CN105067733B - 一种超高效合相色谱法测定食品中维生素e含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，具体过程为：将食品进行提取维生素E的预处理，得到提取液；采用超高效合相色谱仪分离并分别检测出提取液中八种维生素E异构体的含量，得到各自的质量浓度；检测条件为：流动相为超临界二氧化碳和甲醇/异丙醇(1:1)的混合液；超临界二氧化碳的梯度洗脱比为：0‑2.0min为90％‑100％，2.0‑6.0min为75％‑85％，6.0‑6.2min为90％‑100％；检测波长为294nm；通过公式计算出含量。本发明能在7min内快速分离并分别定量检测出食品中八种维生素E异构体的含量，具有检测速度快、分离度高、灵敏度高、再现性好等优点。

Description

一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法

技术领域

本发明涉及维生素E的定量检测领域，具体而言，涉及一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法。

背景技术

维生素E又称为生育酚，包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚。维生素E是一种活性很高的天然抗氧化剂，能够保护细胞膜及低密度脂蛋白免受自由基引起的氧化，具有预防慢性疾病、心血管疾病、动脉粥样硬化和癌症的功能。其中，α生育酚抗氧化能力最强，目前被研究的最多。然而，其它三种生育酚同样具有促进人体健康的独特生物学特性。生育三烯酚也具有化学预防和维持神经营养的重要作用。

目前，多种方法被用于食品及食品添加剂中维生素E的定量分析，包括非水毛细管电泳法、高效液相色谱法、气相色谱法等。同时分析样品中八种维生素E异构体主要采用高效液相色谱法，该方法最主要的缺点是分析时间长、分离度低、有机溶剂用量大。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，所述的测定方法能在7 min内快速分离并分别定量检测出食品中八种维生素E异构体的含量，具有检测速度快、有机溶剂用量少、分离度高、灵敏度高、再现性好等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，包括下列步骤：

将质量为m的食品进行提取维生素E的预处理，得到体积为V的提取液；

采用超高效合相色谱仪分离并分别检测出所述提取液中八种维生素E异构体的含量，得到各自的质量浓度；所述八种维生素E异构体为：α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚；

所述超高效合相色谱仪的检测条件为：色谱柱的直径为3.0 mm、柱长为100 mm、填料粒径为1.7 μm，填料为2-乙基吡啶键合硅胶；流动相为超临界二氧化碳和甲醇/异丙醇（1:1）的混合液；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-2.0 min为90%-100%，2.0-6.0 min为75%-85%， 6.0-6.2 min为90%-100%；分析时间：4.5-6.0 min；柱温：40-60℃；备压：1500-3000 psi；进样量：0.2-10 μL；流速：1.0-3.0 mL/min；检测波长为294 nm；

通过以下公式分别计算得到所述食品中八种维生素E异构体的含量：（质量浓度*V）/ m。

上述测定方法先将食品中的维生素E提取出来，然后在超高效合相色谱仪中采用特定的洗脱条件，将α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚这八种异构体分别选择性地分配，进而分离开，并定量检测出其浓度。最后代入公式（质量浓度*V）/ m，计算出食品中八种维生素E异构体的含量。整个超高效合相色谱的检测过程不会超过7 min，溶剂用量极少，并且谱图显示完全可以同时将八种维生素E异构体有效分离开。

上述测定方法适用于测定各种类型的食品，例如，植物组织（辣木叶）、水果（番木瓜）和食品添加剂（茶树油）等。

优选地，所述预处理的方法为：

先将食品打浆，再加入乙醇、维生素C溶液和氢氧化钾溶液进行皂化反应，得到皂化产物；

用***对所述皂化产物进行萃取，收集提取物；

用乙醇溶解所述提取物，即得提取液。

该预处理方法对α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的提取率高，损失少。其中，加入维生素C溶液可以避免检测成分被氧化，***萃取时对维生素E的选择性高，因此用***萃取可以起到富集的效果，提高后期检测的准确度；最后用乙醇作为溶剂定容，既可以充分溶解维生素E，又不会对后续的色谱分离造成干扰。

