CN105062978A - 一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化为***细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法，是将带有类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因的质粒通过纳米金颗粒共转染入人脐带间充质干细胞，然后用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞。本发明提供一种高效、安全的***细胞分化方法以，分化后的***细胞可作为研究替代模型；可用于以***细胞在临床上细胞治疗的种子细胞，提高***细胞再生替代治疗的应用前景。
Description
技术领域
本发明属细胞生物学和发育生物学领域，具体涉及一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法。
背景技术
男性更年期综合征，是由于睾丸的萎缩，***的分泌减少，萎缩的睾丸对***的反应降低，使体内性激素的调节功能失衡而引起的一系列症状。主要表现为精神心理症状：精力不集中，记忆力减退，抑郁，焦虑，易怒，多疑，神经质，工作能力下降。血管舒缩症状有心悸，潮热，出汗。性方面的症状有性兴趣降低，***降低，阳痿。生理体能症状有睡眠减少，容易疲劳，食欲不振，骨骼与关节疼痛。
目前临床主要应用化学合成的雄性激素进行替代治疗。然而人体长期应用化学合成雄激素易引起肝功能损害、高血脂症及***癌等并发症，短期过量补充还可引起人情绪不稳等多种副反应。近年来国内外专家尝试开展了近亲供体移植术或干细胞移植术治疗睾丸损失或男性性腺低下症，取得较好效果。但这种移植术存在供体来源有限、手术复杂、经费高等缺点，受者需长期服用免疫抑制剂等。
近来，调节***细胞合成分泌雄激素的因素也越来越受到人们的重视。经调研，尚未见经纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是构建一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法，主要是通过10-30nm直径的纳米胶体金颗粒将类固醇生成因子1(SteroidogenicFactor1，SF-1)和促黄体生成激素受体(luteotropichormonereceptor，LHR)质粒共转染入人脐带间充质干细胞，然后用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞，进而分泌生成睾酮。
一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法，包含以下步骤：
1)纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染；
2)采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞
所述纳米金颗料为直径10-30nm的纳米胶体金颗粒，优选20nm。
所述纳米金颗料的合成过程如下：
(1)将氯金酸(HAuC14)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸。
(2)搅动下准确加入1.5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。
(3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2－3min。
(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。
所述纳米金颗粒介导的基因包被及基因转染，其步骤如下：
将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4×105个细胞，并按以下试剂量操作：取两种待转质粒(分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因)各2μg溶于100μlPBS缓冲液，再加入16μl纳米金颗粒溶液，涡旋1s混匀，室温放置2-5min后加入细胞中；转染24小时更换培养液后换成诱导培养液；
采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞，在转染24小时后加入以下配方的诱导培养基：5×10-7mol/L维Ａ酸和1×10-3mol/L8-溴-环磷腺苷，诱导分化7天后，检测***细胞中类固醇合成相关蛋白。
有益效果：
本发明提供一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化为***细胞的方法，所述方法高效、安全，分化后的***细胞可作为研究替代模型；可用于以***细胞在临床上细胞治疗的种子细胞，提高***细胞再生替代治疗的应用前景。
所述方法开拓了一种新的干细胞基因转染途径，为干细胞分化为***细胞提供一种高效、安全的方法；
所述方法分化后的***细胞能作为研究***细胞分泌调节功能影响因素研究的替代模型。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法，包含以下步骤：
3)纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染；
4)采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞
所述纳米金颗料的合成过程如下：
(1)将氯金酸(HAuC14)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸。
(2)搅动下准确加入1.5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。
(3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2－3min。
(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。
所述纳米金颗粒介导的基因包被及基因转染，其步骤如下：
将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4×105个细胞，L-DMEM+5%FBS培养基，培养箱温度37度，CO2浓度为5%，并按以下试剂量操作：取两种待转质粒(分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因)各2μg溶于100μlPBS缓冲液，再加入16μl纳米金颗粒溶液，涡旋1s混匀，室温放置2-5min后加入细胞中；转染24小时更换培养液后换成诱导培养液；
采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞，在转染24小时后加入以下配方的诱导培养基：5×10-7mol/L维Ａ酸和1×10-3mol/L8-溴-环磷腺苷，诱导分化7天后，检测***细胞中类固醇合成相关蛋白。
使用放射性免疫法检测由间充质干细胞定向分化成的***细胞分泌睾酮的情况。
具体检测方法为：睾酮分泌测定按照睾酮测定试剂盒说明书进行。取出酶标板，依照次序对应分别加入50μL的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加入50μL样品于空白微孔中；在标准品孔和样品孔中加入100μL的酶标记溶液；37℃孵育反应60min；浓缩洗液与蒸馏水1：20倍稀释后清洗酶标板5次，每次静置10－20S；每孔加入底物A、B液各50μL；37℃下避光孵育反应15min；每孔加入50μL终止液，终止反应。在波长450nm的酶标仪上测定OD值，通过标准曲线得出睾酮浓度值。
结果表明，测得溶剂对照组睾酮含量0.20nmol/L，诱导组分化而来的细胞具有分泌睾酮的能力，三次平行实验睾酮浓度分别为
0.95nmol/L，0.91nmol/L和0.98nmol/L(见表１)，对照组所得睾酮含量为分化试剂中的血清背景影响。
表1：未分化及分化后细胞培养液中睾酮的含量
| 组别 | 睾酮浓度(nM/L) |
| 对照组 | 0.20 |
| 平行分化实验1 | 0.95 |
| 平行分化实验2 | 0.91 |
| 平行分化实验3 | 0.98 |
在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构思下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种通过纳米金颗粒介导基因转染诱导人脐带间充质干细胞分化***细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
纳米金颗粒的合成，纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染；
采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米金颗料为直径10-30nm的纳米胶体金颗粒。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述纳米金颗料为直径20nm的纳米胶体金颗粒。
4.如权利要求1所述的方法，其他在于：所述纳米金颗粒的合成过程为：
(1)将氯金酸(HAuC14)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸；
(2)搅动下准确加入1.5mL的1%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液；
(3)继续加热煮沸15min，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程2－3min；
(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积备用。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米金颗粒对基因载体的包被，纳米金颗粒介导的基因转染过程为：
将人脐带间充质干细胞进行常规贴壁培养，按6孔培养板中每孔4×105个细胞，并按以下试剂量操作：取两种待转质粒(分别含类固醇生成因子1基因和促黄体生成激素受体基因)各2μg溶于100μlPBS缓冲液，再加入16μl纳米金颗粒溶液，涡旋1s混匀，室温放置2-5min后加入细胞中；转染24小时更换培养液后换成诱导培养液。
6.权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述采用化合物或生长因子诱导人脐带间充质干细胞定向分化为***细胞，诱导培养基为：在基础培养基中添加5×10-7mol/L维Ａ酸和1×10-3mol/L8-溴-环磷腺苷。
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