CN105039392A

CN105039392A - 一种增加植物寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的方法

Info

Publication number: CN105039392A
Application number: CN201510498422.0A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·贝文; 李云海
Original assignee: PLANT BIOLOGICAL SCIENIC CO Ltd
Current assignee: PLANT BIOLOGICAL SCIENIC CO Ltd; Plant Bioscience Ltd
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2015-11-11
Also published as: CA2702206A1; CA2702206C; PL2201121T3; BRPI0818534B1; WO2009047525A1; CN101855353A; EP2201121B1; CN101855353B; GB0719919D0; EP2201121A1; AU2008309345A1; AU2016202110B2; AU2016202110A1; BRPI0818534A2; HRP20170256T1; MX2010003870A; US20110004962A1; US9624502B2; DK2201121T3; AU2008309345B2

Abstract

本发明涉及一种增加植物寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的方法，具体涉及对控制拟南芥和其它植物的植物种子和器官尺寸的称为DA的调节蛋白的鉴定。对于DA蛋白表达的操控可以用于例如改善作物产量和增加植物生物量。

Description

一种增加植物寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的方法

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/GB2008/003444，中国国家申请号为200880115291.1，申请日为2008年10月10日，发明名称为“植物种子和器官的尺寸的控制方法”。

技术领域

本发明涉及植物种子和器官的尺寸的控制方法，具体涉及一种增加植物寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的方法。

背景技术

种子和器官的尺寸是处于遗传控制下的在农艺学和生态学上重要的性状(Alonso-Blanco,C.ProcNatlAcadSciUSA96,4710-4717(1999)；Song,X.J.NatGenet39,623-630(2007)；Weiss,J.IntJDevBiol49,513-525(2005)；Dinneny,J.R.Development131,1101-1110(2004)；Disch,S.CurrBiol16,272-279(2006)；Science289,85-88(2000)；Horiguchi,G.PlantJ43,68-78(2005)；Hu,YPlantJ47,1-9(2006)；Hu,Y.PlantCell15,1951-1961(2003)；Krizek,B.A.DevGenet25,224-236(1999)；Mizukami,Y.ProcNatlAcadSciUSA97,942-947(2000)；Nath,U.Science299,1404-1407(2003)；Ohno,C.K.Development131,1111-1122(2004)；Szecsi,J.EmboJ25,3912-3920(2006)；White,D.W.ProcNatlAcadSciUSA103,13238-13243(2006)；Horvath,B.M.EmboJ25,4909-4920(2006)；Garcia,D.PlantCell17,52-60(2005))。在给定物种内的种子和器官的最终尺寸是恒定的，而物种间的种子和器官尺寸的变化明显较大，这表明植物具有以协调和适时的方式控制种子和器官生长的调节机制。然而，尽管种子和器官尺寸如此重要，对于控制植物中最终器官和种子尺寸的分子和遗传机制还几乎一无所知。

已经使用数量性状基因座(QTL)作图在包括番茄、大豆、玉米和水稻在内的植物中研究了种子尺寸的遗传调节。迄今为止，在已发表的文献中，已经鉴定出作为水稻谷粒尺寸的两个主要QTL的基础的两个基因(Song,X.J.NatGenet39,623-630(2007)；Fan,C.Theor.Appl.Genet.112,1164-1171(2006))，但这些基因的分子机制仍有待解释。在拟南芥中，已经定位出影响在登录号Ler和Cvi之间的杂交种中的种子重量和/或长度的11个基因座{Alonso-Blanco,1999，见上}，但尚未鉴定出相应的基因。近期研究已经揭示，AP2和ARF2参与了种子尺寸的控制。然而，不幸的是ap2和arf2突变体比野生型的能育性低(Schruff,M.C.Development137,251-261(2006)；Ohto,M.A.Proc.NatnlAcad.SciUSA102,3123-3128(2005)；Jofuku,K.D.Proc.NatnlAcad.Sci.USA102,3117-3122(2005))。另外，使用突变体植物的研究已经鉴定出通过作用于细胞增殖或细胞扩张而影响器官尺寸的数种正向调节物和负向调节物(Krizek,B.A.DevGenet25,224-236(1999)；Mizukami,Y.ProcNatlAcadSciUSA97,942-7(2000)；Nath,U.Science299,1404-1407(2003)；Ohno,C.K.Development131,1111-1122(2004)；Szecsi,J.EmboJ25,3912-3920(2006)；White,D.W.ProcNatlAcadSciUSA103,13238-13243(2006)；Horvath,B.M.EmboJ25,4909-4920(2006)；Garcia,D.PlantCell17,52-60(2005).Horiguchi,G.PlantJ43,68-78(2005)；Hu,YPlantJ47,1-9(2006)；Dinneny,J.R.Development131,1101-1110(2004))。

对于控制种子和器官的最终尺寸的一种或多种因子的鉴定不仅能发展对于植物中的尺寸控制机制的理解，而且还可以具有实质性的实际应用，例如，改善作物产量和用于产生生物燃料的植物生物量。

发明内容

本发明人已鉴定出含UIM和LIM域的蛋白(称为DA1)，该蛋白是通过限制增殖性生长的持续时间而控制种子和器官的最终尺寸的关键调节物。本文显示了充当DAR或DA1相关蛋白的显性负向干扰突变的等位基因(称为da1-1等位基因)。野生型中da1-1突变体基因(R358K)的过表达导致野生型植物中的种子和器官尺寸的增加，从而表明da1-1等位基因以剂量依赖性方式干扰DAR。减弱或消除对E3泛素连接酶进行编码的EOD1/BB的功能的突变协同性地增强da1-1的表型，从而表明DA1与EOD1/BB平行地作用以限制种子和器官的尺寸。对DA1和EOD1/BB的功能性表征提供了对最终种子和器官尺寸的控制机制的深刻认识，并且可以作为用于改善作物产量和增加植物生物量的宝贵工具。

本发明的某些方面提供了分离的DA1蛋白和编码DA1蛋白的分离核酸。此外，本发明还提供了DA1相关蛋白和编码核酸。本文中将DA1蛋白和DA1相关蛋白(DAR)统称为DA蛋白。

本发明的其它方面提供了干扰DA1蛋白和DA1相关蛋白的功能的分离蛋白(DA1R358K)和编码该蛋白的分离核酸。

本发明的另一个方面提供了具有正常能育性但具有选自更长的寿命、增大的器官尺寸、增大的种子尺寸的一种以上特性的植物的生产方法。

本发明的另一个方面提供了具有正常能育性但具有选自更长的寿命、增大的器官尺寸、增大的种子尺寸和这些特性的组合的特性的植物。

附图说明

图1显示了da1-1具有较大的种子和器官。A和B：Col-0的干种(A)和da1-1的干种(B)。C和D：Col-0的成熟胚(C)和da1-1的成熟胚(D)。E和F：9日龄的Col-0的幼苗(E)和da1-1的幼苗(F)。da1-1具有比野生型(WT)更大的子叶。G：Col-0(左)和da1-1(右)的第5叶。与野生型Col-0相比，da1-1具有更大更圆的叶。H和I：Col-0的花(H)和da1-1的花(I)。J和K：Col-0的长角果(J)和da1-1的长角果(K)。L：以mg/100粒种子给出了Col-0、da1-1、da1-ko1、dar1-1和da1-ko1dar1-1的平均种子重量。显示了标准偏差(SD)(n＝5)。植物在相同条件下生长。M～O：Col-0、da1-1、DA1COM#2和35S::DA1^R358K#5的茎直径(M)、茎横截面中的表皮细胞数(N)和花瓣面积(O)。P和Q：35日龄植物的5朵新鲜花(14期)(P)和叶(第1～第7)(Q)的质量。R：Col-0和da1-1中的胚(E)、花瓣(P)和叶(L)的细胞面积。S：通过定量实时RT-PCR测定了Col-0和35S::DA1^R358K#5幼苗中DA1的相对表达水平。比例尺：200μm(A和B)，100μm(C和D)，1mm(E和F)，0.5cm(G)，1mm(H～K)。

图2显示了花瓣和叶生长的运动学分析。A：Col-0和da1-1突变体花瓣的生长。各系列的最大花瓣来自开放的花(14期)。B：野生型和da1-1突变体花瓣中的有丝***指数。(B)中的时间轴对应于(A)中的时间轴。C：Col-0、da1-1、DA1COM#2和35S::DA1^R358K#5的第5叶随时间的生长。DAE是出现后天数。