优选地，进行皂化反应时，乙醇、维生素C溶液和氢氧化钾溶液的体积比为5.5-6.5：1：1.8-2.2，且维生素C溶液的浓度为0.1-0.2 g/mL，氢氧化钾溶液的浓度为0.5-0.6g/mL。

采用上述比例的乙醇、维生素C和氢氧化钾，可以在几乎零氧化率的条件下将食品中的维生素E充分提取出来，提取率可以达到90%以上。

优选地，所述皂化反应的时间为30 min以上。

皂化30 min以后，反应基本达到饱和，如果再延长反应时间，提取率会提高，但相应的成本会急剧增加。

优选地，用乙醇溶解所述提取物之前还包括：

蒸馏回收***。

回收的***还可以用于下次萃取，通过该步骤实现降低能耗、绿色环保检测的目的。

优选地，每1克食品，至少加入8 mL氢氧化钾溶液。

皂化反应时，反应物之间的配比对反应产物的产量及反应速度具有至关重要的影响，采用上述配比产量高，且反应速度快。

优选地，所述食品为固态时，在所述皂化之前还包括：冷冻干燥处理12 h以上。

冷冻干燥处理既不会破坏被检测成分，又可以去除食品中水，起到富集的作用，还可以减少后期皂化提取的工作量。

优选地，所述超高效合相色谱仪检测时：波长补偿范围为 350-450 nm；该条件可以降低基线噪音干扰，得到的峰型对称性好、选择性强、干扰少。

优选地，备压为1800 psi；发现该范围的备压，可以提高维生素E的柱效，此时分离效果最佳，峰型分离度好。

优选地，流速为2 mL/min。该条件下分离效果更佳，灵敏度更高。

优选地，进样体积为0.8-1.2 μL，可以保证峰面积在比较合理的范围，从而保证在仪器的检测范围内。

优选地，食品为固体时，在皂化之前进行打浆处理，以便将其中的检测成分释放出来。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）能快速将食品中维生素E的八种异构体分离出来。

（2）能分别定量检测出食品中八种维生素E异构体的含量，并且还具有分离度高、灵敏度高、再现性好、检测时间短、有机溶剂用量少、采样量少等优点。

（3）提高了食品中维生素E的提取率。

附图说明【0004】

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中维生素E对照品的谱图；

图2为实施例1中样品的谱图。

具体实施方式【0005】

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法：

一、提取：

取新鲜番木瓜，快速打浆，避光真空冷冻干燥处理12 h，然后迅速研磨。准确称取12.0 g粉状样品于150 mL棕色皂化瓶，依次加入30 mL乙醇、5 mL维生素C（10%，即0.1 g/mL）和10 mL氢氧化钾（50%，即0.5 g/mL）溶液，沸水浴中回流皂化30 min，每隔8-10 min振摇一次。

待皂化后的溶液冷却至室温，加入85 mL的***进行萃取操作，密封后剧烈振荡2min，待静置分层，将上层液体转移至200 mL棕色分液漏斗中，用25 mL***进行二次提取，合并提取液，并用超纯水洗涤提取液，直至洗出液不显碱性，弃去下层水相，加入适量无水硫酸钠进行干燥，双层滤纸过滤，然后于50℃水浴中进行减压蒸馏并回收***。将提取物充分溶解于2.0 mL乙醇，再离心3 min，取上清液，再用针式滤器过滤上清液，得到的滤液即为超高效合相色谱仪检测所用的提取液。

二、超高效合相色谱仪测定标准曲线：

取α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的对照品，配制一系列浓度梯度（0.1-1.0 mg/mL）的混标溶液，在以下检测条件下测定含量，绘制标准曲线。

检测条件：

色谱柱的直径为3.0 mm、柱长为100 mm、填料粒径为1.7 μm，填料为2-乙基吡啶键合硅胶；流动相为超临界二氧化碳和甲醇/异丙醇（1:1）的混合液；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-2.0 min为90%-100%，2.0-6.0 min为75%-85%， 6.0-6.2 min为90%-100%；柱温：50℃；备压：1800 psi；进样量：1 μL；流速：2.0 mL/min；检测波长为294 nm，波长补偿范围为350- 450 nm。

