间，设计实验以确定完全显色需要的最小时间。
配制同测试例三的反应体系40uL。反应体系置于37℃下水浴孵育10min，迅速置于冰上，加入160ul反应终止液，混匀，分别于37℃水浴孵育显色。用多功能酶标仪在650nm波长下分别测定显色时间为1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、12min、14min、18min、22min、26min时的吸收值。以反应时间为横坐标，吸收值为纵坐标绘图，结果如图8(图8：显色时间对吸光度的影响)。
图8显示，当显色时间小于10min时，OD随着显色时间的延长迅速提高；当显色时间在10min～15min质检时，曲线呈平缓上升趋势；当显色时间大于15min后，曲线几乎不再上升，表示此时反应已达到饱和。因此，选择15min作为显色时间。
参考文件：
1.Bird,L.E.,etal.,Mappingprotein-proteininteractionswithinastablecomplexofDNAprimaseandDnaBhelicasefromBacillusstearothermophilus.Biochemistry,2000.39(1):p.171-82.
2.Soultanas,P.andD.B.Wigley,Site-directedmutagenesisrevealsrolesforconservedaminoacidresiduesinthehexamericDNAhelicaseDnaBfromBacillusstearothermophilus.NucleicAcidsRes,2002.30(18):p.4051-60.
3.Thirlway,J.,etal.,DnaGinteractswithalinkerregionthatjoinstheN-andC-domainsofDnaBandinducestheformationof3-foldsymmetricrings.NucleicAcidsRes,2004.32(10):p.2977-86.
4.Chintakayala,K.,etal.,ConservedresiduesoftheC-terminalp16domainofprimaseareinvolvedinmodulatingtheactivityofthebacterialprimosome.MolMicrobiol,2008.68(2):p.360-71.

Claims (10)

1.解旋酶水解ATP活性测定方法，用于测定解旋酶对ATP的水解活性，其特征在于：依照如下步骤实施：
步骤S1、解旋酶水解ATP液中加入反应液进行反应
向解旋酶水解ATP液中加入反应液混合均匀制成反应体系，反应体系于37℃水浴孵育不低于10min；
所述解旋酶水解ATP液包括解旋酶与ATP底物；
所述反应液是100mmol/LTris-HCl、250mmol/LNaCl、50mmol/LMgCl2、25mmol/LDTT的混合溶液；
步骤S2、终止反应
将反应体系迅速置于冰上，向其中加入反应终止液，混匀，终止反应；
所述反应终止液是溶液a:溶液b:溶液c(v/v)＝100:25:2的混合溶液再加入溶液a、溶液b、溶液c总体积3倍量的去离子水混合均匀；
所述溶液a是以3mol/L的浓硫酸为溶剂配制所得的0.12‰(w/v)孔雀石绿溶液，
所述溶液b是7.5％(w/v)钼酸铵溶液，
所述溶液c是11％(v/v)吐温-20；
步骤S3、显色
反应体系置于37℃水浴，孵育不低于15min；
步骤S4、测定吸光度计算活性
在650nm下测定吸光度，根据反应生成的蓝色络合物在在650nm下吸光度与标准曲线的关系计算活性。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，反应体系中ATP浓度不大于500umol/L。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，反应体系中ATP浓度是500umol/L。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述ATP底物是ATP-Na2。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中，37℃水浴孵育10min。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S2中，反应终止液加入量为反应终止液:反应体系(v/v)＝4:1。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S3中，反应体系置37℃水浴孵育15min。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤S3中，显色时间15min。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述解旋酶是嗜热脂肪芽孢杆菌DnaB解旋酶。
10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述反应体系还包括ssDNA溶液。
CN201510443439.6A 2015-07-24 2015-07-24 解旋酶水解atp活性测定方法 Pending CN105067814A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510443439.6A CN105067814A (zh) 2015-07-24 2015-07-24 解旋酶水解atp活性测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510443439.6A CN105067814A (zh) 2015-07-24 2015-07-24 解旋酶水解atp活性测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105067814A true CN105067814A (zh) 2015-11-18

Family

ID=54497235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510443439.6A Pending CN105067814A (zh) 2015-07-24 2015-07-24 解旋酶水解atp活性测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105067814A (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1308622A (zh) * 1998-05-12 2001-08-15 美国家用产品公司 用于治疗胰岛素抗性和高血糖的联苯基氧代－乙酸
CN1634953A (zh) * 2003-12-26 2005-07-06 山西省风陵渡开发区众力投资发展有限公司 治疗糖尿病及糖尿病并发症的药物、制备方法及其新用途
WO2006087543A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Astrazeneca Ab Antibacterial piperidine derivatives
WO2006092599A2 (en) * 2005-03-04 2006-09-08 Astrazeneca Ab Pyrrole derivatives as dna gyrase and topoisomerase inhibitors
US20080132546A1 (en) * 2006-12-04 2008-06-05 Astrazeneca Ab Chemical compounds
CN101612312A (zh) * 2008-06-25 2009-12-30 河北以岭医药研究院有限公司 一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用
CN101845480A (zh) * 2009-11-26 2010-09-29 大连医科大学 高通量筛选结核分枝杆菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶抑制剂的方法
CN102105469A (zh) * 2008-06-04 2011-06-22 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于治疗细菌感染的杂环脲衍生物
CN102304500A (zh) * 2011-08-26 2012-01-04 昆明理工大学 噬菌体tsp4 dna解旋酶和编码这种解旋酶的多核苷酸
CN102317286A (zh) * 2008-12-12 2012-01-11 阿斯利康(瑞典)有限公司 抗细菌感染的2-(哌啶-1-基)-4-杂环基-噻唑-5-甲酸衍生物
CN102448953A (zh) * 2009-03-26 2012-05-09 武田药品工业株式会社 吡唑化合物
CN103920151A (zh) * 2014-04-25 2014-07-16 锦州博泽医药科技开发有限公司 一种治疗糖尿病慢性并发症的组合物