图3显示了DA1基因的鉴定和表达。A：DA1基因结构，显示出da1-1、sod1-1、sod1-2和sod1-3等位基因的突变位点。指示出起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)。闭合方框指示编码序列，框间线段指示内含子。显示出DA1基因中的T-DNA***位点(da1-ko1、da1-ko2和da1-ko3)。B～G：通过pDA1::GUS转基因表达监测的DA1启动子活性。幼苗(B和C)，胚(D)、根(E)和花瓣(F和G)中的GUS染色。H和I：Col-0(H)和da1-ko1dar1-1双突变体(I)的花。J：Col-0(左)和da1-ko1dar1-1双突变体(右)的长角果。K：Col-0、da1-ko1、dar1-1、da1-ko1dar1-1双突变体的花瓣面积。da1-ko1dar1-1双突变体展示出包含较大的花和花瓣、宽且平的长角果和较短的花柱的da1-1表型。L：定量RT-PCR分析揭示出DA1的表达受到ABA的缓慢诱导。将7日龄野生型幼苗用10μmABA处理2小时、4小时、6小时、18小时和30小时。M和N：在恒定光照条件下野生型Col-0和da1-1种子在带有2μmABA的MS培养基上生长。与野生型Col-0(M)相比，da1-1突变体(N)表现出不对ABA敏感的幼苗建立。O：将4日龄的Col-0(左)、da1-1(中)和DA1COM#2(右)的幼苗转移至带有5μmABA的MS培养基中3周。在抑制野生型Col-0幼苗生长的低水平ABA的存在下，da1-1突变体幼苗继续生长。比例尺：1mm(B、H、I、M和N)，50μm(D和E)，0.5mm(C和J)，0.1mm(F和G)，0.5cm(O)。

图4显示出EOD1/BB中的突变协同地增强了da1-1的表型。A：Col-0、da1-1、eod1-2和eod1-2da1-1双突变体的花。B：Col-0、eod1-2、eod1-2和eod1-2da1-1双突变体的土壤生长植物。C：以mg/100粒种子显示Col-0、da1-1、eod1-2和eod1-2da1-1双突变体的平均种子重量。显示了标准偏差(n＝5)。植物在相同条件下生长。D：Col-0、da1-1、eod1-2和eod1-2da1-1的花瓣面积。显示了标准偏差值(n>50)。E：DA1和EOD1/BB控制种子和器官尺寸的模式。比例尺：2mm(A)，50mm(B)。

图5显示出da1-1具有较大的种子。如补充方法中所述，让来自各种植物的经预先称重的野生型Col-0(A)、da1-1(B)、DA1COM#2(C)、35S::DA1^R358K#5(D)和da1-ko1dar1-1(E)突变体种子批次通过一系列网目尺寸(以μm计)递减的金属丝筛。F：各植株的平均种子重量。给出了标准偏差值(n＝5)。植物在相同条件下生长。

图6显示出野生型和da1-1植物中的种子发育。A～L：用差示反差光学器件(differentialcontrastoptic)成像的野生型(A、C、E、G、I和K)和da1-1(B、D、F、H、J和L)的已空出的胚珠(A、B)和种子(C～L)。比例尺：50μm(A～L)。

图7显示出具有带有额外花瓣的大花和带有额外心皮的长角果的da1-1植物。A：野生型花。B和C：带有额外花瓣的da1-1花。D：野生型长角果。E～G：带有额外心皮的da1-1长角果。比例尺：1mm(A～C)，2mm(D～G)。

图8显示出da1-1突变体具有延长的细胞增殖。A和B：生长于含1％葡萄糖的MS培养基上的野生型(A)和da1-1(B)幼苗的第1叶中pCyclinB1；1::GUS的活性(发芽后9天)。C：通过使用定量实时RT-PCR分析来检测野生型Col-0和da1-1植物的第5叶中的SAG12基因的表达水平。DAE是出现后天数。

图9显示了基于定位图(map-based)的DA1克隆。A：DA1基因座的精细定位图。DA1基因座被定位于染色体1(Chr1)且在标记物T16N11与CER451450之间。DA1基因座进而被缩窄至标记物T29M8-26与F18O14-52之间的30-kb基因组DNA区并且与CAPS标记物DA1CAPS共分离。显示了从F₂植株鉴定的重组体的数目。B：使用CAPS标记物DA1CAPS鉴定出da1-1中的突变。C～D：通过RT-PCR分析揭示了野生型和T-DNA系中的DA1(C)和DAR1(D)的表达水平。

图10显示了拟南芥中的DA1相关蛋白和其它物种中的DA1同源物的鉴定。拟南芥中的DA1相关蛋白显示于图10A中，而其它物种中的DA1相关蛋白显示于图10B中。

图11显示出DA1中的R358K突变是引起种子和器官尺寸增加的原因。A：Col-0、da1-1、da1-ko1、da1-ko2、da1-ko3、da1-1/Col-0F₁、da1-ko1/da1-1F₁、da1-ko2/da1-1F₁、da1-ko3/da1-1F₁、da1-ko1/Col-0F₁、da1-ko2/Col-0F₁、da1-ko3/Col-0F₁和da1-ko1/da1-1F₁的花瓣面积。给出了标准偏差值(n>50)。B：以mg/100粒种子给出了Col-0、da1-1、da1-ko1、da1-ko1/da1-1F₁和da1-ko1/Col-0F₁的平均种子重量。给出了标准偏差值(n＝5)。植物在相同条件下生长。

图12显示出的da1-1增强子中的突变(EOD1/BB)协同地提高了da1-1的大种子和器官表型。A：eod1-1da1-1双突变体与da1-1相比具有增加的种子重量。da1-1和eod1-1da1-1双突变体的平均种子重量以mg/100粒种子给出。显示了标准偏差值(n＝5)。植物在相同条件下生长。B：eod1-1da1-1双突变体具有比da1-1更大的花。C：EOD1/BB基因结构，显示出两个eod1等位基因的突变位点。指示出起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)。封闭方框指示编码序列，框间线段指示内含子。还显示了eod1-1中的突变位点和eod1-2中的T-DNA***位点。D：显示了Col-0、da1-1、eod1-2和eod1-2da1-1植物的8周龄植株。eod2-1da1-1植株比da1-1具有更长的生长期。E：显示了Ler、da1-1^Ler、bb-1和bb-1da1-1^Ler植物的8周龄植株。bb-1da1-1^Ler植株比da1-1^Ler具有更长的生长期。比例尺：1mm(B)，5cm(D和E)。F：Ler、da1-1^Ler、bb-1和bb-1da1-1^Ler双突变体的花瓣面积。显示出标准偏差值(n>50)。BB中的突变协同地提高了da1-1的花瓣尺寸表型，表明DA1和BB在平行的途径中起作用。

图13显示了da1-1与ant-5、axr1-12、ap2-7和arf2-7之间的遗传分析。A和B：与其亲本系相比，ant-5da1-1^Ler和axr1-12da1-1双突变体的花瓣尺寸表型基本是加和性的(additive)。C和D：与其亲本系相比，ap2-7da1-1和arf2-7da1-1双突变体的种子大小表型也基本是加合性的。

图14显示了DA1样蛋白的***发育分析。左图：使用采用缺省设定(蛋白序列进化的JTT模型和邻位相接(neighbour-joining)算法)的PHYLIP软件(版本3.66)创建了距离矩阵***发育树。然后将该***发育树导入MEGA4.0软件以重新排列。通过100次重复获得了自举值(bootstrapvalue)(分支上指示物种分割为由该分支分开的两组的情况在树中出现的次数的数字，仅在大于70时显示)。用于***发育树的数据是全长DA1样蛋白序列的C末端250个氨基酸区域。右图显示了(http://ucjeps.berkeley.edu/TreeofLife/hyperbolic.php)所展示的基于双曲型树的植物进化的简化概况图。与文字相关的进化枝保留在图中。对被分析的物种加了下划线。

图15A～15D显示了Col-0、BrDA1aCOM(35S::BrDA1a转基因系)、OsDA1COM(35S::OsDA1转基因系)和da1-1的长角果。E～H：Col-0、da1-1、BrDA1bCOM(35S::BrDA1b转基因系)和35S::BrDA1a^R/K(在Col-0中过表达35S::BrDA1a^R/K)的莲座叶。I：显示出da1-1的突变位点和T-DNA***位点(da1-ko1、da1-ko2和da1-ko3)的DA1基因结构。

具体实施方式

在各个方面，本发明提供了由DA基因和本文所述的核酸序列编码的分离的DA多肽。

如本文所述，DA多肽包括DA-1多肽和DA-1相关(DAR)多肽及其功能性同源物。

包括DA-1多肽和DA-1相关(DAR)多肽的DA多肽拥有特征性的域结构。

DA多肽可以包含UIM1域和UIM2域。UIM1域可以由SEQIDNO:3的序列组成，而UIM2域可以由SEQIDNO:4的序列组成。

p---pLpbAlpb.Sbp-.ppp(SEQIDNO:3)

p---pLpbAlpb.Sbp-sppp(SEQIDNO:4)

其中：

p是极性氨基酸残基，例如，C、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；

b是大氨基酸残基，例如，E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W或Y；

s是小氨基酸残基，例如，A、C、D、G、N、P、S、T或V；

l是脂肪族氨基酸残基，例如，I、L或V；

.是缺失或任何氨基酸，和

-是任何氨基酸。

下文列出了合适的UIM1和UIM2域序列的实例。UIM1和UIM2域序列的其它实例可以用如本文所述的标准序列分析技术(例如，简单模块结构研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool；SMART)；EMBLHeidelberg，DE)进行鉴定。