三、超高效合相色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测提取液，得到α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的峰值，分别代入各自的标准曲线，计算出浓度，再通过公式（质量浓度*V）/ m计算食品所含维生素E异构体的量。

四、评价分析方法：

采用相同的样品评价上述测定方法的重现性、再现性、加样回收率。

该实施例的检测结果如下。

（一）八种维生素E异构体色谱图（标准样品）和标准曲线分别如图1和表1所示。

图1中，标号所对应的异构体的种类及含量为：1-α生育酚（0.999 mg/mL），2-δ生育酚（0.955 mg/mL），3-γ生育酚（0.475 mg/mL），4-β生育酚（0.999 mg/mL），5-α三烯生育酚（0.4935 mg/mL），6-β三烯生育酚（0.485 mg/mL），7-δ三烯生育酚（0.497 mg/mL），8-γ三烯生育酚（0.465 mg/mL）。

表1 八种维生素E异构体对照品的线性回归方程及相关参数

注：x：维生素E异构体的浓度（mg/mL）；y：维生素E异构体积分峰面积；* 检测限：信噪比（S/N）为3；** 定量限：信噪比（S/N）为10。

从表1可以看出，得到的线性回归方程的R²均在0.9990以上，线性稳定，误差小。

（二）番木瓜样品中维生素E色谱图如图2所示；根据线性回归方程计算得到番木瓜样品中维生素E各异构体的含量，如表2所示。

图2中，1为α生育酚，3为γ生育酚。

表2 番木瓜样品中维生素E含量

（三）回收率结果如表3所示，从表3可以看出，α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚这八种维生素E异构体的平均回收率范围在91.2%-98.2%，相对标准偏差0.7%-3.2%。

表3 回收率试验

实施例2

一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法：

一、提取：

取2.0 g茶树油，置于150 mL棕色皂化瓶，依次加入27.5 mL乙醇、5 mL维生素C（10%，即0.1-0.2 g/mL）和9 mL氢氧化钾（50%，即0.5 g/mL）溶液，沸水浴中回流皂化30min，每隔8-10 min振摇一次。

待皂化后的溶液冷却至室温，加入85 mL的***进行萃取操作，密封后剧烈振荡2min，待静置分层，将上层液体转移至200 mL棕色分液漏斗中，用25 mL***进行二次提取，合并提取液，并用超纯水洗涤提取液，直至洗出液不显碱性，弃去下层水相，加入适量无水硫酸钠进行干燥，双层滤纸过滤，然后于50℃水浴中进行减压蒸馏并回收***。将提取物充分溶解于2.0 mL乙醇，再离心3 min，取上清液，再用针式滤器过滤上清液，得到的滤液即为超高效合相色谱仪检测所用的提取液。

二、超高效合相色谱仪测定标准曲线：

取α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的对照品，对每一种异构体分别配制一系列标准溶液，在以下检测条件下测定含量，绘制标准曲线。

检测条件：

色谱柱的直径为3.0 mm、柱长为100 mm、填料粒径为1.7 μm，填料为2-乙基吡啶键合硅胶；流动相为超临界二氧化碳和甲醇/异丙醇（1:1）的混合液；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-2.0 min为90%-100%，2.0-6.0 min为75%-85%， 6.0-6.2 min为90%-100%；分析时间：4.5 min；柱温：40℃；备压：1500 psi；进样量：0.2 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长为294 nm，波长补偿范围为 350-600 nm，流速为1.0mL/min。

三、超高效合相色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测提取液，得到α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的峰值，分别代入各自的标准曲线，计算出浓度，再通过公式（质量浓度*V）/ m计算中食品中的异构体含量。

