CN105039506A - Est-ssr标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用 - Google Patents
Est-ssr标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种EST-SSR标记引物组合,包括12对EST-SSR可用引物,EST-SSR标记引物组合筛选方法的步骤包括豌豆转录组测序获得的EST序列中SSR位点筛选、引物设计、PCR扩增、产物毛细管电泳检测、标记筛选,并将该EST-SSR标记引物组合应用与豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析,本发明提供的EST-SSR标记组合,有助于快速、准确地辨析菜用豌豆不同类型种质材料,分析其亲缘关系,为该物种的定向育种奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种EST-SSR标记引物组合及其筛选方法在豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析上的应用。
背景技术
豌豆(Pisum. sativum L.)为二倍体(2n=2x=14)豆科植物,是世界第二大食用豆类作物。菜用豌豆,也称甜豌豆,因其籽粒甘甜可口、风味独特、营养丰富,而深受消费者的喜爱,在我国农产品加工出口市场中占据的份额日趋扩大,市场前景广阔。然而,我国现有菜用豌豆主要为进口品种且老化严重,缺乏自主选育的优质高产品种。作为藤本植物的典型代表,菜用豌豆在我国市场中的主要品种为蔓生型品种,需搭架种植,耗费的经济成本相对较高,特别是目前劳动力成本的快速上升,严重制约了广大种植者经济效益的提升空间。因此,大力开展菜用豌豆优质高产、矮化品种的选育,培育符合我国国情的优势品种势在必行。
然而,我国菜用豌豆育种工作起步较晚,特别是种质资源搜集和鉴定方面进展缓慢,目前可利用的资源和品种不多,严重制约了育种进程。一方面,种质资源搜集鉴定过程耗时耗工,特别是矮生/蔓生材料生长前期表型类似,难以快速鉴定;另一方面,由于豌豆为常规种,市面上‘一种多名’现象严重,对种质资源搜集和鉴定造成过多田间重复劳动因此,利用分子标记进行种质资源鉴定和遗传多样性分析,将有助于精确鉴定豌豆种质,实现快速分类,为育种打下坚实基础。
目前,常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。但基于分子杂交的RFLP分析需要的总DNA量多,检测过程复杂,而且费用大,难以在育种实践中推广应用。RAPD 需要DNA量少,分析程序简单,但是它是显性标记,不能区分纯合和杂合型,且重复性差,在实际应用中也存在一定的困难。AFLP的优点是多态性好,准确性高,灵活性强,但是它的分析程序较复杂,而且成本较高,一般的育种单位难于接受。与其他分子标记相比,EST-SSR是一种基于基因表达序列有关基因功能的“真质”标记,其多态性直接反映基因的多样性。在种质资源鉴定、转录图谱的绘制以及功能基因发掘和利用方面发挥巨大的作用;而且EST-SSR具有很高的通用性,一旦开发可以在许多相关物种中应用。随着NCBI数据库中登录的EST库快速增加,EST-SSR标记***已在水稻、大麦、小麦等农作物的农艺性状定位、遗传作图、遗传多样性中成果应用。自2010年开始,我们率先开展了菜用豌豆EST-SSR标记开发工作(Gong等,2010;Gong等,2011;Xu等,2012),并获得了一批多态性EST-SSR标记。但是,豌豆EST信息稀少,发展缓慢(截止2015年3月NCBI数据库中豌豆EST仍只有21,838条),严重制约了EST-SSR分子标记的开发。而且,目前尚无针对矮生和蔓生豌豆材料的EST-SSR标记体系。鉴于此,本发明以矮生和蔓生类型豌豆为材料,通过高通量转录组测序获得EST,在此基础上开发EST-SSR标记,实现快速准确鉴定豌豆矮生和蔓生材料,并进行亲缘关系分析。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合。
本发明第二目的在于提供上述EST-SSR标记组合的构建、筛选方法。
本发明第三目的在于提供上述EST-SSR标记组合在进行豌豆种质资源鉴定。
一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合,包括12 对EST-SSR可用引物,引物名称及序列分别为:
PeaNsat-001, s:5’- TTGGAGACGGCATAACC-3’,a:5’- CCTTGCTTGGAGGAACT-3’;
PeaNsat-004, s:5’- CACAGAATGGGTTGAG-3’,a:5’- GTGGGGTTTGGATAGT-3’ ;
PeaNsat-021, s:5’- ATGGAGCGGAGGAGTTGG-3’,a:5’- CGATGATGCTGCGTTCTT-3’ ;
PeaNsat-022, s:5’- TCTTCACGCCTAAAACTC-3’,a:5’- AACCGAAACGAAATCAC-3’ ;
PeaNsat-029, s:5’- GAGACAATGATGGAACAAG-3’,a:5’- TGCCAAACTGACAGACAAA-3’ ;