DA多肽可以包含LIM域。LIM域可以由SEQIDNO:5的序列组成；

pCs.CscsIhs.....bhlptb.sp.aH...pCFpCs..pCppsLss....p.ab.pcspbaCpps...(SEQIDNO:5)

其中：

c是带电荷的氨基酸残基，例如，D、E、H、K、R；

p是极性氨基酸残基，例如，C、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；

h是疏水性氨基酸残基，例如，A、C、F、G、H、I、L、M、T、V、W和Y；

t是极小氨基酸残基，例如，A、G或S；

a是芳香氨基酸残基，例如，F、H、W或Y；

b是大氨基酸残基，例如，E、F、H、I、K、L、M、Q、R、W或Y；

s是小氨基酸残基，例如，A、C、D、G、N、P、S、T或V；

l是脂肪族氨基酸残基，例如，I、L或V；

.是缺失或任何氨基酸，和

-是任何氨基酸。

下文列出了合适的LIM域序列的实例。LIM域序列的其它实例可以用标准序列分析技术(例如，简单模块结构研究工具(SimpleModularArchitectureResearchTool；SMART)；EMBLHeidelberg，DE)进行鉴定。

DA多肽可以包含与限定DA1的C末端域的SEQIDNO:1的250号～532号残基的氨基酸具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的羧基末端区。

DA多肽还可以在等同于SEQIDNO:1的358位的位置包含R。

使用标准序列分析工具可以容易地鉴定氨基酸序列中等同于SEQIDNO:1的358位的位置。带有处在等同于SEQIDNO:1的358位的位置的R残基的序列的实例显示于本文其它部分。

在某些优选实施方式中，DA多肽可以包含：

SEQIDNO:3的UIM域

SEQIDNO:4的UIM域

SEQIDNO:5的LIM域；和

与SEQIDNO:1的250位～532位残基的具有至少20％的序列同一性的C末端区。

优选的DA多肽还可以在等同于SEQIDNO:1的358位的位置包含R。

例如，DA多肽可以包含选自由SGN-U317073、SGN-U277808、SGN-U325242、AT4G36860、SGN-U209255、ABO82378.1、AT2G39830、CAN69394.1、OS03G16090、9234.M000024、29235.M000021、AT5G66620、AT5G66630、AT5G66610、AT5G66640、AT5G17890、SGN-U320806、ABO96533.1、CAL53532.1、OS06G08400、SGN-U328968、OS03G42820和OS12G40490组成的组的数据库条目中列出的氨基酸序列或者可以是保留了DA活性的这些序列中的一个序列的变异体或片段。

DA多肽可以包含AtDA1、AtDAR1、AtDAR2、AtDAR3、AtDAR4、AtDAR5、AtDAR6、AtDAR7、BrDA1a、BrDA1b、BrDAR1、BrDAR2、BrDAR3-7、BrDAL1、BrDAL2、BrDAL3、OsDA1、OsDAR2、OsDAL3、OsDAL5、PpDAL1、PpDAL2、PpDAL3、PpDAL4、PpDAL5、PpDAL6、PpDAL7、PpDAL8、SmDAL1和SmDAL2的氨基酸序列(如序列比对E中所示)。

DA多肽的序列的数据库条目的其它实例显示于表6和表11中。包括上文所述特征性特点的其它DA多肽序列可以用标准序列分析工具进行鉴定。

在某些优选实施方式中，DA多肽可以包含SEQIDNO:1(AT1G19270；NP_173361.1GI：15221983)的氨基酸序列或者可以是保留了DA活性的该序列的片段或变异体。

作为参照DA序列(例如，SEQIDNO:1或序列比对E中所示序列)的变异体的DA多肽可以包含与参照序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列。

作为SEQIDNO:1的变异体的DA多肽可以包含具有序列QENEDIDRAIALSLLEENQE(SEQIDNO:6)的UIM1域和具有序列DEDEQIARALQESMVVGNSP(SEQIDNO:7)的UIM2域。

作为SEQIDNO:1的变异体的DA多肽可以包含具有以下序列的LIM域：

ICAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPFHKAC(SEQIDNO:8)

特定的氨基酸序列变异体可以以1个、2个、3个、4个、5～10个、10～20个、20～30个、30～50个氨基酸或者超过50个氨基酸的***、添加、取代或缺失而不同于SEQIDNO:1的DA-1多肽。

一般参考GAP算法(WisconsinPackage,Accelerys,SanDiego，美国)来定义序列相似性和同一性。GAP使用Needleman和Wunsch算法来对比两个完整序列，该算法使匹配数最大化而使间隙数最小化。通常使用缺省参数，且间隙创建罚分＝12，间隙延长罚分＝4。

优选使用GAP，但也可使用其它算法，例如，BLAST(使用Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(使用Pearson和Lipman(1988)PNASUSA85:2444-2448的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.MolBiol.147:195-197)或者TBLASTN程序(Altschul等，(1990)，见上)，通常采用缺省参数。特别地，可以使用psi-Blast算法(Nucl.AcidsRes.(1997)253389-3402)。

序列比较可以在本文所述的相关序列的整个长度上进行。

在各个方面，本发明提供了编码如本文所述的DA多肽的DA基因和核酸序列。

例如，编码DA多肽的核酸可以包含选自由SGN-U317073、SGN-U277808、SGN-U325242、AT4G36860、SGN-U209255、ABO82378.1、AT2G39830、CAN69394.1、OS03G16090、9234.M000024、29235.M000021、AT5G66620、AT5G66630、AT5G66610、AT5G66640、AT5G17890、SGN-U320806、ABO96533.1、CAL53532.1、OS06G08400、SGN-U328968、OS03G42820和OS12G40490组成的组的数据库条目中列出的核苷酸序列或者可以是这些序列中的一个序列的变异体或片段。

编码DA多肽的核酸序列的其它数据库条目显示于表7中。

在某些优选实施方式中，编码DA多肽的核酸可以包含SEQIDNO:2的核苷酸序列或SEQIDNO:11～16中的任一个的核苷酸序列，或者可以是编码保留了DA活性的多肽的该序列的变异体或片段。

变异体序列可以为参照DA序列(例如，SEQIDNO:2；SEQIDNO:11～16中的任一个；或具有上文所列的数据库条目的序列)的突变体、同源物或等位基因，并且可以以核酸中的一个或多个核苷酸的一个或多个添加、***、缺失或取代而不同于参照DA序列，从而导致在所编码的多肽中一个或多个氨基酸的添加、***、缺失或取代。当然，也包括对所编码的氨基酸序列不造成任何差异的核酸的改变。编码DA多肽的核酸可以包含与参照DA核酸序列具有至少20％或至少30％、优选至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的序列。序列同一性如上文所述。

片段或变异体可以包含编码功能性DA多肽(即保留了由野生型DA基因编码的多肽的一种或多种功能性特征(例如，调节增殖性生长的持续时间的能力)的多肽)的序列。

包含作为参照DA核酸序列(例如，SEQIDNO:2或者SEQIDNO:11～16中的任一序列)的变异体的核苷酸序列的核酸可以在严格条件下与该核酸序列或其互补物选择性杂交。

例如对于约80％～90％相同的序列的杂交而言，严格条件包括在42℃的0.25MNa₂HPO₄、pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖中杂交过夜并最终在55℃的0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。对于大于约90％相同的序列的检测，合适的条件包括在65℃的0.25MNa₂HPO₄、pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖中杂交过夜并最终在60℃的0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。

可能特别适于植物核酸制备的另一种选择是5×SSPE溶液(最终为0.9MNaCl、0.05M磷酸钠、0.005MEDTA、pH7.7)、5×Denhardt溶液、0.5％SDS在50℃或65℃过夜。必要时可以在65℃的0.2×SSC/0.1％SDS中或50℃～60℃的1×SSC/0.1％SDS中进行洗涤。

本文所述的核酸可以是完全合成或部分合成的。特别地，这些核酸可以是重组的，重组方式为将未共同发现于自然中(不连续延伸)的核酸序列连接或者人工合并。作为另一种选择，可以例如使用自动合成仪来直接合成它们。

当然，核酸可以是双链或单链的，可以是cDNA或基因组DNA或者RNA。根据设计，核酸可以是完全合成的或部分合成的。本领域技术人员自然可以理解，当核酸包含RNA时，对于所示序列的参考应被认为是参考以U取代T的RNA等价物。

在各个方面，本发明提供了显性负向DA多肽和编码核酸。显性负向DA多肽可以在表达于植物中时增加器官尺寸、种子尺寸或寿命中的一项或多项而不会影响能育性。

DA多肽的显性负向等位基因可以包含具有与SEQIDNO:1的358位等同的位置处的突变(例如，取代或缺失)的DA多肽。

例如，DA多肽的显性负向等位基因可以包含与SEQIDNO:1的358位等同的位置处的保守残基R的突变。在优选实施方式中，该保守残基R可以被K取代。

SEQIDNO:1的R358位位于保守C末端区(SEQIDNO:1的250～532号氨基酸)内。可以通过使用标准序列分析和比对工具来比对那些保守C末端区从而进行鉴定位于DA多肽序列中的与SEQIDNO:1的358位等同的位置处的R残基。

