CN105039506A

CN105039506A - Est-ssr标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用

Info

Publication number: CN105039506A
Application number: CN201510189827.6A
Authority: CN
Inventors: 徐盛春; 龚亚明; 胡齐赞; 刘娜
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了一种EST-SSR标记引物组合，包括12对EST-SSR可用引物，EST-SSR标记引物组合筛选方法的步骤包括豌豆转录组测序获得的EST序列中SSR位点筛选、引物设计、PCR扩增、产物毛细管电泳检测、标记筛选，并将该EST-SSR标记引物组合应用与豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析，本发明提供的EST-SSR标记组合，有助于快速、准确地辨析菜用豌豆不同类型种质材料，分析其亲缘关系，为该物种的定向育种奠定基础。

Description

EST-SSR标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种EST-SSR标记引物组合及其筛选方法在豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析上的应用。

背景技术

豌豆（Pisum. sativum L.）为二倍体（2n=2x=14）豆科植物，是世界第二大食用豆类作物。菜用豌豆，也称甜豌豆，因其籽粒甘甜可口、风味独特、营养丰富，而深受消费者的喜爱，在我国农产品加工出口市场中占据的份额日趋扩大，市场前景广阔。然而，我国现有菜用豌豆主要为进口品种且老化严重，缺乏自主选育的优质高产品种。作为藤本植物的典型代表，菜用豌豆在我国市场中的主要品种为蔓生型品种，需搭架种植，耗费的经济成本相对较高，特别是目前劳动力成本的快速上升，严重制约了广大种植者经济效益的提升空间。因此，大力开展菜用豌豆优质高产、矮化品种的选育，培育符合我国国情的优势品种势在必行。

然而，我国菜用豌豆育种工作起步较晚，特别是种质资源搜集和鉴定方面进展缓慢，目前可利用的资源和品种不多，严重制约了育种进程。一方面，种质资源搜集鉴定过程耗时耗工，特别是矮生/蔓生材料生长前期表型类似，难以快速鉴定；另一方面，由于豌豆为常规种，市面上‘一种多名’现象严重，对种质资源搜集和鉴定造成过多田间重复劳动因此，利用分子标记进行种质资源鉴定和遗传多样性分析，将有助于精确鉴定豌豆种质，实现快速分类，为育种打下坚实基础。

目前，常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。但基于分子杂交的RFLP分析需要的总DNA量多，检测过程复杂，而且费用大，难以在育种实践中推广应用。RAPD 需要DNA量少，分析程序简单，但是它是显性标记，不能区分纯合和杂合型，且重复性差，在实际应用中也存在一定的困难。AFLP的优点是多态性好，准确性高，灵活性强，但是它的分析程序较复杂，而且成本较高，一般的育种单位难于接受。与其他分子标记相比，EST-SSR是一种基于基因表达序列有关基因功能的“真质”标记，其多态性直接反映基因的多样性。在种质资源鉴定、转录图谱的绘制以及功能基因发掘和利用方面发挥巨大的作用；而且EST-SSR具有很高的通用性，一旦开发可以在许多相关物种中应用。随着NCBI数据库中登录的EST库快速增加，EST-SSR标记***已在水稻、大麦、小麦等农作物的农艺性状定位、遗传作图、遗传多样性中成果应用。自2010年开始，我们率先开展了菜用豌豆EST-SSR标记开发工作（Gong等，2010；Gong等，2011；Xu等，2012），并获得了一批多态性EST-SSR标记。但是，豌豆EST信息稀少，发展缓慢（截止2015年3月NCBI数据库中豌豆EST仍只有21,838条），严重制约了EST-SSR分子标记的开发。而且，目前尚无针对矮生和蔓生豌豆材料的EST-SSR标记体系。鉴于此，本发明以矮生和蔓生类型豌豆为材料，通过高通量转录组测序获得EST，在此基础上开发EST-SSR标记，实现快速准确鉴定豌豆矮生和蔓生材料，并进行亲缘关系分析。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合。

本发明第二目的在于提供上述EST-SSR标记组合的构建、筛选方法。

本发明第三目的在于提供上述EST-SSR标记组合在进行豌豆种质资源鉴定。

一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，包括12 对EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为：

