CN105067809A - 用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒，以及其制备方法。本发明利用抗原抗体反应，使抗原或二抗固相化于硝酸纤维素膜上；当血清标本由于渗滤作用通过硝酸纤维素膜时，其中的病原体IgM（IgG）抗体便与膜上相应的固相抗原或二抗发生特异性结合形成复合物，而其他无关物质则被滤过，再加上酶标抗体或酶标抗原，滤过时便与膜上的抗原抗体复合物结合，然后加入显色液显色产生肉眼即可方便观察的紫色印迹。本发明检测过程用时较短，灵敏度较高，准确度较强，采用本发明制得的稳定稀释缓冲液与显色液，可以使试剂盒保存期达到12个月以上，且整个检测的操作过程简单快速、无需专门仪器设备，灵敏度与准确度较高。

Description

用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法、检测用的试剂盒，以及其制备方法。
背景技术
目前用于抗体检测的方法主要有胶体金法、免疫层析法、荧光PCR法、免疫荧光法或间接免疫荧光法、酶联免疫斑点法。胶体金法是一种常见的标记技术，它是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，对抗原抗体进行定性及半定量研究的标记技术，因其具有操作快速简便、特异敏感、稳定性强、价格低廉等优点，已在临床检验和其他领域取得广泛的应用，但是胶体金法只能进行定性或半定量检测，准确性较差，容易漏检弱阳性样本。免疫层析法是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断，免疫层析法虽然操作简单，不需要特殊的仪器设备，但是层析材料的选择和处理比较困难。荧光PCR法是比较定性、规范的一种方法，比较容易判断，但是该方法敏感性差，较易出现假阳性的现象；免疫荧光法或间接免疫荧光法虽然其检测特异性强、敏感性高、速度快但是其需要价格昂贵的免疫荧光显微镜，工作人员需具有一定的经验，技术程序也还比较复杂；酶联免疫斑点法是基于ELISA试验发展起来的,即可从单细胞水平检测抗体分泌细胞,又可以检测分泌量的一种细胞免疫学检测技术，其原理是用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来，酶联免疫斑点法虽然检测灵敏度较高，但是其操作费时，需要严密控制试验条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够快速检测一项或多项病原体抗体的方法，利用本方法所制备的试剂盒，方法简便，用时较短，检测高效准确，不易出现漏检情况，还能消除干扰因素对检测结果的假阳性干扰，并能使酶标抗体的过程更加快速高效，同时延长试剂盒的有效期。
为解决上述技术问题，本发明方法的技术方案是：利用抗原抗体反应，使抗原或二抗固相化于硝酸纤维素膜上，当血清标本由于渗滤作用通过硝酸纤维素膜时，其中的病原体IgM（IgG）抗体便与膜上相应的固相抗原或二抗发生特异性结合形成复合物，而其他无关物质则被滤过，再加上酶标抗体或酶标抗原，滤过时便与膜上的抗原抗体复合物结合，然后加入显色液显色产生肉眼即可方便观察的紫色印迹。
其中，所述酶标抗体或酶标抗原工作液的配制方法分为两部分，包括酶标抗体或酶标抗原的配制方法，及酶标抗体或酶标抗原的稳定稀释缓冲液的配制方法；
所述酶标抗体或酶标抗原的配制方法，采用以下步骤制备：
（1）将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；
（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；
（3）将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；
（4）加入1mg左右的抗体或抗原溶液，并于室温下反应25～35min；
（5）使步骤（4）制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标抗体或抗原溶液；
所述酶标抗体或抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：
褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，高速离心后取上清液，即制得褐藻乙醇提取物；
酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02-0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt%海藻糖、0.01～0.07wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。
优选的，所述洗涤液的配置方法为，在配置成0.01M的Tris-HCl缓冲液中加入5.0g曲拉通X-100、0.2gNaCl、0.2gNaN3和一定量的BSA，加水至1000ml，振荡均匀即为所需的洗涤液。
优选的，所述显色液包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系。
优选的，所述显色液采用如下方法制得：
将8.3～8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；
再将0.8～0.83g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；
将上述两种溶液混合，振荡混匀；
分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.4～0.6g过氧化脲加入到步骤所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。