编码DA蛋白的显性负向等位基因的核酸可以由任何便利技术生成。例如，可以对编码DA多肽的核酸采用定点突变来改变与SEQIDNO:1的R358等同的位置处的保守R残基，例如，变为K。用于体外突变的试剂和试剂盒可商购。可以如下所述将编码DA蛋白的显性负向等位基因的突变核酸进一步克隆至表达载体内并在植物细胞中表达以改变植物表型。

编码DA多肽的核酸可以在与从中最初将其分离的相同植物物种或品种或者不同的植物物种或品种(例如，异源植物)中表达。

“异源的”是指已经使用基因工程或重组手段(即通过人的干预)来将所讨论的基因/核苷酸序列或调节该被讨论的基因/序列的序列导入植物或其原种的所述细胞内。与植物细胞异源的核苷酸序列可以是不在该类型、品种或物种的细胞中天然存在的(即，外源性的或外来的)，或者可以是不在所述细胞的亚细胞环境或基因组环境中天然存在的序列，或者可以是不是在所述细胞中被天然调节(即与非天然调节元件可操作性连接)的序列。“分离的”是指分离的分子(例如，多肽或核酸)存在于与其在自然中的存在环境不同的环境中。例如，分离的核酸可以是相对于其天然存在的基因组环境基本分离的。分离的核酸可以存在于除了其天然存在的环境以外的其它环境中。

编码本文所述的DA多肽的核酸可以与如启动子(例如，组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育特异性启动子)等异源调节序列可操作性连接。

许多合适的调节序列是本领域内已知的并且可以根据本发明使用。合适的调节序列的实例可以源自植物病毒，例如，以高水平表达于几乎所有植物组织中的花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)基因启动子(Benfey等，(1990)EMBOJ9:1677-1684)。其它合适的组成型调节元件包括花椰菜花叶病毒19S启动子；玄参花叶病毒启动子；和胭脂碱合成酶(nos)基因启动子(Singer等，PlantMol.Biol.14:433(1990)；An,PlantPhysiol.81:86(1986))。

下文中举例说明了用于在强组成型启动子(所述35S启动子)的控制下表达DA基因的构建体，但本领域技术人员可以理解，可以采用各种各样的其它启动子以在特定的环境中获益。

可以采用组织特异性启动子来在特定的组织或器官中表达DA多肽的显性负向形式以增加该组织或器官相对于其中所述组织特异性启动子没有活性和所述DA多肽的显性负向形式没有表达的组织或器官的尺寸。例如，为增加种子的尺寸，可以使用种子特异性启动子使DA多肽的显性负向形式优先表达于种子组织中。例如，可以将所述多肽使用如INO启动子(MeisterR.M.,PlantJournal37:426-438(2004))等珠被特异性启动子表达于发育中的珠被中，或者使用组蛋白H4启动子(DevicM.PlantJournal9；205-215(1996))等胚特异性启动子表达于胚中。

作为另一种选择，或者除此以外，可以选择诱导型启动子。通过这种方式，例如，可以将DA多肽的显性负向形式在特定的时间或位置表达以便获得所需的在器官生长中的变化。可以采用包括醇诱导型AlcA基因表达体系(Roslan等，PlantJournal；2001Oct；28(2):225-35)的诱导型启动子。

可以将DA核酸装载于核酸构建体或载体上。所述构建体或载体优选适于转化至植物细胞内和/或在植物细胞内表达。

载体尤其是双链或单链的线形或环形形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元载体，它们可以是或不是可自身传递或可自身移动的，并且能通过整合至细胞基因组内或在染色体外存在而转化原核或真核宿主、特别是植物宿主(例如，带有复制起点的自主复制质粒)。

具体而言，上述载体包括穿梭载体(shuttlevector)，穿梭载体是指天然地或通过设计而能够在两种不同生物体中复制的DNA载质，所述生物体选自放线菌及相关物种、细菌和真核(例如，高等植物、哺乳动物、酵母菌或真菌)细胞。

包含如上所述的核酸的构建体或载体不必包含启动子或其它调节序列，特别是在如果该载体将被用于将所述核酸导入细胞以便重组至基因组内的情况下。

构建体和载体还可以包含由可赋予如对抗生素的抗性等可选择的表型的基因组成的可选择遗传标记，所述抗生素可以是例如卡那霉素、潮霉素、膦基麦黄酮(phosphinotricin)、氯磺隆、甲氨蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮、草甘膦和d-氨基酸等。

本领域技术人员能很好地为重组基因表达(特别是在植物细胞中的表达)构建载体并设计方案。可以选择或构建含有适当的调节序列的合适载体，所述调节序列包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和适当的其它序列。更详细的内容参见例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:第3版，Sambrook&Russell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。

本领域技术人员能为例如微生物或植物细胞中的重组基因表达构建载体和设计方案。可以选择或构建含有适当的调节序列的合适载体，所述调节序列包括启动子序列、终止子片段、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和适当的其它序列。更详细的内容参见例如MolecularCloning:aLaboratoryManual:第3版，Sambrook等，2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress和ProtocolsinMolecularBiology,第二版，Ausubel等编著，JohnWiley&Sons,1992。在Bevan,Nucl.AcidsRes.(1984)12,8711-8721)以及Guerineau和Mullineaux,(1993)Planttransformationandexpressionvectors(PlantMolecularBiologyLabfax(CroyRRDed)Oxford,BIOSScientificPublishers，第121-148页)中描述了此前极为成功地用于植物的具体步骤和载体。

当将选定基因构建体导入细胞时，必须考虑到本领域技术人员所公知的某些考量。待***的核酸应该被组装到含有可驱动转录的有效调节元件的构建体内。必须存在可利用的将构建体运送至细胞内的方法。一旦构建***于细胞膜内，向内源染色体材料的整合可能会发生也可能不会发生。最后，靶标细胞类型优选能再生为完整植株的细胞。

本领域技术人员还可理解，在生产用于实现本发明的基因的表达的构建体时，理想的是使用可提高编码DA多肽的显性负向形式的核酸的表达的构建体和转化方法。单拷贝基因在植物细胞的基因组内的整合可能有益于使基因沉默效应最小化。类似地，对整合的复杂性的控制在这方面也是有益的。在这方面特别令人感兴趣的是，利用根据例如EP专利第EP1407000B1号(为此通过参考将其并入本文)的最小基因表达构建体来转化植物细胞。

可以使用本领域技术人员公知的技术将核酸构建体和载体导入植物细胞以产生具有本文所述性质的转基因植物。

农杆菌转化是一种由本领域技术人员广泛用于转化木本植物物种、特别是如杨树等阔叶树种的方法。稳定、有能育性的转基因植物的生产现已在本领域中较为常规(参见例如，Toriyama等，(1988)Bio/Technology6,1072-1074；Zhang等，(1988)PlantCellRep.7,379-384；Zhang等，(1988)TheorApplGenet76,835-840；Shimamoto等，(1989)Nature338,274-276；Datta等，(1990)Bio/Technology8,736-740；Christou等，(1991)Bio/Technology9,957-962；Peng等，(1991)InternationalRiceResearchInstitute,Manila,Philippines563-574；Cao等，(1992)PlantCellRep.11,585-591；Li等，(1993)PlantCellRep.12,250-255；Rathore等，(1993)PlantMolecularBiology21,871-884；Fromm等，(1990)Bio/Technology8,833-839；Gordon-Kamm等，(1990)PlantCell2,603-618；D'Halluin等，(1992)PlantCell4,1495-1505；Walters等，(1992)PlantMolecularBiology18,189-200；Koziel等，(1993)Biotechnology11,194-200；Vasil,I.K.(1994)PlantMolecularBiology25,925-937；Weeks等，(1993)PlantPhysiology102,1077-1084；Somers等，(1992)Bio/Technology10,1589-1594；WO92/14828；Nilsson,O.等，(1992)TransgenicResearch1,209-220)。

当农杆菌转化效率低或无效时(例如在某些裸子植物物种中)，可以优选其它方法，例如，微弹(microprojectile)或颗粒轰击(US5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、电穿孔(EP290395、WO8706614)、微注射(WO92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966，Green等，(1987)PlantTissueandCellCulture,AcademicPress)、直接DNA摄入(DE4005152、WO9012096、US4684611)、脂质体介导的DNA摄入(例如，Freeman等，PlantCellPhysiol.29:1353(1984))或涡旋法(例如，Kindle,PNASU.S.A.87:1228(1990d))。

在Oard,1991,Biotech.Adv.9:1-11中回顾了转化植物细胞的物理方法。

作为另一种选择，可以采用不同技术的组合来提高转化过程的效率，例如，采用经农杆菌涂布的微粒的轰击(EP-A-486234)或微弹轰击以诱导创伤其后与农杆菌共培养(EP-A-486233)。

转化后，植物可以例如从单细胞、愈伤组织或叶盘如本领域中标准的那样再生。几乎任何植物都能从该植物的细胞、组织和器官完全再生。在Vasil等，CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,VolI,IIandIII,LaboratoryProceduresandTheirApplications,AcademicPress,1984以及Weissbach和Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989中对可利用技术进行了回顾。

