CN105063081A - 在***克鲁维酵母营养缺陷型菌株中使用的重组载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在***克鲁维酵母营养缺陷型菌株中使用的重组载体、及其制备方法和应用，所述重组载体按照顺序包括PKD1载体、菊粉酶启动子、菊粉酶信号肽、多克隆位点、菊粉酶终止子、营养基因启动子、营养基因开放阅读框。本发明构建的重组载体、及其制备方法，可用于构建转化子，来实现外源基因的表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组载体，尤其涉及一种在***克鲁维酵母营养缺陷型菌株中使用的重组表达载体。
背景技术
酵母是单细胞的真核生物，它兼具微生物的特性和真核生物的蛋白合成加工***。因此，它被广泛的用于表达多种外源真核蛋白。目前主流的酵母表达***包括毕赤酵母和酿酒酵母表达***。但是，毕赤酵母的蛋白表达需要用甲醇诱导，不适合用于食用蛋白的生产。酿酒酵母易产乙醇，生长密度低，表达水平偏低。针对这一系列问题，发展新型的安全性高和产量高的酵母表达***具有很高的工业价值。
***克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)已经通过了美国和欧洲的GRAS和QPS安全认证，其自身不仅被认为是安全的微生物菌株，同时也被认为是可用于制备食品级重组蛋白(酶)的安全微生物菌株，是一种被欧盟认可的食品级的酵母。它具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广等特点。同时，它还具有高效分泌蛋白的特点。因此，***克鲁维酵母具有高效表达食用和饲用蛋白的巨大潜力。
表达***由宿主菌和表达载体构成。对于食品安全级别的酵母表达***，宿主菌通常选用营养缺陷型标记。
发明内容
本发明提供了一种在***克鲁维酵母营养缺陷型菌株中使用、进行外源基因表达的重组表达载体。
本发明第一个方面是提供一种在***克鲁维酵母营养缺陷型菌株中使用的重组载体，按照顺序包括PKD1载体、菊粉酶启动子、菊粉酶信号肽、多克隆位点、菊粉酶终止子、营养基因启动子、营养基因开放阅读框(ORF)。
其中，所述营养基因优选为马克斯克鲁维菌株的营养基因，如URA3基因、HIS3基因、ADE2基因中的任意一种或几种，更优选为URA3基因。
其中，所述多克隆位点可以是包括一个或多个位点限制性酶切位点的序列，所述限制性酶切位点如SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一种或几种，更优选为SpeI、NotI、以及SmaI和/或XmaI中的任意一种或几种，如SmaI/XmaI、SpeI、NotI。
其中，所述多克隆位点长度优选为15-25bp，更优选为18-23bp，更优选为19-21bp。
在本发明的一种优选实施例中，所述重组载体的DNA序列如SEQIDNo.1所示。
本发明第二个方面是提供一种构建上述重组载体的方法包括：
扩增pUC19质粒、PKD1载体，获得pUC19与PKD1连接的片段I；
扩增***克鲁维酵母基因组，获得包含营养基因启动子或ORF的片段II；
扩增***克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶基因启动子、菊粉酶信号肽、和部分多克隆位点的片段III；
扩增***克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶终止子和部分多克隆位点的片段IV，
将片段I、II、III、IV进行连接，获得第一重组载体；
步骤2，
扩增第一重组载体，得到含有菊粉酶启动子，多克隆位点，菊粉酶终止子，营养基因启动子和营养基因ORF的片段A；
扩增第一重组载体，得到包含PKD1序列的片段B；
步骤3，
将片段A和片段B连接，转化营养缺陷型菌株，获得转化子；
抽提并扩增转化子基因组，分离出含有片段A和片段B的所述重组载体。
其中，步骤2中，获得片段A过程中的扩增引物为：
5'-CCGTGCCGATTCGCACGCTGCAACG-3；
5'-TGATGCATGCCGAGCTCGGTACCCCTCTTAAGCGG-3'。
其中，步骤2中，获得片段B过程中的扩增引物为：
5'-ACCGAGCTCGGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACG-3；
5'-CGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。
其中，步骤3中，获得片段C过程中的扩增引物为：
5'-ACAAAGGTGATGCTTTGGGACA-3；
5'-GCTTCTTACGTTACGGTTATGGAGC-3'。
其中，扩增pUC19质粒的引物优选为：
正向引物：
5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'；
反向引物：
5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'。
其中，扩增PKD1质粒的引物优选为：
正向引物：
5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3'；
反向引物：
5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。
其中，在一种优选实施例中，获得pUC19与PKD1连接的片段I方法如下：扩增pUC19质粒得到A片段，扩增Gateway***载体的pcYGW获得B片段，扩增PKD1载体获得C片段，将A、B和C片段连接，将连接得到的质粒进行扩增，得到包括pUC19与PKD1的片段I。
其中，扩增pcYGW所用引物优选为：