用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒，包括设在试剂盒内的检测板下底，检测板下底上方为吸水垫，吸水垫上方为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上方为检测板上盖，检测板上盖上设有加样孔。
制备所述用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒，采用以下步骤：
采用如权利要求3所述方法制备辣根过氧化物酶标记物溶液；
制备包被膜：选用适合孔径的包被膜，裁成方片备用；
组装检测盒：将盒盖、包被膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒；
⑷包被：用添加了3wt%海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液稀释离心后的抗原或抗体在包被膜的检测点位置分别包被，质控点位置包被一种与酶标记物可反应的抗体；
⑸干燥：检测盒在湿度10%～40%的环境下室温干燥1小时；
包装：干燥后的检测盒用铝箔带包装，并在袋内放置干燥剂，封口。
采用上述技术方案后，该发明的有益之处是：本发明方法使用的酶标抗体工作液的优势：a、利用辣根过氧化物酶作为标记物，其具有较高活性、耐受pH范围较宽，且可以长期保存备用。b、使用的酶标抗体工作液，很大程度上消除了样本中类风湿因子等干扰因素对结果的假阳性干扰，同时大大降低了试剂盒的抗体成本。
进一步的，本发明的显色液中的A、B组分（即过氧化物与生色物TMB）可长期共存同一体系中，检测时无需临时混匀，直接添加即可，简化了试剂盒检测步骤并节约了成本。
更进一步的，其中使用的酶标抗体稀释液，利用经设计筛选并验证了可使酶标抗体长期稳定的保护性稀释缓冲液组分，相比较目前现有的公开配方，该体系组分含动物源物质较少，且各成分间不会发生生化反应，能最大限度发挥对酶标记物的保护与稳定作用；c、而且酶标抗体保护剂可使酶标记物常温下或2-8℃稳定较长时间（14个月），加速破坏试验证明可于37℃稳定至少9天，理论上也可用于其它酶标记物的长期稳定性保存。
综上所述，本发明方法具有以下优点：a、本发明方法所述某一项病原体抗体检测试剂盒不易受类风湿因子等干扰因素的干扰，假阳性率较低；b、以结合高灵敏度酶标记物为特征实现对某一项病原体IgM/IgG抗体的快速准确检测；c、本发明方法制备的试剂盒可以进行一项甚至多项快速同时检测，如利用本发明方法制备的进行多项检测的试剂盒——TORCH计生五项（Tox-IgM/IgG、CMV-IgM/IgG、RV-IgG）快速酶免检测芯片（酶免渗滤法），可以同时对Tox-IgM、Tox-IgG、CMV-IgM、CMV-IgG、RV-IgG五项进行检测，且检测过程用时较短，灵敏度较高，准确度较强。d、采用本发明制得的稳定稀释缓冲液与显色液，可以使试剂盒保存期达到12个月以上。e、整个检测的操作过程简单快速、无需专门仪器设备，灵敏度与准确度较高，可用于医院诊所、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断研究。该方法准确率高，特异性强，检测结果可靠，检测过程用时较短。
附图说明
图1是一种快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒的结构示意图。
图中，1检测板下底，2吸水垫，3硝酸纤维素膜，4检测板上盖，5加样孔。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明方法的技术方案是：利用抗原抗体反应，使抗原或二抗固相化于硝酸纤维素膜上，当血清标本由于渗滤作用通过硝酸纤维素膜时，其中的病原体IgM（IgG）抗体便与膜上相应的固相抗原或二抗发生特异性结合形成复合物，而其他无关物质则被滤过，再加上酶标抗体或酶标抗原，滤过时便与膜上的抗原抗体复合物结合，然后加入显色液显色产生肉眼即可方便观察的紫色印迹。
上述技术方案所涉及到相关的检测试剂为：酶标抗体或酶标抗原工作液、洗涤液、显色液、终止液。液体的配制方法如下：
1.1酶标抗体或酶标抗原工作液。配制方法分为两部分：
（1）将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；
（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；
（3）将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；
（4）加入1mg左右的抗体或抗原溶液，并于室温下反应25～35min；
（5）使步骤（4）制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标抗体或抗原溶液。
所述酶标抗体或抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：
褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，高速离心后取上清液，即制得褐藻乙醇提取物。
酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02-0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt%海藻糖、0.01～0.07wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。
1.2洗涤液。
其配制方法为：在配置成0.01M的Tris-HCl缓冲液中加入5.0g曲拉通X-100、0.2gNaCl、0.2gNaN3和一定量的BSA，加水至1000ml，振荡均匀即为所需的洗涤液。