转化技术的具体选择将由其转化特定植物物种的效率以及用特定的选择方法学实施本发明的人员的经验和偏好确定。对于本领域技术人员显而易见，将核酸导入植物细胞的转化体系的具体选择和植物再生技术的选择对于本发明都不是至关重要的，也不是对本发明的限制。

在另一方面，本发明提供了改变植物表型的方法，所述方法包括：

在所述植物细胞内相对于对照植物表达编码显性负向DA多肽的核酸。

合适的显性负向DA多肽和在植物细胞中的表达方法如上所述。

如上所述生成的带有改变的表型的植物与对照植物相比可能具有延长的增殖性生长时期并且可能展示出增加的寿命、增加的器官尺寸和增加的种子尺寸中的一个或多个。优选的是，具有改变的表型的植物的能育性正常。本文所述的方法可能可用于例如增加植物产量、改善作物中的籽粒产量和/或增加例如生物燃料生产中的植物生物量。

本文显示出，DA蛋白的显性负向等位基因的效果通过植物中大哥(BB)蛋白的表达或功能的降低或消除而增强。

大哥(BB)蛋白是已知会抑制植物器官生长的E3泛素连接酶(Disch,2006)。BB蛋白可以包含SEQIDNO:9(At3g63530NP_001030922.1GI:79316205)的氨基酸序列或表9中所示数据库条目的序列，或者可以是保留了BB活性或能干扰BB功能的这些序列中的任何一个序列的片段或变异体。

作为参照BB序列(例如，SEQIDNO:9或表9中所示的数据库条目的序列)的变异体的BB多肽可以包含与参照序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列。序列同一性在上文中有更详细的描述。

特定的氨基酸序列变异体可以以1个、2个、3个、4个、5～10个、10～20个、20～30个、30～50个氨基酸或者超过50个氨基酸的***、添加、取代或缺失而不同于SEQIDNO:9的BB多肽。

在某些实施方式中，BB多肽可以包含处在对应于SEQIDNO:9的44位的位置的A。

编码BB多肽的核酸可以例如包含表10中所示数据库条目中所述的核苷酸或者可以是其变异体或片段。

在某些优选实施方式中，编码BB多肽的核酸可以包含SEQIDNO:10(NM_001035845.1GI:79316204)的核苷酸序列或者可以是编码保留了BB活性的多肽的该序列的变异体或片段。

变异体序列可以是参照BB序列(例如，SEQIDNO:10或具有表10中所列的数据库条目的序列)的突变体、同源物或等位基因，并且可以以一个或多个核苷酸在核酸中的一个或多个添加、***、缺失或取代而不同于参照BB序列，从而导致在所编码的多肽中添加、***、缺失或取代一个或多个氨基酸。当然，也包括对所编码的氨基酸序列不造成任何差异的核酸的改变。编码BB多肽的核酸可以包含与参照BB核酸序列具有至少20％或至少30％、优选至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的序列。序列同一性如上文所述。

片段或变异体可以包含编码功能性BB多肽的序列，所述功能性BB多肽即保留了由野生型BB基因编码的多肽的一种或多种功能性特征(例如，E3泛素连接酶活性)的多肽。

如本文所述的改变植物表型的方法还可以包括减少或消除BB多肽在所述植物中的表达或活性。

这可以增强或提高显性负向DA多肽的表达对器官尺寸、种子尺寸或寿命中的一个项或多项的影响。

用于减少或消除BB多肽在所述植物中的表达或活性的方法是本领域内公知的并且下文中有更详细的描述。

可以通过使植物细胞中编码BB多肽的核酸序列突变并从突变的细胞再生植物从而消除活性蛋白的表达。可以通过***或缺失一个或多个核苷酸来使核酸突变。用于将靶标基因失活或敲除的技术是本领域内公知的。

例如，可以通过在对应于SEQIDNO:9的44位的位置处引入如缺失、***或取代等突变(例如，A至T的取代)来产生BB多肽的EOD1等位基因。BB多肽序列中与SEQIDNO:9的44位等同的位置可以使用标准序列分析和比对工具来进行鉴定。适合用于消除活性蛋白的表达的其它突变将对本领域技术人员非常显而易见。

可以使用抑制技术来减少活性蛋白的表达。对植物细胞中靶标多肽的表达的抑制是本领域内公知的。合适的抑制子核酸可以是以相对于靶标BB基因的反义和/或正义方向***以便实现BB基因表达减少的全部或部分的BB基因的拷贝。参见例如，vanderKrol等，(1990)ThePlantCell2,291-299；Napoli等，(1990)ThePlantCell2,279-289；Zhang等，(1992)ThePlantCell4,1575-1588，和US-A-5,231,020。该方法的进一步改进可见于WO95/34668(Biosource)；Angell&Baulcombe(1997)TheEMBOJournal16,12:3675-3684；和Voinnet&Baulcombe(1997)Nature389:第553页。

在某些实施方式中，抑制子核酸可以是BB多肽表达的正义抑制子。

合适的正义抑制子核酸可以是双链RNA(FireA.等，Nature,Vol391,(1998))。由dsRNA介导的沉默是基因特异性的并且一般称为RNA干扰(RNAi)。RNAi是两步过程。首先，dsRNA在细胞内被切割而产生长度为约21nt～23nt且带有5’末端磷酸根和3’短突出端(约2nt)的短干扰RNA(siRNA)。该siRNA特异性靶向对应的mRNA序列以进行破坏(ZamoreP.D.NatureStructuralBiology,8,9,746-750,(2001))。

siRNA(有时称为微RNA)通过与互补RNA结合并触发mRNA消除(RNAi)或使mRNA至蛋白的翻译停止从而下调基因表达。siRNA可以源自长双链RNA的加工，并且在自然中发现时通常是外源性来源。微干扰RNA(miRNA)是内源性编码的小的非编码RNA，源自短发夹结构的加工。siRNA和miRNA均能不经RNA切割而抑制携带部分互补的靶标序列的mRNA的翻译并且降解携带完全互补的序列的mRNA。

于是，本发明提供了基于BB核酸序列的RNAi序列对抑制DA多肽表达的应用。例如，RNAi序列可以对应于SEQIDNO:10或上文提及的其它BB核酸序列或其变异体的片段。

siRNA分子通常是双链的，并且为了优化经RNA介导的靶标基因功能的下调的有效性，优选的是选择siRNA分子的长度和序列以便确保该siRNA受到RISC复合体的正确识别并且使得siRNA足够短以减少宿主响应，所述RISC复合体介导siRNA对mRNA靶标的识别。

miRNA配体通常是单链的并且具有部分互补从而使该配体能形成发夹结构的区域。miRNA是从DNA转录但没有翻译成蛋白的RNA序列。编码miRNA的DNA序列比该miRNA长。该DNA序列包含所述miRNA序列和近似反向互补物(approximatereversecomplement)。当该DNA序列被转录为单链RNA分子时，miRNA序列及其反向互补物碱基配对而形成部分双链的RNA片段。微RNA序列的设计在John等，PLoSBiology,11(2),1862-1879,2004中进行了讨论。

通常，计划用以模拟siRNA或miRNA的效果的RNA分子具有10～40个核苷酸(或其合成类似物)，更优选为17～30个核苷酸，更优选为19～25个核苷酸，且最优选为21～23个核苷酸。在本发明的采用双链siRNA的某些实施方式中，所述分子可以具有对称的3’突出端(例如，1或2个(核糖)核苷酸)，通常为dTdT的UU3’突出端。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员可以容易地例如使用如AmbionsiRNA查找器(参见http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)等资源来设计合适的siRNA和miRNA序列。siRNA和miRNA序列可以经合成制备并外源性添加来造成基因下调，或者使用表达体系(例如，载体)制备。在一个优选实施方式中，siRNA经合成而生成。

较长双链RNA可以在细胞内被加工以产生siRNA(参见例如，Myers(2003)NatureBiotechnology21:324-328)。较长dsRNA分子可以具有对称的3’或5’突出端(例如，1～2个(核糖)核苷酸)，或者具有平头末端。较长dsRNA分子可以为25个以上的核苷酸。优选的是，较长dsRNA分子的长度为25～30个核苷酸。更优选的是，较长dsRNA分子的长度为25～27个核苷酸。最优选的是，较长dsRNA分子的长度为27个核苷酸。长度为30个核苷酸以上的dsRNA可以使用pDECAP载体进行表达(Shinagawa等，GenesandDev.,17,1340-5,2003)。

另一种选择是在细胞中表达短发夹RNA分子(shRNA)。shRNA比合成的siRNA更加稳定。shRNA由被小的环序列分开的短倒转重复序列组成。一个倒转重复序列是与基因靶标互补的。在细胞中，shRNA被DICER加工为可降解靶标基因mRNA并抑制表达的siRNA。在一个优选实施方式中，shRNA通过从载体的转录而内源性(在细胞内)生成。可以通过在RNA聚合酶III启动子(例如，人H1或7SK启动子)或RNA聚合酶II启动子的控制下用编码shRNA序列的载体转染细胞来在细胞内生成shRNA。作为另一种选择，可以通过从载体转录来外源性地(在体外)合成shRNA。然后可以将shRNA直接导入细胞内。shRNA分子优选包含SHR的部分序列。例如，shRNA序列的长度为40～100个碱基，更优选为40～70个碱基。发夹结构的茎的长度优选为19～30个碱基对。所述茎可以含有G-U配对以稳定发夹结构。