PeaNsat-031, s:5’- CTTAGTTTGCGACCAGC -3’,a:5’- CGTGAACGGAAGGACAT-3’ ;
PeaNsat-083, s:5’- TGTTGAGAAGCGTGAATG -3’,a:5’- CTCTTTTGGCTGGGATTA -3’ ;
PeaNsat-095, s:5’- AGTGGAAGGAGATGAACA -3’,a:5’- CTAATGGAAGGGGTAGAG -3;
PeaNsat-100, s:5’- AAACCAAAACCACCCTAC -3’,a:5’- TTAGACTCAGAGCCAAATC -3’ ;
PeaNsat-113, s:5’- GCAACCTCGTCGCAAAAC -3’,a:5’- GCCGAAGATGAAGATGGA -3’ ;
PeaNsat-124, s:5’- TTCCAGTAACCAACACCG -3’,a:5’- CAATTTCCCAAACACTACAC;
PeaNsat-125, s:5’- TGGCTTCACTGATACCTT -3’,a:5’- TCCACTGTTTTCTCCTCC -3’ 。
一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法,包括如下步骤:
(1) 以矮生与蔓生类型豌豆为材料,应用新一代高通量测序平台(454 GS FLX)对cDNA 样品测序,对测序结果去杂分析,分别获取unigene
44,720条和44,449条,并构建高质量cDNA文库,两文库合并后获独立基因42,791条,共计38,179,780供SSR搜索分析;采用SSRIT软件对非冗余序列进行SSR筛选分析。
(2)引物设计:利用Primer Premier
5.0软件,对步骤(1)筛选分析的含有SSR的unigene进行特异引物设计,引物正义链的5’端分别以FAM或HEX荧光染料标记;引物设计的主要参数为:引物长度为17-24 bp,退火温度为50-60℃。
(3)PCR扩增:步骤(2)设计的引物以豌豆DNA为模板进行PCR扩增反应,反应体系总体积20 μL,具体包括1×PCR缓冲液,2 μmol•L-1 MgCl2,0.2 μmol•L-1 dNTPs,0.2 μmol•L-1正引物,0.2 μmol•L-1反引物,1 U Taq DNA聚合酶及15-25 ngDNA模板;PCR扩增反应程序为:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,54 ℃复性30 s,72 ℃延伸80 s,43个循环;最后72 ℃延伸8 min。
(4)产物毛细管电泳检测:步骤(3)扩增产物混匀稀释后,加入ET550-R分子量内标,95℃变性1 min,迅速冰浴至冷却,3000 r/min离心1 min,于MegaBACE 1000
DNA分析***上进行毛细管电泳;其中进样电压3 kV,进样时间45 s,电泳电压8 kV,电泳时间90 min。
(5)标记筛选:用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析,筛选出12对ETS-SSR标记。
进一步地,上述用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法,其特征在于,所述步骤(1)对unigene序列进行SSR筛选分析中筛选标准为:二基元重复8次以上,三基元重复5次以上,四基元重复4次以上,五基元以上重复不少于3次。
进一步地,上述步骤(1)样品测序中还包括高通量转录组测序过程,该过程以矮生与蔓生类型豌豆为材料,提取植株总RNA,利用Oligotex® mRNA kit (Qiagen)分离纯化mRNA;以mRNA为模板,反转录合成cDNA;对cDNA 进行扩增,并去除体系中小于300 bp 的片段。
进一步地,上述用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合进行豌豆种质资源鉴定的方法,包括如下步骤:
(1)实验材料的准备:选取菜用豌豆进行育苗处理,待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片,用液氮速冻后于-70℃保存.采用试剂盒法提取总DNA。
(2)以步骤(1)获得额DNA为模板,利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增。
(3)对步骤(3)中扩增产物进行毛细管电泳检测,用Genetic profiler软件对原始数据进行分析,计算各目标DNA片段的大小;利用GenAlEx
6.5软件进行种质材料遗传多样性分析,区分不同种类豌豆。
本发明提供的豌豆EST-SSR标记组合,用于豌豆遗传多样性分析及高/矮生类型种质鉴定,有助于快速、准确地辨析菜用豌豆不同类型种质材料,分析其亲缘关系,为该物种的定向育种奠定基础。
说明书附图
图1、EST-SSR多态性生物荧光毛细管电泳结果示例。
图2、同一泳道中不同荧光标记产物示例。
图3、 EST-SSR应用于矮生型和蔓生型菜用豌豆分类。
图4、EST-SSR应用于矮生型和蔓生型菜用豌豆亲缘关系分析。
具体实施方式
下面通过实施例,对本发明具体实施方式进行说明。
实施例
1