1.3显色液。
配置试剂：四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系。
配置方法：
将8.3～8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；
再将0.8～0.83g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；
将上述两种溶液混合，振荡混匀；
分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.4～0.6g过氧化脲加入到步骤（3）所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。
1.4终止液。
所述终止液配制方法为0.5M柠檬酸。
本发明还提供上述使用的试剂盒的制备及使用方法；如图1所示，用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒，包括设在试剂盒内的检测板下底1，检测板下底1上方为吸水垫2，吸水垫2上方为硝酸纤维素膜3，硝酸纤维素膜3上方为检测板上盖4，检测板上盖4上设有加样孔5。
试剂盒的制备方法包括以下步骤：
采用如1.1所述方法制备辣根过氧化物酶标记物溶液；
制备包被膜：选用适合孔径的包被膜，裁成方片备用；
组装检测盒：将盒盖、包被膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒。
包被：用添加了3wt%海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液稀释离心后的抗原或抗体在包被膜的检测点位置分别包被，质控点位置包被一种与酶标记物可反应的抗体。
干燥：检测盒在湿度10%～40%的环境下室温干燥1小时；
包装：干燥后的检测盒用铝箔带包装，并在袋内放置干燥剂，封口。
2.本发明中所述的某一种病原体抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）组成为：检测板、酶标液、洗涤液、显色液、终止液。将以上检测盒与液体成分瓶及说明书以合理形式组装，即为某一种病原体抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）。
上述试剂盒的使用方法：
(1)取出试剂盒，室温平衡20～30分钟；　(2)准备待测血清；(3)室温平衡后滴加洗涤液于反应区中，待液体将膜完全湿润；(4)滴加待测样本于反应区中，待液体充分吸入；(5)滴加酶标液于反应区中，待液体充分吸入；(6)滴加洗涤液于反应区中，待液体充分吸入；(7)滴加显色液于反应区中，待液体充分吸入后等待3分钟；(8)滴加终止液于反应区中，待液体充分吸入后于3分钟内观察结果。
使用上述的试剂盒，显示结果判断方法如下：
(1)阴性——质控区C位置显示紫色印迹，检测区无紫色印迹出现；
(2)阳性——质控区C位置显示紫色印迹，检测区有紫色印迹出现；
(3)无效——质控区C位置不显色即表明操作失误或试剂失效。
3.试剂盒的检测实例：
按照本发明方法可制备多种单项检测试剂盒，例如肺炎支原体（MP）IgG抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）、肺炎支原体（MP）IgM抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）、肺炎衣原体（Cpn）IgG抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）、肺炎衣原体（Cpn）IgM抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）、结核杆菌（TB）IgG抗体快速酶免检测芯片（酶免渗滤法），将这几种与国内已取得注册证试剂盒进行检测对比：
（1）按照以上检测方式，采用已在国内取得注册证的肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中肺炎支原体（MP）IgG抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表1本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果
。
试验表明，本方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。肺炎支原体IgG考核试剂的假阳性率为0.7%，对照试剂盒的假阳性率为1.3%。结果显示，本方法制备试剂盒肺炎支原体（MP）IgG抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）的特异性要优于对照试剂盒。
（2）按照以上检测方式，采用已在国内取得注册证的肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法）作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中肺炎支原体（MP）IgM抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表2本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果
。
试验表明，本方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。肺炎支原体IgM考核试剂的假阳性率为0.3%，对照试剂盒的假阳性率为1.8%。结果显示，本方法制备试剂盒肺炎支原体(MP)IgM抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）的特异性要优于对照试剂盒。