可以通过转录优选包含在载体内的核酸序列来重组制成siRNA分子、较长dsRNA分子或miRNA分子。优选的是，siRNA分子、较长dsRNA分子或miRNA分子包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15的部分序列或其变异体。

在其它实施方式中，抑制子核酸可以是两种以上DA多肽的表达的反义抑制子。在使用反义序列来下调基因表达时，将核苷酸序列置于“反向取向”的启动子的控制下从而转录产生的RNA与从靶标基因的“正义”链转录的正常mRNA互补。参见例如，Rothstein等，1987；Smith等，(1988)Nature334,724-726；Zhang等，(1992)ThePlantCell4,1575-1588,English等，(1996)ThePlantCell8,179-188。反义技术也在Bourque,(1995),PlantScience105,125-149和Flavell(1994)PNASUSA91,3490-3496中得到回顾。

反义抑制子核酸可以包含至少10个核苷酸的反义序列，所述核苷酸来自SEQIDNO:10或上文提及的其它BB序列的片段或其变异体的核苷酸序列。

优选的是，在用于下调靶标序列表达的序列与靶标序列之间可以存在完全序列同一性，但序列的全互补性或相似性不是关键。所用序列可以与靶标基因中的一个或多个核苷酸不同。因此，根据本发明在下调基因表达中采用的序列可以是选自可利用的那些序列的野生型序列(例如，基因)或这类序列的变异体。

所述序列不必包含开放阅读框或者指定可以翻译的RNA。可能优选的是，对于各个反义和正义RNA分子存在足够的同源性以进行杂交。即使在所用序列和靶标基因之间存在约5％、10％、15％或20％以上的错配时，也可能使基因表达下调。有效的是，所述同源性应足以使基因表达的下调发生。

抑制子核酸可以与组织特异性启动子或诱导型启动子可操作性连接。例如，可以使用珠被和种子特异性启动子来特异性下调正在发育的胚珠和种子中的两种以上DA核酸以增加最终种子尺寸。

如本文所述的可抑制BB多肽表达的核酸可以与如启动子等异源调节序列可操作性连接，例如，如上所述的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育特异性启动子。

可以如上所述将构建体或载体转化至植物细胞内并表达。

表达DA多肽的显性负向形式并且必要时减少或消除BB多肽表达的植物可以有性或无性繁殖，或者可以让子代或后代生长。

本发明的另一个方面提供了制备具有改变的表型的植物的方法，所述方法包括：

通过转化的方式将编码显性负向DA多肽的异源核酸引入植物细胞内，和；

由一个或多个转化细胞再生植物。

通过所述方法产生的植物的改变的表型已在上文进行了更详细的说明。所述方法可用于例如产生相对于对照植物具有增加的产量的植物，例如，具有提高的谷粒产量的作物。

在某些实施方式中，方法还可以包括减少或消除BB多肽在植物细胞或植物中的表达或活性。

这可以在引入编码显性负向DA多肽的核酸之前、其同时或之后进行。例如，在某些实施方式中，可以在一个或多个已经引入了编码显性负向DA多肽的核酸的植物细胞中消除或减少BB多肽的表达或活性。在其它实施方式中，可以在一个或多个已消除或减少BB多肽表达的植物细胞内引入编码显性负向DA多肽的核酸。

如此生成的植物在一个或多个其植物细胞中可包含编码显性负向DA多肽的异源核酸并且可以拥有消除或减少的BB多肽表达或活性。

可以如上所述来减少或消除BB多肽的表达或活性。例如，方法可以包括通过转化的方式将异源核酸引入植物细胞，其中所述核酸编码可减少BB多肽表达的抑制子核酸如siRNA或shRNA等。

编码显性负向DA多肽的异源核酸和BB抑制子核酸可以在相同或不同的表达载体上，并且可以通过常规技术被引入植物细胞内。

显性负向DA多肽和BB抑制子核酸已在上文中更详细地进行了说明。

如上所述生成的植物可以有性或无性繁殖或生长以产生子代或后代。从一个或多个细胞再生的植物的子代或后代可以有性或无性繁殖或生长。该植物或其子代或后代可以与其它植物或其自身杂交。

适用于本方法中的植物优选为高等植物，例如，选自由紫草、红豆杉属、烟草、葫芦科植物、胡萝卜、芸苔属植物(vegetablebrassica)、甜瓜、辣椒、葡萄、莴苣、草莓、油菜、甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、马铃薯、胡椒、菊花、香石竹、亚麻、***和黑麦组成的组的农业植物。

本发明的另一个方面提供了表达显性负向DA多肽和可选地减少或消除BB多肽表达的植物，其中所述植物相对于对照展示出改变的表型。

显性负向DA多肽可以是异源多肽。

合适的植物可以通过本文所述的方法产生。

如上所述，与对照植物相比，所述植物可能具有增加的寿命、增加的器官尺寸、增加的增殖性生长持续时间和增加的种子尺寸中的一个或多个。所述植物相对于对照植物可具有正常能育性。

本发明的植物可以是在一种以上的性质上非纯育(breedtrue)的植物。可以根据植物育种者权利(PlantBreedersRight)排除植物物种、特别是可登记植物物种。

除了表达显性负向DA多肽的植物(例如，通过本文所述方法产生的植物)以外，本发明还涵盖了这类植物、种子、自交或杂交子裔和后代的任何克隆体以及它们中任何一个的任何可用于有性或无性繁殖或繁衍的部分或繁殖体(propagule)(例如，插条和种子)。此外，本发明还涵盖了作为所述植物的有性或无性繁殖的子代、克隆体或后代的植物，或者所述植物、子代、克隆体或后代的任何部分或繁殖体。

本发明人已经显示，两种以上的DA多肽的表达或活性的减少或消除还产生了改变的表型，该表型的特征在于正常的能育性以及增加的寿命、增加的器官尺寸、增加的增殖性生长持续时间和增加的种子尺寸中的一个或多个。

本发明的另一个方面提供了改变植物表型的方法，所述方法包括：

减少或消除一个以上的植物细胞中两种以上的活性DA蛋白的表达或活性。

本发明的另一个方面提供了带有改变的表型的植物的生产方法，所述方法包括：

减少或消除植物细胞中两种以上的活性DA蛋白的表达或活性，和；

使植物从所述植物细胞再生。

表达减少或消除后的植物的表型已在上文进行了更详细的描述。

可以通过使植物细胞中编码两种以上DA蛋白的核酸序列突变并使植物从突变的细胞重生来消除活性蛋白的表达。可以通过***或缺失一个以上的核苷酸来使核酸突变。用于靶标基因的失活或敲除技术是本领域内公知的。

可以通过抑制技术来减少植物细胞中靶标多肽的表达。用以抑制植物细胞中靶标多肽表达的抑制子核酸的使用是本领域内公知的并且已在上文进行了更详细的描述。

减少两种以上DA多肽的表达的抑制子核酸可以与组织特异性启动子或诱导型启动子可操作性连接。例如，可以使用珠被和种子特异性启动子来特异性地下调发育中的胚珠和种子中的两种以上DA核酸以便增加最终种子尺寸。

本发明的其它方面涉及DA多肽在植物细胞中的过表达。改变植物表型的方法可以包括：

在所述植物的细胞内表达编码DA多肽的核酸。

所述植物可能具有改变的表型，该表型的特征在于正常的能育性以及与对照植物相比减少的寿命、减小的器官尺寸、减少的增殖性生长持续时间和减小的种子尺寸中的一个或多个。

可以如上文对于显性负向DA多肽所述加以必要变动来在植物细胞中表达编码DA多肽的核酸。

本发明的另一个方面提供了鉴定显性负向DA多肽的方法，所述方法包括：

提供编码DA多肽的分离的核酸，

在所述核酸内引入一个以上的突变，

通过转化的方式将所述核酸导入植物细胞内，

从一个以上的转化细胞使植物再生，和

鉴定再生的植物的表型。

包括正常的能育性以及与对照植物相比增加的寿命、增加的器官尺寸和增加的种子尺寸中的一个或多个在内的改变的表型表明突变的核酸编码显性负向DA等位基因。

本发明的另一个方面提供了显性负向DA多肽的制备方法，所述方法包括：

提供编码植物DA多肽的核酸序列，

鉴定所编码的DA多肽中的与SEQIDNO:1的358位等同的位置处的R残基和

使所述核酸突变以改变所编码的植物DA多肽中的所述R残基，

突变体核酸序列编码显性负向DA多肽。

编码如上所述鉴定或制备的显性负向DA多肽的突变核酸可以用于生成具有如上所述的改变的表型的植物。

本文所用“和/或”应被当作对两个指定特性或成分的每一个与另一个或不与另一个的具体公开。例如，“A和/或B”应被当作(i)A、(ii)B和(iii)A和B各自的具体公开，就如同此处将其单独列出。