正向引物：5'-GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3'；
反向引物：5'-GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'。
其中，扩增质粒的引物优选为：
正向引物：5'-GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3'；
反向引物：
5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。
其中，扩增获得片段II的引物优选为：
正向引物：5'-CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3'；
反向引物：5'-GTACCCCTCTTAAGCGGATCTGCCTACTCTCTTCA-3'。
其中，扩增获得片段III的引物优选为：
正向引物：5'-GCATGCCGATCCGAAAAGGTAAACAGACACAAAAAC-3'；
反向引物：
5'-GTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATCACTGAAG-3'。
其中，扩增获得片段IV的引物优选为：
正向引物：
5'-ACGGTGACCCCGGGACTAGTGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTG-3'；
反向引物：5'-CAGAATTCGACCGATCCTAGAATGTTGGTCAGATGTG-3'。
在本发明一种优选实施例中，所述方法还包括：
扩增获得含有酵母alpha因子信号肽的片段，作为引物对所得重组载体进行突变。
其中，优选地，扩增PPIC9K载体获得含有所述酵母alpha因子信号肽的片段。
其中，扩增PPIC9K所用引物优选为：
正向引物：
5’-CCCATAAGTGACACATTTAATTTTTTTTTTGTTAGATATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3’；
反向引物：
5’-CTAGTCCCGGGGTCACCGTCGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3’。
本发明第三个方面是提供一种转化子，将外源基因***到所述重组载体的多克隆位点中，获得含有外源基因的质粒，将所述质粒转入营养基因缺陷型菌株中，获得所述转化子。
在一种优选实施例中，将外源基因***到权利要求1所述重组载体的多克隆位点的方法包括：
扩增所述重组载体，得到片段D，扩增引物为：
——正向引物5'-GGCCGCAAGCTTTGATCTGATCTGCTTAC-3'；
——反向引物5'-CTTGTAATTGATCACTGAAGCACTGACTCC-3'
扩增外源基因ORF的正向引物的5’端添加5'-CTTCAGTGATCAATTACAAG-3'的序列；在扩增外源基因ORF的反向引物的5’端添加5'-TCAGATCAAAGCTTGCGGCC-3'的序列；扩增得到片段E；
将片段D和E进行连接。
其中，所述营养基因缺陷型菌株优选为营养基因缺陷型马克斯克鲁维菌株。
所述营养基因缺陷优选为包括URA3基因、HIS3基因、ADE2基因缺陷中的任意一种或几种，更优选为URA3基因缺陷。
本发明构建的用于外源基因分泌表达的重组载体、及其制备方法，可用于构建转化子，来实现外源基因的表达。
附图说明
图1为本发明实施例1中所构建重组载体原理图。
具体实施方式
步骤1，构建第一重组载体
1.1、扩增pUC19质粒
正向引物：
5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'
反向引物：5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'
利用所述引物扩增pUC19质粒。PCR扩增反应按照Vazyme公司的PhantaSuperFidelityDNAPolymerase的使用说明书进行，退火温度为58℃，延伸时间为3分钟，30个循环。PCR产物命名为A1片段。
1.2，扩增Gateway***载体的pcYGW
正向引物：5'-GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3'
反向引物：5'-GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'
利用所述引物扩增Gateway***载体的pcYGW。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸时间为1分钟。PCR产物命名为B1片段。
1.3，扩增PKD1载体
正向引物：5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3'反向引物：
5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'
利用所述引物扩增PKD1载体。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸时间为5分钟。PCR产物命名为C1片段。
1.4，连接片段A1、B1、C1
按照NEB公司GibsonAssemblyMasterMix的使用说明书操作，将片段A1、B1、C1连接，转化大肠杆菌，获得的质粒命名为PUC19-PKD1。
1.5，扩增PUC19-PKD1质粒
正向引物：5'-GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3'
反向引物：
5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'