（3）按照以上检测方式，采用已在国内取得注册证的肺炎衣原体IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中肺炎衣原体（Cpn）IgG抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表3本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果
。
试验表明，本方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。肺炎衣原体IgG考核试剂的假阳性率为0.7%，对照试剂盒的假阳性率为1.3%。结果显示，本方法制备试剂盒肺炎衣原体(Cpn)IgG抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）的特异性要优于对照试剂盒。
（4）按照以上检测方式，采用在国内取得注册证的抗肺炎衣原体抗体IgM检测试剂盒（酶联免疫吸附法）作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中肺炎衣原体（Cpn）IgM抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表4本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果
。
试验表明，本方法制备方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。肺炎衣原体IgM考核试剂的假阳性率为0.4%，对照试剂盒的假阳性率为2.3%。结果显示，本方法制备试剂盒肺炎衣原体（Cpn）IgM抗体检测试剂盒（酶免渗滤法）的特异性要优于对照试剂盒。
（5）按照以上检测方式，采用在国内取得注册证的结核杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中结核杆菌（TB）IgG抗体快速酶免检测芯片（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表5本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果
。
试验表明，本方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。结核杆菌IgG考核试剂的假阳性率为0.3%，对照试剂盒的假阳性率为1.8%。结果显示，本方法制备试剂盒结核杆菌（TB）IgG抗体快速酶免检测芯片（酶免渗滤法）的特异性要优于对照试剂盒。
按照本发明方法还可制备多项检测试剂盒，例如TORCH计生五项（Tox-IgM/IgG、CMV-IgM/IgG、RV-IgG）快速酶免检测芯片（酶免渗滤法）、七项呼吸道病原体（MP、Cpn、RSV、Adv、PFV、FLU-A、FLU-B）IgM抗体快速酶免检测芯片（酶免渗滤法），将其与在国内取得注册证试剂盒进行检测对比：
（1）按照以上检测方式，采用在国内取得注册证的弓形虫IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法）、弓形虫抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）、人类巨细胞病毒IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法）、人类巨细胞病毒抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）、风疹病毒抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中TORCH计生五项（Tox-IgM/IgG、CMV-IgM/IgG、RV-IgG）快速酶免检测芯片（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表6本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果--Tox-IgM
。
表7本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果--Tox-IgG
。
表8本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果--CMV-IgM
。
表9本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果--CMV-IgG
。
表10本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果--RV-IgG
。
试验表明，本方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。Tox-IgM考核试剂的假阳性率为0.5%，对照试剂盒的假阳性率为1.8%；Tox-IgG考核试剂的假阳性率为0.4%，对照试剂盒的假阳性率为1.6%；CMVIgM考核试剂的假阳性率为0.1%，对照试剂盒的假阳性率为1.6%；CMVIgG考核试剂的假阳性率为0.6%，对照试剂盒的假阳性率为1.4%；RVIgG考核试剂的假阳性率为0.6%，对照试剂盒的假阳性率为1.9%。结果显示，本方法制备试剂盒TORCH计生五项（Tox-IgM/IgG、CMV-IgM/IgG、RV-IgG）快速酶免检测芯片（酶免渗滤法）的特异性要优于对照试剂盒。