除非上下文另外指明，上文所述特点的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式并等同地应用于所描述的所有方面和实施方式。

上文以对本发明进行了一般性描述，现在将通过实施例的方式对本发明的特定方面和实施方式进行说明以扩展本发明的书面说明和实施，并确保本发明的具体实施方式的充分公开。然而，本领域技术人员应该理解，不应将本发明的范围释义为受到这些实施例的具体情况的限制。而是，可以在不背离由本公开所包括的本发明范围的情况下进行这些具体情况的变化、扩展、修改和等价以及这些细节的一般性扩展。因此，为了理解本发明的范围和本文所要求的专有权利，应该参照本公开所附的权利要求(包括其等同形式)。

本说明书中提及的所有文献的全部内容通过参考并入本文。

此外，本说明书中提及的所有数据库条目的全部内容也通过参考并入本文。这包括任何序列在本申请提交日期时的现有版本。

实施例

下文所列数据显示，“DA1”是终止种子和器官生长的关键调节物，并编码含UIM和LIM域的新型蛋白。据显示DA1通过限制增殖性生长的持续时间来控制种子和器官尺寸。da1-1的增强子eod1是bb的等位基因，表明DA1和E3泛素连接酶BB“大哥”(Disch,S.CurrBiol16,272-9(2006)；Science289,85-8(2000))能在平行途径中起作用从而控制种子和植物器官的最终尺寸。DA1和EOD1/BB有可能共享控制种子和器官尺寸的下游组分。

此前的研究已经显示，BB很可能通过标记细胞蛋白以进行降解来充当器官生长的负调节物(Disch,S.Curr.Biol.16,272-279(2006))。DA1含有两个预测的UIM基序，这两个UIM基序可能具有结合泛素和促进泛素化的功能(Hurley,J.H.Biochem.J.399,361-372(2006))。

DA1基因的表达受植物激素脱落酸(ABA)的诱导，且da1-1突变体对ABA不敏感，从而表明ABA通过DA1对器官生长进行负调节。长期以来已经认识到ABA对生长的抑制效果是由对细胞***的抑制造成的(Lui,J.H.Planta194,368-373(1994)，这与ABA能诱导细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂(ICK1)的表达的事实相一致，细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂是细胞周期进展的重要调节物(Wang,H.CellBiol.Int.27,297-299(2003))。在种子发育中，从发育种到成熟种的转变也与种子ABA含量的增加相关(Finkelstein,R.R.PlantCell14增刊S15-45(2002))，表明ABA可能是植物所感知的通过诱导如DA1等负向生长调节物来控制种子和器官的最终尺寸的环境线索之一。本文在此报道，一种所述负向生长调节物是DA1。

通过对abi4-1da1-1和abi5-1da1-1双突变体进行的遗传分析，发现da1-1的大器官尺寸表型不依赖于ABI4和ABI5途径。

本文中还显示出da1-1的抑制子(sod1)是在da1-1突变体基因中具有第二位点突变的据预测会减少基因功能的分子，从而表明DA1中的R358K突变是种子尺寸增加的原因且da1-1等位基因干扰DAR的活性。

本文中还显示，al-1R358K等位基因还以剂量依赖性方式干扰DA1功能，这被在野生型中过表达da1-1等位基因(35S::DA1R358K)的植物具有较大的种子和器官尺寸的事实证实。该结果还表明da1-1突变体基因(DA1R358K)可以用于进行遗传工程化以显著增加种子重量和生物量。

迄今为止，某些展示出较大种子的突变体(例如，ap2和arf2)通常对其能育性和生长具有较强的负向影响(Schruff,M.C.Development137,251-261(2006)；Ohto,M.A.Proc.NatnlAcad.SciUSA102,3123-3128(2005)；Jofuku,K.D.Proc.NatnlAcad.Sci.USA102,3117-3122(2005))。然而，下文所述实验显示，da1-1与野生型相比具有增加的种子质量、较大的器官尺寸但却正常的能育性。

方法

植物材料

将哥伦比亚拟南芥(ArabidopsisthalianaColumbia)(Col-0)入藏物用作野生型。除了Landsbergerecta背景的da1-1Ler和bb-1以外，所有突变体处在Col-0环境下。分析之前，将da1-1和da1-1Ler分别6次回交至Col-0和Ler。从SIGnAL(SalkInstitute)和NASC(Nottingham)获得T-DNA***系。

基因筛选和基于定位图的克隆

从Col-0入藏物的经甲基磺酸乙酯(EMS)处理的M2群体中鉴定出作为新型种子和器官尺寸突变体的da1-1。从da1-1的经甲基磺酸乙酯(EMS)处理的M2群体中分别鉴定出作为da1-1的抑制子和增强子的sod1-1、sod1-2、sod1-3和eod1-1。从Ler/da1-1、Ler/sod1-3da1-1和da1-1Ler/eod1-1da1-1的单交(singlecross)产生了F2定位群体。表2中提供了引物序列的列表。

质粒和转基因植物

生成了以下构建体：DA1COM、35S::DA1-HA、35S::GFP-DA1、35S::DA1-GFP、35S::DA1R358K、pDA1::GUS和35S::EOD1。

形态学和细胞分析

样品制备、测定、显微镜法和β-葡萄糖醛酸糖苷酶活性的组织化学染色使用标准方法进行(JeffersonR.,EMBOJ.EmboJ6,3901-3907(1987)。

DA1限制种子和器官的尺寸

为了鉴定种子和/或器官生长的阻遏物，从拟南芥Col-0入藏物中的EMS诱变群筛选具有较大种子和/或器官尺寸的da突变体(DA在中文中是“大”的意思)进行。da1-1突变体与野生型相比具有较大的种子和器官尺寸但却正常的能育性(图1a～1p)，从而表明种子和器官生长分享公共的调节机制。采用da1-1与野生型植物之间的正反交的遗传分析揭示出da1-1拥有在单核基因座中的突变。

为了揭示野生型和da1-1突变体之间的种子尺寸的差异，通过使用一系列金属丝网筛来对个体野生型和da1-1植株产生的种子进行分级来检验da1-1突变体种子尺寸。来自野生型的种子仅被保留在180μm～300μm孔隙网中，而突变体种子展示出向较大的排除尺寸180μm～355μm的范围偏移(图5a和5b)。超过80％的野生型种子保留在250μm孔隙网中，然而约70％的da1-1种子保留在300μm孔隙网中。为了确定da1-1的种子尺寸的增加是否反映出胚尺寸的变化，从野生型和da1-1突变体种子分离出成熟胚。da1-1成熟胚比野生型的成熟胚明显更丰满和更长(图1c和1d)。观察到da1-1种子的种子腔在整个发育过程中都比野生型的种子腔更大(图6)。另外，da1-1突变体的种子质量增加至野生型的种子质量的132％(表5)。

据发现da1-1植物的能育性正常并且每株da1-1植物的平均种子重量大于每株野生型植物的平均种子重量(图5)。因此，推断出DA1有助于决定拟南芥的种子尺寸和种子重量。此外，还从作物植株鉴定出DA1和DAR相关基因的实例，所述实例表明可以通过进行R358K显性干扰突变或者通过使用上述RNA干扰法减少所选的DA1和DAR相关蛋白的表达来靶向具有相关功能的相关基因。

对DA1是否能以母性地或以合子地起作用进行了研究。如表1所示，仅在母本植株对于突变为纯合子时才观察到da1-1突变对于种子质量的影响。不管花粉供体的基因型如何，由da1-1母本产生的种子都一致性地比母本野生型植株所产生的那些种子更重。相反，da1-1突变体和野生型花粉产生了重量与野生型母本植株相当的种子。这些结果显示，da1-1是影响种子质量的母本效应突变。

除了增加的种子质量以外，da1-1突变体还展示出比野生型更大的器官尺寸(图1e～1m和1o)。与野生型相比，da1-1植物具有较大的花(图1h和1i)，并且该其花往往具有额外的花瓣和心皮(图7)。da1-1花瓣的平均尺寸是可比较的野生型花瓣的约1.6倍(图1o)。与野生型长角果的窄且光滑的圆柱形相比，da1-1突变体的长角果是较宽、变形和扁平的(图1j和1k)。da1-1突变体还形成比野生型更大的子叶和叶以及更粗的茎(图1e～1g、1i和1m)。与此相一致的是，与野生型植物相比，da1-1突变体以花和叶的形式积累了更多的生物量(图1p和1q)。这些结果汇总起来表明DA1限制了拟南芥的种子和器官的尺寸。

DA1限制增殖性生长的持续时间

种子和器官的尺寸由细胞数量和/或尺寸决定。为了了解导致da1-1突变体的较大种子和器官尺寸的参数，对胚、花瓣和叶的细胞尺寸进行了分析。如图1r所示，来自da1-1胚、花瓣和叶的细胞的尺寸与相应的野生型细胞的尺寸相当。da1-1突变体的茎的上皮细胞数增加至野生型的茎的上皮细胞数的180％(图1n)。这些结果表明，经da1-1引发的对种子质量和器官尺寸的影响是由细胞数的增加造成的。