该实施例的结果显示，其再现性、重现性和回收率与实施例1一致，并且可以将番木瓜中的八种维生素E异构体完全分离出来。

实施例3

一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法：

一、提取：

取新鲜辣木叶，避光真空冷冻干燥处理12 h，然后迅速研磨。准确称取12.0 g粉状样品于150 mL棕色皂化瓶，依次加入30 mL乙醇、5 mL维生素C（20%，即0.2 g/mL）和10 mL氢氧化钾（60%，即0.6g/mL）溶液，沸水浴中回流皂化30 min，每隔8-10 min振摇一次。

待皂化后的溶液冷却至室温，加入85 mL的***进行萃取操作，密封后剧烈振荡2min，待静置分层，将上层液体转移至200 mL棕色分液漏斗中，用25 mL***进行二次提取，合并提取液，并用超纯水洗涤提取液，直至洗出液不显碱性，弃去下层水相，加入适量无水硫酸钠进行干燥，双层滤纸过滤，然后于50℃水浴中进行减压蒸馏并回收***。将提取物充分溶解于2.0 mL乙醇，再离心3 min，取上清液，再用针式滤器过滤上清液，得到的滤液即为超高效合相色谱仪检测所用的提取液。

二、超高效合相色谱仪测定标准曲线：

取α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的对照品，对每一种异构体分别配制一系列标准溶液，在以下检测条件下测定含量，绘制标准曲线。

检测条件：

色谱柱的直径为3.0 mm、柱长为100 mm、填料粒径为1.7 μm，填料为2-乙基吡啶键合硅胶；流动相为超临界二氧化碳和甲醇/异丙醇（1:1）的混合液；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-2.0 min为90%-100%，2.0-6.0 min为75%-85%， 6.0-6.2 min为90%-100%；分析时间：5 min；柱温：60℃；备压：3000 psi；进样量：10 μL；检测波长为294 nm，波长补偿范围为300-450 nm，流速为3.0 mL/min。

三、超高效合相色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测提取液，得到α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚的峰值，分别代入各自的标准曲线，计算出浓度，再通过公式（质量浓度*V）/ m计算中食品中的异构体含量。

该实施例的结果显示，其再现性、重现性和回收率与实施例1一致，并且可以将辣木叶中的八种维生素E异构体完全分离出来。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，包括下列步骤：

向质量为m的食品加入乙醇、维生素C溶液和氢氧化钾溶液进行皂化反应，得到皂化产物；用***对所述皂化产物进行萃取，收集提取物；用乙醇溶解所述提取物，即得体积为V的提取液；

采用超高效合相色谱仪分离并分别检测出所述提取液中八种维生素E异构体的含量，得到各自的质量浓度；所述八种维生素E异构体为：α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚；

所述超高效合相色谱仪的检测条件为：色谱柱的直径为3.0 mm、柱长为100 mm、填料粒径为1.7 μm，填料为2-乙基吡啶键合硅胶；流动相为超临界二氧化碳和等比的甲醇/异丙醇的混合液；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-2.0 min为90%-100%，2.0-6.0 min为75%-85%，6.0-6.2 min为90%-100%；分析时间：4.5-6.0 min；柱温：40-60℃；备压：1500-3000 psi；进样量：0.2-10 μL；流速：1.0-3.0 mL/min；检测波长为294 nm；

通过以下公式分别计算得到所述食品中八种维生素E异构体的含量：（质量浓度*V）/m。

2.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，所述食品选自植物组织、水果。

3.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，进行皂化反应时，乙醇、维生素C溶液和氢氧化钾溶液的体积比为5.5-6.5：1：1.8-2.2，且维生素C溶液的浓度为0.1-0.2 g/mL，氢氧化钾溶液的浓度为0.5-0.6 g/mL。

4.根据权利要求3所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，所述皂化反应的时间为30 min以上。

5.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，用乙醇溶解提取物之前还包括：

蒸馏回收***。

6.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，每1克食品，至少加入8 mL氢氧化钾溶液。

7.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，所述食品为固态时，在所述皂化之前还包括：冷冻干燥处理12 h以上。

8.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱仪检测时：波长补偿范围为 350-450 nm。

9.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中维生素E含量的方法，其特征在于，所述进样量为0.8-1.2 μL。