利用所述引物扩增PUC19-PKD1质粒。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸时间为8分钟。PCR产物命名为D1片段。D1片段中包括了部分PUC19序列和PKD1序列。
1.6，扩增URA3基因启动子和ORF片段
正向引物：5'-CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3'
反向引物：5'-GTACCCCTCTTAAGCGGATCTGCCTACTCTCTTCA-3'
按照酵母基因组提取试剂盒(DP307)的说明书操作，利用所述引物扩增马克斯克鲁维酵母的基因组。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸时间为1.5分钟。PCR产物命名为E1片段。E1片段中包含了URA3基因的启动子和ORF。
1.7，扩增菊粉酶基因的启动子和信号肽片段
正向引物：5'-GCATGCCGATCCGAAAAGGTAAACAGACACAAAAAC-3'
反向引物：5'-GTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATCACTGAAG-3'
利用所述引物扩增马克斯克鲁维酵母的基因组。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸时间为1.5分钟。PCR产物命名为F1片段。F1片段中包含了菊粉酶基因的启动子、信号肽和部分多克隆位点。
1.8，扩增菊粉酶基因的终止子片段
正向引物：
5'-ACGGTGACCCCGGGACTAGTGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTG-3'
反向引物：5'-CAGAATTCGACCGATCCTAGAATGTTGGTCAGATGTG-3'
利用所述引物扩增马克斯克鲁维酵母的基因组。PCR扩增条件同步骤1，除了延伸时间为1分钟。PCR产物命名为G1片段。G1片段中包含了菊粉酶基因的终止子和部分多克隆位点。
1.9，连接D1、E1、F1、G1片段
按照NEB公司GibsonAssemblyMasterMix的使用说明书操作，将片段D1、E1、F1、G1进行连接，转化大肠杆菌，获得的质粒命名为PUKDN112。
步骤2，扩增PUKDN112载体
2.1，扩增片段A
正向引物：5'-CCGTGCCGATTCGCACGCTGCAACG-3'
反向引物：5'-TGATGCATGCCGAGCTCGGTACCCCTCTTAAGCGG-3'
用所述引物扩增PUKDN112载体。PCR扩增的条件与PUKD112质粒构建时步骤1.1的条件一致，除了延伸时间为4分钟。按照Simgen的胶回收试剂盒的说明书操作，对PCR产物进行回收，该产物被命名为A片段。A片段中包含了菊粉酶启动子，多克隆位点，菊粉酶终止子，URA3启动子和URA3ORF。2.2，扩增片段B
正向引物：5'-ACCGAGCTCGGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACG-3'
反向引物：5'-CGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'
用所述引物扩增PUKDN112载体。PCR扩增的条件与PUKD112质粒构建时步骤1.1的条件一致，除了延伸时间为5分钟。按照Simgen的胶回收试剂盒的说明书操作，对PCR产物进行回收，该产物被命名为B片段。B片段中包含了PKD1序列。
步骤3，获得转化子
按照NEB公司GibsonAssemblyMasterMix的使用说明书操作，将片段A和B进行连接，将连接产物转化URA3基因突变的Kluyveromycesmarxianus的菌株中，在缺乏uracil的培养基上筛选转化子。
根据天根的酵母基因组提取试剂盒(DP307)的说明书操作，抽提URA3+转化子的基因组。用正向引物(5'-ACAAAGGTGATGCTTTGGGACA-3')和反向引物(5'-GCTTCTTACGTTACGGTTATGGAGC-3')扩增基因组。PCR扩增条件与PUKD112质粒构建时步骤1.1条件相一致，除了延伸时间为1分钟。按照Simgen的胶回收试剂盒说明书操作，对PCR产物进行回收，该产物被命名为C片段。该片段中包含了A片段和B片段的连接部分。由杰李公司用正向引物(5'-ACAAAGGTGATGCTTTGGGACA-3')对片段C进行测序，验证A片段和B片段是否正确连接。
参照图1，测序结果如下：
全长：8357bp
1-4759：PKD1载体序列
4768-5983：菊粉酶启动子
5984-6051：alpha信号肽
6062-6081：多克隆位点，包括SmaI/XmaI、SpeI、NotI三个位点。
6086-6950：菊粉酶终止子
6951-7536：KmURA3启动子
7537-8340：KmURA3ORF
PUKD118全序列如SEQIDNo.1所示。
按照Zymoresearch公司的ZymoprepYeastPlasmidMiniprepII试剂盒的说明书操作，对含有正确连接产物的转化子进行酵母质粒的抽提，获得质粒为PUKDN118。
用途：
用正向引物5'-GGCCGCAAGCTTTGATCTGATCTGCTTAC-3'和反向引物5'-CTTGTAATTGATCACTGAAGCACTGACTCC-3'扩增PUKD118质粒。PCR扩增条件与PUKD112质粒构建时步骤1.1条件相一致，除了延伸时间为8分钟。获得的PCR产物被命名为D片段。