EST-SSR标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用,其具体步骤包括如下:
(1) 种质材料准备。
本发明所利用的豌豆材料包括8份矮生豌豆和12份蔓生豌豆豌豆材料,见下表1。
表1 豌豆种质信息表。
(2) 高通量转录组测序
以矮生与蔓生类型豌豆为材料,提取植株总RNA,利用Oligotex® mRNA kit (Qiagen)分离纯化mRNA;以mRNA为模板,反转录合成cDNA;对cDNA 进行扩增,并去除体系中小于300 bp 的片段,构建高质量cDNA文库;应用新一代高通量测序平台(454
GS FLX)对cDNA 样品测序。
(3)
种质样本DNA提取
供试种质材料在浙江省农业科学院蔬菜研究所豆类育种基地育苗,幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片,用液氮速冻后于-70℃保存.采用试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit,QIAGEN)法提取总DNA。
(4)
引物设计
经过转录组测序,获得的原始数据经去杂分析,分别在矮生型与蔓生型材料中获得51,236,808和51,158,490 条reads,两文库的Q20分别为矮生型98.12%和蔓生型98.20%,GC含量分别为矮生型44.74%和蔓生型44.33%,测序数据可靠有效。进一步拼接,分别获得73,532条(矮生型)和70,655条(蔓生型)contig,平均长度为432 nt和475 nt;分别获取unigene 44,720条和44,449条,两文库合并后获独立基因42,791条,共计38,179,780 nt,比现有公共数据库中的豌豆序列总长度增加了二十多倍,用于SSR标记开发。
然后采用SSRIT软件(http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool)
对上述unigene进行SSR筛选分析,筛选标准为:二基元重复8次以上,三基元重复5次以上,四基元重复4次以上,五基元以上重复不少于3次。利用Primer Premier 5.0软件,对含有SSR的unigene进行特异引物设计,引物设计的主要参数为:引物长度为17-24
bp,退火温度为50-60℃。共自主设计引物170对,引物由上海赛百胜公司合成,分别以FAM或HEX荧光染料标记SSR引物正义链的5’端。
(5)
PCR扩增及产物检测
PCR反应体系的总体积为20 μL,含有1×PCR缓冲液,2 μmol·L−1 MgCl2,0.2 μmol·L−1 dNTPs,0.2 μmol·L−1正、反引物,1 U Taq DNA聚合酶及约20 ng的DNA模板。各样品反应混合液分别加入至96孔PCR板中,根据修饰引物不同,分为FAM反应板和HEX反应板。PCR扩增反应程序为:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,54 ℃复性30 s,72 ℃延伸80 s,43个循环;最后72 ℃延伸8 min。
扩增后产物混点:各取一板FAM修饰产物和HEX修饰产物,每样品吸取10 μL,于1块新的96孔PCR板中混合均匀,获得1块含196个样品的PCR产物板。
毛细管电泳检测:将PCR混合产物稀释50倍,在96孔板的各孔中分别加入ET550-R分子量内标(GE Healthcare)和1 μL稀释后的PCR混合产物,95℃变性1 min,迅速冰浴至冷却,3000 r/min离心1 min,于MegaBACE 1000 DNA分析***上进行毛细管电泳。进样电压3 kV,进样时间45 s,电泳电压8 kV,电泳时间90 min。
用Genetic profiler软件对原始数据进行分析,***将各峰值的位置与其泳道中的ET
550-R分子量内标做比较.计算各目标DNA片段的大小。利用GenAlEx
6.5软件进行种质材料遗传多样性分析。
实施例
2
结合实施例1,EST-SSR标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用的结果分析如下:
图1为EST-SSR标记荧光毛细管电泳检测结果,通过对170对引物的分析,如图1所示,共获得46对多态性引物,并能在同一泳道中得到明显条带,详见图2。
如下表2所示,从中筛选获得12对ETS-SSR标记用于菜用豌豆种质资源鉴定。
如图3所示,成功将8份矮生型和12份蔓生型菜用豌豆分成两类。并对其亲缘关系进行鉴定,见图4。
Claims (5)
1.一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合,其特征在于,包括12 对EST-SSR可用引物,引物名称及序列分别为:
PeaNsat-001, s:5’- TTGGAGACGGCATAACC-3’,a:5’- CCTTGCTTGGAGGAACT-3’;
PeaNsat-004, s:5’- CACAGAATGGGTTGAG-3’,a:5’- GTGGGGTTTGGATAGT-3’ ;
PeaNsat-021, s:5’- ATGGAGCGGAGGAGTTGG-3’,a:5’- CGATGATGCTGCGTTCTT-3’ ;