（2）按照以上检测方式，采用在国内取得注册证的呼吸道病原体谱抗体IgM检测试剂盒（间接免疫荧光法）作为对照试剂盒，与本发明方法制备试剂盒中七项呼吸道病原体（MP、Cpn、RSV、Adv、PFV、FLU-A、FLU-B）IgM抗体快速酶免检测芯片（酶免渗滤法）同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，检测结果如下：
表11本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-MP
。
表12本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-Cpn
。
表13本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-RSV
。
表14本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-Adv
。
表15本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-PFV
。
表16本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-FLU-A
。
表17本发明方法制备试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果-FLU-B
。
试验表明，本方法制备试剂盒的灵敏度较高，且与对照试剂盒无显著差别。MPIgM考核试剂的假阳性率为0.5%，对照试剂盒的假阳性率为1.5%；CpnIgM考核试剂的假阳性率为0.4%，对照试剂盒的假阳性率为0.2%；RSVIgM考核试剂的假阳性率为0.7%，对照试剂盒的假阳性率为0.3%；AdvIgM考核试剂的假阳性率为0.2%，对照试剂盒的假阳性率为0.8%；PFVIgM考核试剂的假阳性率为0.3%，对照试剂盒的假阳性率为0.7%；FLU-AIgM考核试剂的假阳性率为0.3%，对照试剂盒的假阳性率为0.6%；FLU-BIgM考核试剂的假阳性率为0.3%，对照试剂盒的假阳性率为0.7%。故而本方法制备试剂盒的特异性要优于对照试剂盒。
因此通过检测结果可以看出，按照以上检测技术方案，利用本发明方法制备的某一种病原体抗体检测试剂盒检测从相关医院获得的阴阳性血清，检测结果通过与已在国内取得注册证的相关检测试剂盒检测结果作为对照，比较本发明方法制备的试剂盒与对照试剂盒的特异性，结果显示，本发明方法制备试剂盒特异性优于对照试剂盒。
本发明方法制备试剂盒稳定性研究:将检测试剂盒（选取连续三批）置于37℃放置9天，并每天进行检测；将检测试剂盒置于常规性（2~8℃）放置14个月，并定期进行检测，检测标准如下：
(1)物理检测：包装盒整洁，批号、有效期内容正确，内部组分齐全，数量正确；装入的检测板外观应平整洁净、装配严密，检测孔内膜片应无划痕、破损和污点；外包装铝箔袋封口整齐、严密，内容正确；各种液体瓶盖拧紧无泄漏，标签粘贴牢固。
(2)特异性：用10份阴性参考品进行检测，结果应均为阴性（阴性符合率：10/10）。
(3)准确性：用10份阳性参考品进行检测，结果应均为阳性（阳性符合率：10/10）。
试剂盒稳定性检测结果如下表所示（+为阳性；--—为阴性）
表1937℃放置9天加速试验检测结果
。
表2014个月常规性放置（2~8℃）实验检测结果
。
结果显示：连续三批（100601、100701、100801）的试剂盒，37℃放置9天及2~8℃放置14个月期间，物理检测均符合要求；阴性质控品检测结果全呈阴性、阳性质控品检测结果全部呈阳性，各项性能指标基本没有发生变化，可满足临床检验要求。
本发明方法采用的是酶联免疫渗滤法，该方法准确率高，特异性强，检测结果可靠，检测过程用时较短。与现有技术相比，该发明操作简单，方便快捷，大大节省了时间，检测结果显而易见，检测结果不受干扰因素的影响。
本发明方法使用的酶标抗体工作液的优势：a、利用辣根过氧化物酶作为标记物，其具有较高活性、耐受pH范围较宽，且可以长期保存备用。b、使用的酶标记物工作液，很大程度上消除了样本中类风湿因子等干扰因素对结果的假阳性干扰，同时大大降低了试剂盒的抗体成本：其中使用的酶标记物稀释液，利用经设计筛选并验证了可使酶标记物长期稳定的保护性稀释缓冲液组分，相比较目前现有的公开配方，该体系组分含动物源物质较少，且各成分间不会发生生化反应，能最大限度发挥对酶标记物的保护与稳定作用；c、而且酶标记物保护剂可使酶标记物常温下或2-8℃稳定较长时间（14个月），加速破坏试验证明可于37℃稳定至少9天，理论上也可用于其它酶标记物的长期稳定性保存。
本发明方法中使用的显色液优势：该显色液中的A、B组分（即过氧化物与生色物TMB）可长期共存同一体系中，检测时无需临时混匀，直接添加即可，简化了试剂盒检测步骤并节约了成本。
本发明方法具有以下优点：a、本发明方法所述某一项病原体抗体检测试剂盒不易受类风湿因子等干扰因素的干扰，假阳性率较低；b、以结合高灵敏度酶标记小鼠抗人IgM（IgG）单克隆抗体为特征实现对某一项病原体IgM/IgG抗体的快速准确检测；c、本发明方法制备的试剂盒可以进行一项甚至多项快速同时检测，如利用本发明方法制备的进行多项检测的试剂盒——TORCH计生五项（Tox-IgM/IgG、CMV-IgM/IgG、RV-IgG）快速酶免检测芯片（酶免渗滤法），可以同时对Tox-IgM、Tox-IgG、CMV-IgM、CMV-IgG、RV-IgG五项进行检测，且检测过程用时较短，灵敏度较高，准确度较强。d、采用本发明制得的稳定稀释缓冲液与显色液，可以使试剂盒保存期达到12个月以上。e、整个检测的操作过程简单快速、无需专门仪器设备，灵敏度与准确度较高，可用于医院诊所、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断研究。

Claims (9)