在扩增外源基因ORF的正向引物的5’端添加5'-CTTCAGTGATCAATTACAAG-3'的序列，在扩增外源基因ORF的反向引物的5’端添加5'-TCAGATCAAAGCTTGCGGCC-3'的序列。利用该对引物扩增外源基因。PCR扩增条件与PUKD112质粒构建时步骤1.1条件相一致，延伸时间为每分钟/1K。获得的PCR产物被命名为E片段。
按照NEB公司GibsonAssemblyMasterMix的使用说明书操作，将片段D和E进行连接，将连接产物转化URA3基因突变的Kluyveromycesmarxianus的菌株中，在缺乏uracil的培养基上筛选转化子。
按照Zymoresearch公司的ZymoprepYeastPlasmidMiniprepII试剂盒的说明书，对URA3+转化子进行酵母质粒的抽提。用正向引物(5'-CAGCAATTAAATCCGGGGTAAG-3')和反向引物(5'-TATAAAATGTCGCTGTGACCAGGC-3')扩增质粒。PCR扩增条件与PUKD112质粒构建时步骤1条件相一致，除了延伸时间为每分钟/1K。
按照Simgen的胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，该产物被命名为F片段。由杰李公司用正向引物(5'-CAGCAATTAAATCCGGGGTAAG-3')和反向引物(5'-TATAAAATGTCGCTGTGACCAGGC-3')对片段F进行测序，验证外源基因与PUKD118是否连接正确。
选择含有正确连接了外源基因的PUKD118的转化子，进行外源基因的分泌表达，表达和检测的方法按照参考文献进行(ApplMicrobiolBiotechnol(2005)67:364–369)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种在***克鲁维酵母营养缺陷型菌株中使用的重组载体，其特征在于，按照顺序包括PKD1载体、菊粉酶启动子、菊粉酶信号肽、多克隆位点、菊粉酶终止子、营养基因启动子、营养基因开放阅读框。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述营养基因优选为马克斯克鲁维菌株URA3基因。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的DNA序列为SEQIDNo.1。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述多克隆位点选自限制性酶切位点SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一种或几种。
5.一种构建权利要求1所述重组载体的方法，其特征在于，包括：
步骤1，
扩增pUC19质粒、PKD1载体，获得pUC19与PKD1连接的片段I；
扩增***克鲁维酵母基因组，获得包含营养基因启动子或ORF的片段II；
扩增***克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶基因启动子、菊粉酶信号肽、和部分多克隆位点的片段III；
扩增***克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶终止子和部分多克隆位点的片段IV，
将片段I、II、III、IV进行连接，获得第一重组载体；
步骤2，
扩增第一重组载体，得到含有菊粉酶启动子，多克隆位点，菊粉酶终止子，营养基因启动子和营养基因ORF的片段A；
扩增第一重组载体，得到包含PKD1序列的片段B；
步骤3，
将片段A和片段B连接，转化营养缺陷型菌株，获得转化子；
抽提并扩增转化子基因组，分离出含有片段A和片段B的所述重组载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤2中，获得片段A过程中的扩增引物为：
5'-CCGTGCCGATTCGCACGCTGCAACG-3；
5'-TGATGCATGCCGAGCTCGGTACCCCTCTTAAGCGG-3'。
步骤2中，获得片段B过程中的扩增引物为：
5'-ACCGAGCTCGGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACG-3；
5'-CGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3中，获得片段C过程中的扩增引物为：
5'-ACAAAGGTGATGCTTTGGGACA-3；
5'-GCTTCTTACGTTACGGTTATGGAGC-3'。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，获得pUC19与PKD1连接的片段I方法如下：
扩增pUC19质粒得到A片段，扩增Gateway***载体的pcYGW获得B片段，扩增PKD1载体获得C片段，将A、B和C片段连接，将连接得到的质粒进行扩增，得到包括pUC19与PKD1的片段I。
9.一种转化子，其特征在于，将外源基因***到权利要求1所述重组载体的多克隆位点中，获得含有外源基因的质粒，将所述质粒转入营养基因缺陷型菌株中，获得所述转化子。
10.根据权利要求9所述的转化子，其特征在于，将外源基因***到权利要求1所述重组载体的多克隆位点的方法包括：
扩增所述重组载体，得到片段D，扩增引物为：
——正向引物5'-GGCCGCAAGCTTTGATCTGATCTGCTTAC-3'；
——反向引物5'-CTTGTAATTGATCACTGAAGCACTGACTCC-3'
扩增外源基因ORF的正向引物的5’端添加5'-CTTCAGTGATCAATTACAAG-3'的序列；在扩增外源基因ORF的反向引物的5’端添加5'-TCAGATCAAAGCTTGCGGCC-3'的序列；扩增得到片段E；
将片段D和E进行连接。
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