PeaNsat-022, s:5’- TCTTCACGCCTAAAACTC-3’,a:5’- AACCGAAACGAAATCAC-3’ ;
PeaNsat-029, s:5’- GAGACAATGATGGAACAAG-3’,a:5’- TGCCAAACTGACAGACAAA-3’ ;
PeaNsat-031, s:5’- CTTAGTTTGCGACCAGC -3’,a:5’- CGTGAACGGAAGGACAT-3’ ;
PeaNsat-083, s:5’- TGTTGAGAAGCGTGAATG -3’,a:5’-
CTCTTTTGGCTGGGATTA -3’ ;
PeaNsat-095, s:5’- AGTGGAAGGAGATGAACA -3’,a:5’-
CTAATGGAAGGGGTAGAG -3;
PeaNsat-100, s:5’- AAACCAAAACCACCCTAC -3’,a:5’- TTAGACTCAGAGCCAAATC -3’ ;
PeaNsat-113, s:5’- GCAACCTCGTCGCAAAAC -3’,a:5’- GCCGAAGATGAAGATGGA -3’ ;
PeaNsat-124, s:5’- TTCCAGTAACCAACACCG -3’,a:5’- CAATTTCCCAAACACTACAC;
PeaNsat-125, s:5’- TGGCTTCACTGATACCTT -3’,a:5’- TCCACTGTTTTCTCCTCC -3’ 。
2.一种如权利要求1 所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1) 以矮生与蔓生类型豌豆为材料,应用新一代高通量测序平台(454 GS FLX)对cDNA 样品测序,对测序结果去杂分析,分别获取unigene 44,720条和44,449条,并构建高质量cDNA文库,两文库合并后获独立基因42,791条,共计38,179,780供SSR搜索分析;采用SSRIT软件对非冗余序列进行SSR筛选分析;
(2)引物设计:利用Primer Premier 5.0软件,对步骤(1)筛选分析的含有SSR的unigene进行特异引物设计,引物正义链的5’端分别以FAM或Hex荧光染料标记;引物设计的主要参数为:引物长度为17-24 bp,退火温度为50-60℃;
(3)PCR扩增:步骤(2)设计的引物以豌豆DNA为模板进行PCR扩增反应,反应体系总体积20 μL,具体包括1×PCR缓冲液,2 μmol·L-1 MgCl2,0.2 μmol·L-1 dNTPs,0.2 μmol·L-1正引物,0.2 μmol·L-1反引物,1 U Taq DNA聚合酶及15-25 ngDNA模板;PCR扩增反应程序为:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,54 ℃复性30 s,72 ℃延伸80 s,43个循环;最后72 ℃延伸8 min;
(4)产物毛细管电泳检测:步骤(3)扩增产物混匀稀释后,加入ET550-R分子量内标,95℃变性1 min,迅速冰浴至冷却,3000 r/min离心1 min,于MegaBACE 1000 DNA分析***上进行毛细管电泳;其中进样电压3 kV,进样时间45 s,电泳电压8 kV,电泳时间90 min;
(5)标记筛选:用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析,筛选出12对ETS-SSR标记。
3.根据权利要求2所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法,其特征在于,所述步骤(1)对unigene序列进行SSR筛选分析中筛选标准为:二基元重复8次以上,三基元重复5次以上,四基元重复4次以上,五基元以上重复不少于3次。
4.根据权利要求2或3所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法,其特征在于,所述步骤(1)样品测序中还包括高通量转录组测序过程,该过程以矮生与蔓生类型豌豆为材料,提取植株总RNA,利用Oligotex® mRNA kit (Qiagen)分离纯化mRNA;以mRNA为模板,反转录合成cDNA;对cDNA 进行扩增,并去除体系中小于300 bp 的片段。
5.一种利用权利要求1 所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合进行豌豆种质资源鉴定的方法,包括如下步骤:
(1)实验材料的准备:选取菜用豌豆进行育苗处理,待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片,用液氮速冻后于-70℃保存.采用试剂盒法提取总DNA;
(2)以步骤(1)获得额DNA为模板,利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增;
(3)对步骤(3)中扩增产物进行毛细管电泳检测,用Genetic profiler软件对原始数据进行分析,计算各目标DNA片段的大小;利用GenAlEx 6.5软件进行种质材料遗传多样性分析,区分不同种类豌豆。
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