PeaNsat-001， s:5’- TTGGAGACGGCATAACC-3’，a:5’- CCTTGCTTGGAGGAACT-3’；

PeaNsat-004， s:5’- CACAGAATGGGTTGAG-3’，a:5’- GTGGGGTTTGGATAGT-3’ ；

PeaNsat-021， s:5’- ATGGAGCGGAGGAGTTGG-3’，a:5’- CGATGATGCTGCGTTCTT-3’ ；

PeaNsat-022， s:5’- TCTTCACGCCTAAAACTC-3’，a:5’- AACCGAAACGAAATCAC-3’ ；

PeaNsat-029， s:5’- GAGACAATGATGGAACAAG-3’，a:5’- TGCCAAACTGACAGACAAA-3’ ；

PeaNsat-031， s:5’- CTTAGTTTGCGACCAGC -3’，a:5’- CGTGAACGGAAGGACAT-3’ ；

PeaNsat-083， s:5’- TGTTGAGAAGCGTGAATG -3’，a:5’- CTCTTTTGGCTGGGATTA -3’ ；

PeaNsat-095， s:5’- AGTGGAAGGAGATGAACA -3’，a:5’- CTAATGGAAGGGGTAGAG -3；

PeaNsat-100， s:5’- AAACCAAAACCACCCTAC -3’，a:5’- TTAGACTCAGAGCCAAATC -3’ ；

PeaNsat-113， s:5’- GCAACCTCGTCGCAAAAC -3’，a:5’- GCCGAAGATGAAGATGGA -3’ ；

PeaNsat-124， s:5’- TTCCAGTAACCAACACCG -3’，a:5’- CAATTTCCCAAACACTACAC；

PeaNsat-125， s:5’- TGGCTTCACTGATACCTT -3’，a:5’- TCCACTGTTTTCTCCTCC -3’ 。

一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，包括如下步骤：

(1) 以矮生与蔓生类型豌豆为材料，应用新一代高通量测序平台（454 GS FLX）对cDNA 样品测序，对测序结果去杂分析，分别获取unigene 44,720条和44,449条，并构建高质量cDNA文库，两文库合并后获独立基因42,791条，共计38,179,780供SSR搜索分析；采用SSRIT软件对非冗余序列进行SSR筛选分析。

（2）引物设计：利用Primer Premier 5.0软件，对步骤(1)筛选分析的含有SSR的unigene进行特异引物设计，引物正义链的5’端分别以FAM或HEX荧光染料标记；引物设计的主要参数为：引物长度为17-24 bp，退火温度为50-60℃。

（3）PCR扩增：步骤（2）设计的引物以豌豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系总体积20 μL，具体包括1×PCR缓冲液，2 μmol•L-1 MgCl2，0.2 μmol•L-1 dNTPs，0.2 μmol•L-1正引物，0.2 μmol•L-1反引物，1 U Taq DNA聚合酶及15-25 ngDNA模板；PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，54 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，43个循环；最后72 ℃延伸8 min。

（4）产物毛细管电泳检测：步骤（3）扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内标，95℃变性1 min，迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心1 min，于MegaBACE 1000 DNA分析***上进行毛细管电泳；其中进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min。

（5）标记筛选：用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析，筛选出12对ETS-SSR标记。

进一步地，上述用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）对unigene序列进行SSR筛选分析中筛选标准为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少于3次。

进一步地，上述步骤（1）样品测序中还包括高通量转录组测序过程，该过程以矮生与蔓生类型豌豆为材料，提取植株总RNA，利用Oligotex® mRNA kit (Qiagen)分离纯化mRNA；以mRNA为模板，反转录合成cDNA；对cDNA 进行扩增，并去除体系中小于300 bp 的片段。

进一步地，上述用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合进行豌豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤：

（1）实验材料的准备：选取菜用豌豆进行育苗处理，待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于-70℃保存．采用试剂盒法提取总DNA。

（2）以步骤（1）获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增。

（3）对步骤（3）中扩增产物进行毛细管电泳检测，用Genetic profiler软件对原始数据进行分析，计算各目标DNA片段的大小；利用GenAlEx 6.5软件进行种质材料遗传多样性分析，区分不同种类豌豆。

本发明提供的豌豆EST-SSR标记组合，用于豌豆遗传多样性分析及高/矮生类型种质鉴定，有助于快速、准确地辨析菜用豌豆不同类型种质材料，分析其亲缘关系，为该物种的定向育种奠定基础。

说明书附图

图1、EST-SSR多态性生物荧光毛细管电泳结果示例。

图2、同一泳道中不同荧光标记产物示例。

图3、 EST-SSR应用于矮生型和蔓生型菜用豌豆分类。

图4、EST-SSR应用于矮生型和蔓生型菜用豌豆亲缘关系分析。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明具体实施方式进行说明。

实施例 1

EST-SSR标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用，其具体步骤包括如下：

(1) 种质材料准备。

本发明所利用的豌豆材料包括8份矮生豌豆和12份蔓生豌豆豌豆材料，见下表1。

表1 豌豆种质信息表。

(2) 高通量转录组测序

以矮生与蔓生类型豌豆为材料，提取植株总RNA，利用Oligotex® mRNA kit (Qiagen)分离纯化mRNA；以mRNA为模板，反转录合成cDNA；对cDNA 进行扩增，并去除体系中小于300 bp 的片段，构建高质量cDNA文库；应用新一代高通量测序平台（454 GS FLX）对cDNA 样品测序。

(3) 种质样本DNA提取

供试种质材料在浙江省农业科学院蔬菜研究所豆类育种基地育苗，幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于-70℃保存．采用试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN）法提取总DNA。