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1308622A (zh) * 1998-05-12 2001-08-15 美国家用产品公司 用于治疗胰岛素抗性和高血糖的联苯基氧代－乙酸
CN1634953A (zh) * 2003-12-26 2005-07-06 山西省风陵渡开发区众力投资发展有限公司 治疗糖尿病及糖尿病并发症的药物、制备方法及其新用途
WO2006087543A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Astrazeneca Ab Antibacterial piperidine derivatives
WO2006092599A2 (en) * 2005-03-04 2006-09-08 Astrazeneca Ab Pyrrole derivatives as dna gyrase and topoisomerase inhibitors
US20080132546A1 (en) * 2006-12-04 2008-06-05 Astrazeneca Ab Chemical compounds
CN102105469A (zh) * 2008-06-04 2011-06-22 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于治疗细菌感染的杂环脲衍生物
CN101612312A (zh) * 2008-06-25 2009-12-30 河北以岭医药研究院有限公司 一种中药组合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用
CN102317286A (zh) * 2008-12-12 2012-01-11 阿斯利康(瑞典)有限公司 抗细菌感染的2-(哌啶-1-基)-4-杂环基-噻唑-5-甲酸衍生物
CN102448953A (zh) * 2009-03-26 2012-05-09 武田药品工业株式会社 吡唑化合物
CN101845480A (zh) * 2009-11-26 2010-09-29 大连医科大学 高通量筛选结核分枝杆菌α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶抑制剂的方法
CN102304500A (zh) * 2011-08-26 2012-01-04 昆明理工大学 噬菌体tsp4 dna解旋酶和编码这种解旋酶的多核苷酸
CN103920151A (zh) * 2014-04-25 2014-07-16 锦州博泽医药科技开发有限公司 一种治疗糖尿病慢性并发症的组合物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENNY THIRLWAY 等: "DnaG interacts with a linker region that joins the N- and C-domains of DnaB and induces the formation of 3-fold symmetric rings", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
KIRAN CHINTAKAYALA 等: "Conserved residues of the C-terminal p16 domain of primase are involved in modulating the activity of the bacterial primosome", 《MOL MICROBIOL. 》 *
P. SOULTANAS AND D. B. WIGLEY: "Site-directed mutagenesis reveals roles for conserved amino acid residues in the hexameric DNA helicase DnaB from Bacillus stearothermophilus", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
徐友涵 等: "一种简便、灵敏的ATPase活性测定法", 《生物化学与生物物理进展》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kemp et al. Physical organic chemistry of benzisoxazoles. II. Linearity of the Broensted free energy relation for the base-catalyzed decomposition of benzisoxazoles
CN102879345B (zh) 一种测定硅钒铁的磷含量的方法
Hammett The theory of acidity
CN101846651A (zh) 一种微波消解-icp-ms测定化妆品中硼酸和硼酸盐的方法
CN105092496B (zh) 一种氮化增强剂中磷含量的检测方法
CN109612989A (zh) 混凝土碳化深度测量试剂及其制备和应用方法
Baum Determination of acetylcholinesterase by an organic substrate selective electrode
Zheng et al. Flow-injection chemiluminescence determination of tetracyclines with in situ electrogenerated bromine as the oxidant
Moon et al. Kinetics of the Reaction of α-Chymotrypsin with Diisopropyl Fluorophosphate, with Measurements of Hydrogen Ion Release, Enzyme Inhibition, and Spectral Changes of Enzyme at 290 mµ
CN106248609B (zh) 一种紫外分光光度计测定锂离子电池电解液中六氟磷酸锂含量的方法
CN104764735A (zh) 一种分析铬铁中磷的方法
CN105067814A (zh) 解旋酶水解atp活性测定方法
CN104048924A (zh) 一种二维、高分辨测定湿地土壤和沉积物中活性磷分布的方法
CN113884452A (zh) 一种工业循环冷却水用阻垢缓蚀剂中总磷含量的检测方法
CN111829999B (zh) 钙钛矿荧光微球和多巴胺体系的应用方法
CN112176040A (zh) 一种快速测定dna聚合酶活性的方法
Fogg et al. Static and flow injection voltammetric determinations of total phosphate and soluble silicate in commercial washing powders at a glassy carbon electrode
CN100554939C (zh) 血清钠离子酶法测定试剂及方法
CN107449744B (zh) 一种检测纺织印染行业中过氧化氢酶活力的分析方法
Manoukian et al. Extraction processes reduce polyphosphate ion migration, dispersion and diffusion as detected with gel electrophoresis and 31P DOSY NMR
CN105527280A (zh) Lgb-hrp定量注射检测水中二氧化氯和亚氯酸盐浓度的方法
Veit et al. Measuring in vitro ATPase activity with high sensitivity using radiolabeled ATP
LeBlanc Polarographic Determination of N, N´-Ethylenediglycine and Nitrilotriacetic Acid in (Ethylenedinitrilo)-tetracetic Acid
CN110108685A (zh) 利用石墨烯量子点作为荧光探针检测碱性磷酸酶浓度的方法
CN102288599A (zh) 一种总磷与化学需氧量cod的联合比色测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151118