1.一种用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是，检测方法如下：
（1）加入待检血清标本，使待检血清标本通过膜；
（2）病原体IgM（IgG）抗体与膜上相应的固相抗原或二抗发生特异性结合形成复合物，加入洗涤液，其他无关物质则被滤过；
（3）加上酶标抗体或酶标抗原工作液，滤过时便与膜上的抗原抗体复合物结合；
（4）加入显色液显色；
（5）加入终止液，进行结果判读。
2.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。
3.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：步骤（3）中所使用的酶标抗体或酶标抗原工作液的配制方法分为两部分，包括酶标抗体或酶标抗原的配制方法，及酶标抗体或酶标抗原的稳定稀释缓冲液的配制方法；
所述酶标抗体或酶标抗原的配制方法，采用以下步骤制备：
⑴将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；
⑵将步骤⑴制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；
⑶将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；
⑷加入1mg左右的抗体或抗原溶液，并于室温下反应25～35min；
⑸使步骤⑷制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标抗体或抗原溶液；
所述酶标抗体或抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：
⑴褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，高速离心后取上清液，即制得褐藻乙醇提取物；
⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02-0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt%海藻糖、0.01～0.07wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。
4.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述洗涤液的配置方法为，在配置成0.01M的Tris-HCl缓冲液中加入5.0g曲拉通X-100、0.2gNaCl、0.2gNaN3和一定量的BSA，加水至1000ml，振荡均匀即为所需的洗涤液。
5.根据权利要求1所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述显色液包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系。
6.根据权利要求5所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法，其特征是：所述显色液采用如下方法制得：
将8.3～8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；
再将0.8～0.83g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；
将上述两种溶液混合，振荡混匀；
分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.4～0.6g过氧化脲加入到步骤所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。
7.用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒，其特征是：包括设在试剂盒内的检测板下底（1），检测板下底（1）上方为吸水垫（2），吸水垫（2）上方为硝酸纤维素膜（3），硝酸纤维素膜（3）上方为检测板上盖（4），检测板上盖（4）上设有加样孔（5）。
8.制备如权利要求7所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒的方法，其特征在于，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
采用如权利要求3所述方法制备辣根过氧化物酶标记物溶液；
制备包被膜：选用适合孔径的包被膜，裁成方片备用；
组装检测盒：将盒盖、包被膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒；
⑷包被：用添加了3wt%海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液稀释离心后的抗原或抗体在包被膜的检测点位置分别包被，质控点位置包被一种与酶标记物可反应的抗体；
⑸干燥：检测盒在湿度10%～40%的环境下室温干燥1小时；
包装：干燥后的检测盒用铝箔带包装，并在袋内放置干燥剂，封口。
9.使用如权利要求7所述的用于快速检测病原体抗体的酶免渗滤法的试剂盒的方法，其特征是：使用方法如下：
(1)取出试剂盒，室温平衡20～30分钟；
(2)准备待测血清；
(3)室温平衡后滴加洗涤液于反应区中，待液体将膜完全湿润；
(4)滴加待测样本于反应区中，待液体充分吸入；
(5)滴加酶标液于反应区中，待液体充分吸入；
(6)滴加洗涤液于反应区中，待液体充分吸入；
(7)滴加显色液于反应区中，待液体充分吸入后等待3分钟；
(8)滴加终止液于反应区中，待液体充分吸入后于3分钟内观察结果。
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