(4) 引物设计

经过转录组测序，获得的原始数据经去杂分析，分别在矮生型与蔓生型材料中获得51,236,808和51,158,490 条reads，两文库的Q20分别为矮生型98.12%和蔓生型98.20%，GC含量分别为矮生型44.74%和蔓生型44.33%，测序数据可靠有效。进一步拼接，分别获得73,532条（矮生型）和70,655条（蔓生型）contig，平均长度为432 nt和475 nt；分别获取unigene 44,720条和44,449条，两文库合并后获独立基因42,791条，共计38,179,780 nt，比现有公共数据库中的豌豆序列总长度增加了二十多倍，用于SSR标记开发。

然后采用SSRIT软件(http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool) 对上述unigene进行SSR筛选分析，筛选标准为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少于3次。利用Primer Premier 5.0软件，对含有SSR的unigene进行特异引物设计，引物设计的主要参数为：引物长度为17-24 bp，退火温度为50-60℃。共自主设计引物170对，引物由上海赛百胜公司合成，分别以FAM或HEX荧光染料标记SSR引物正义链的5’端。

(5) PCR扩增及产物检测

PCR反应体系的总体积为20 μL，含有1×PCR缓冲液，2 μmol·L⁻¹ MgCl₂，0.2 μmol·L⁻¹ dNTPs，0.2 μmol·L⁻¹正、反引物，1 U Taq DNA聚合酶及约20 ng的DNA模板。各样品反应混合液分别加入至96孔PCR板中，根据修饰引物不同，分为FAM反应板和HEX反应板。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，54 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，43个循环；最后72 ℃延伸8 min。

扩增后产物混点：各取一板FAM修饰产物和HEX修饰产物，每样品吸取10 μL，于1块新的96孔PCR板中混合均匀，获得1块含196个样品的PCR产物板。

毛细管电泳检测：将PCR混合产物稀释50倍，在96孔板的各孔中分别加入ET550-R分子量内标（GE Healthcare）和1 μL稀释后的PCR混合产物，95℃变性1 min，迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心1 min，于MegaBACE 1000 DNA分析***上进行毛细管电泳。进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min。

用Genetic profiler软件对原始数据进行分析，***将各峰值的位置与其泳道中的ET 550-R分子量内标做比较．计算各目标DNA片段的大小。利用GenAlEx 6.5软件进行种质材料遗传多样性分析。

实施例 2

结合实施例1，EST-SSR标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用的结果分析如下：

图1为EST-SSR标记荧光毛细管电泳检测结果，通过对170对引物的分析，如图1所示，共获得46对多态性引物，并能在同一泳道中得到明显条带，详见图2。

如下表2所示，从中筛选获得12对ETS-SSR标记用于菜用豌豆种质资源鉴定。

如图3所示，成功将8份矮生型和12份蔓生型菜用豌豆分成两类。并对其亲缘关系进行鉴定，见图4。

Claims

1.一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，其特征在于，包括12 对EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为：

2.一种如权利要求1 所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 以矮生与蔓生类型豌豆为材料，应用新一代高通量测序平台（454 GS FLX）对cDNA 样品测序，对测序结果去杂分析，分别获取unigene 44,720条和44,449条，并构建高质量cDNA文库，两文库合并后获独立基因42,791条，共计38,179,780供SSR搜索分析；采用SSRIT软件对非冗余序列进行SSR筛选分析；

（2）引物设计：利用Primer Premier 5.0软件，对步骤(1)筛选分析的含有SSR的unigene进行特异引物设计，引物正义链的5’端分别以FAM或Hex荧光染料标记；引物设计的主要参数为：引物长度为17-24 bp，退火温度为50-60℃；

（3）PCR扩增：步骤（2）设计的引物以豌豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系总体积20 μL，具体包括1×PCR缓冲液，2 μmol·L^-1MgCl₂，0.2 μmol·L^-1dNTPs，0.2 μmol·L^-1正引物，0.2 μmol·L^-1反引物，1 U Taq DNA聚合酶及15-25 ngDNA模板；PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，54 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，43个循环；最后72 ℃延伸8 min；

（4）产物毛细管电泳检测：步骤（3）扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内标，95℃变性1 min，迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心1 min，于MegaBACE 1000 DNA分析***上进行毛细管电泳；其中进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min；

3.根据权利要求2所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）对unigene序列进行SSR筛选分析中筛选标准为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上重复不少于3次。

4.根据权利要求2或3所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构建、筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）样品测序中还包括高通量转录组测序过程，该过程以矮生与蔓生类型豌豆为材料，提取植株总RNA，利用Oligotex® mRNA kit (Qiagen)分离纯化mRNA；以mRNA为模板，反转录合成cDNA；对cDNA 进行扩增，并去除体系中小于300 bp 的片段。

5.一种利用权利要求1 所述的用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合进行豌豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤：

（1）实验材料的准备：选取菜用豌豆进行育苗处理，待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片，用液氮速冻后于-70℃保存．采用试剂盒法提取总DNA；

（2）以步骤（1）获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行PCR 扩增；