为了确定DA1如何限制种子和器官尺寸，对野生型和da1-1突变体中的胚、花瓣和叶进行了运动学分析。用da1-1突变体和野生型植株自身的花粉粒对其进行人工授粉并检验了种子发育的持续时间。在本发明的生长条件下，大多数野生型种子在受精后8天中发育至干燥期(desiccationstage)，但大多数da1-1种子在受精后10天中发育至成熟期，这表明da1-1突变体的种子发育周期被延长。将花瓣原基和叶的尺寸对时间作图，揭示出da1-1突变体中的器官变大主要是由于更长的生长时期(图2a、2c)。与此相一致的是，与野生型相比，da1-1植物在发育早期具有更幼龄和新鲜的器官以及更长的寿命(图12e、12f)。

为了确定细胞***如何促进所观察到的生长动态，对野生型和突变体中的花瓣和叶的有丝***指数进行了测定。将细胞周期进程的转基因标记物pCYCB1:1::GUS融合物用于比较野生型和da1-1植株的发育中的花瓣中的细胞增殖程度。da1-1花瓣中的细胞比野生型花瓣中的细胞持续增殖了更长的时间(图2b)。类似地，叶细胞中的细胞周期停滞也被延迟(图8)。倍体水平的分析也表明da1-1突变体比野生型更晚退出细胞周期。该结果表明，da1-1展示出延长的细胞增殖。

DA1编码含UIM和LIM域的新型蛋白

使用基于聚合酶链式反应的标记将DA1基因座精细定位至约30千碱基(kb)的区域(图9)。DNA测序揭示出da1-1等位基因带有在与da1-1表型共分离的At1g19270基因中从G至A的单核苷酸突变并且导致预测蛋白的358位氨基酸处精氨酸(R)至赖氨酸(K)的变化(图3a和图9a、9b)。携带有包含整个ORF的6.4-kb野生型基因组片段的二元质粒(DA1COM)和带有35S启动子加At1g19270cDNA的质粒(35S::DA1)能够挽回da1-1突变体的表型(图1i～1q和图2a)，从而证实At1g19270实际上是DA1基因。

据预测DA1编码在N末端处含有两个泛素相互作用基序(UIM)(Hiyama,H.J.Bio.Chem.274,28019-28025(1999))和存在于Lin-11、Isl-1、Mec-3中的一个锌结合域(LIM)(Freyd,G.Nature344,876-879(1990))的532个氨基酸的蛋白(见“序列”)。UIM是具有结合泛素和促进泛素化的双重功能的短肽基序。该基序在整个真核生物中是保守的并且存在于参与包括胞吞、蛋白运输和信号转导的各种各样的细胞过程的多种蛋白中(HurleyJ.H.Biochem.J.399,361-372(2006))。LIM域是密切参与包括细胞骨架组织、器官发育和信号转导的多种基础生物过程的蛋白-蛋白相互作用基序(Dawid,I.B.TrendsGenet.14,156-162(1998)；Dawid,I.B.CRAcad.Sci.III318,295-306(1995)；Kadrmas,J.L.Nat.Rev.Mol.CellBiol.5,920-931(2004))。拟南芥中的7种其它预测蛋白与DA1共享相当大的氨基酸相似性(>30％同一性)并且已被命名为DA1相关蛋白(DAR)(见序列比对D)。DA1和DAR中的保守区位于分子的C末端部分，这表明这些保守区可能对其功能至关重要。与DA1共享有在UIM和LIM之外的显著同源性的蛋白也见于植物和绿藻中，但未见于动物。

通过对含有DA1启动子::GUS融合物(pDA1::GUS)的转基因植物的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)活性的组织化学测试揭示了DA1的空间表达模式。组织化学染色显示出遍及包括子叶、真叶、花和胚的植株中的DA1基因表达(图3b～3h)，这与da1-1突变体植物的大尺寸表型相一致。在增殖组织中检测到了相对较高水平的GUS活性(图3c～3f)。另外，DA1启动子在根中也是活性的(图3b、3c)。至于激素对器官生长的影响，测试了主要的植物激素类别(脱落酸、茉莉酸、乙烯、生长素、细胞***素、赤霉素、油菜素类固醇和葡萄糖)是否能影响DA1基因的转录。DA1基因的表达水平被ABA缓慢诱导(图3m)而不受其它激素诱导，从而表明ABA信号可能参与DA1的调节。与此相一致的是，da1-1突变体对于ABA不敏感(图3n)，从而表明ABA可能是调节DA1基因以限制种子和器官生长的环境线索之一。

在35S启动子的控制下的绿色荧光蛋白(GFP)-DA1翻译融合物挽回了da1-1表型。然而，无法检测到GFP信号。与此相一致的是，也无法使用蛋白印迹检测到过表达带有HA(35::DA1-HA)和GFP(35S::DA1-GFP)标签的DA1的转基因植物的DA1蛋白，从而表明DA1蛋白在植物中被轻易降解或切割。

da1-1充当DA1相关蛋白的显性负向突变类型

为了鉴定决定种子和器官尺寸的最终尺寸的DA1途径的新型成分，筛选了da1-1的大种子和器官尺寸表型的抑制子(sod)并发现定位在原DA1基因座的3个sod1等位基因。对来自这些品系的DA1基因进行测序，发现各包含据预测会减少或消除基因功能的第二位点突变(图3A)。da1-1突变体基因中的该第二位点突变抑制了da1-1表型，表明DA1编码序列内的(R358K)突变产生了较大的种子和器官尺寸。与此相一致的是，经由T-DNA***造成的DA1基因的断裂(da1-ko1、da1-ko2和da1-ko3)没有显示出明显的表型(图10)。为了确定发现于原da1-1等位基因中的一个氨基酸改变是否对于da1-1表型是必须的，将da1-1与野生型或da1-ko系杂交。来自Col-0与da1-1间杂交的所有杂合系(F1)都展示出野生型表型，而来自da1-1与T-DNA系(da1-ko1、da1-ko2和da1-ko3)间杂交的所有F1植株都展示出与da1-1相似的表型(图S9)。另外，在带有35S::DA1R358K转基因的野生型植株中也观察到了da1-1表型(图1i～图1r)。因此，DA1中的R358K突变对导致da1-1表型是必要且充分的。

功能丧失的等位基因不显示出明显的表型。因此，假设DA1可以冗余地与DAR起作用并且da1-1等位基因的表达干扰DAR替代DA1的能力。为了测试该假设，生成了da1-ko1dar1-1双突变体。da1-ko1dar1-1双突变体展示出原始的da1-1表型(图3i～3l，表1和图4e)，从而表明da1-1充当DAR的一类隐性干扰等位基因。在Col-0中过表达da1-1等位基因的植物的大种子和器官尺寸表型表明，da1-1等位基因还以剂量依赖性方式干扰DA1活性(图1i～1q)。

DA1不依赖于ANT、AXR1、ARF2和AP2而与EOD1/BB平行地起作用

在增强子筛选中，分离了一种da1-1的隐性增强子的等位基因(eod1-1)。与da1-1相比，eod1-1da1-1植物展示出更大的种子和器官尺寸、更多的额外花瓣和更长的寿命(图12a、12b)。对eod1-1突变进行定位并发现其与编码E3泛素连接酶并抑制拟南芥的器官生长的大哥(BB)基因(At3g63530)连锁{Disch,2006}。测序揭示出eod1-1等位基因带有在At3g63530中的由G至A的单核苷酸突变并且导致预测BB蛋白的44位氨基酸处由丙氨酸(A)至苏氨酸(T)的改变(图12c)。在内含子(eod1-2)和bb-1中均***T-DNA也增强了da1-1表型(图4和图12d、12e)。带有35S启动子加At3g63530cDNA的二元质粒(35S::EOD1)能挽回eod1突变体的表型，从而表明EOD1是BB基因。为了确定在限制器官尺寸上EOD1/BB与DA1的关系，分析了bb-1突变体中的DA1的mRNA表达水平和da1-1突变体中的BB的mRNA表达水平。与野生型相比，bb-1突变体中的DA1基因表达和da1-1植株中的BB基因表达未受到显著影响(图12a、12b)。

为了理解EOD1/BB与DA1之间的遗传关系，测定了eod1-2da1-1和bb-1da1-1Ler双突变体中的种子和花瓣尺寸，发现EOD1/BB中的突变协同性地增强了da1-1的表型(图4、图11d、11e和图12a)，从而表明两种基因在平行途径中起作用从而限制植物中的种子和器官尺寸。

aintegumenta(ant)等位基因展示出较小的花瓣，而过表达ANT的植物因器官生长期延长展示出器官的增大{Krizek,B.A.DevGenet25,224-36(1999)；Mizukami,Y.ProcNatlAcadSciUSA97,942-7(2000)}，从而表明DA1和ANT能在共同途径中对抗性地起作用。为了对此进行测试，分析了ant突变体中的DA1的mRNA表达水平和da1-1突变体中的ANT及其下游靶标CyclinD3；1的mRNA表达水平。DA1的mRNA水平在ant突变体中没有显示出较强变化(图12b)。类似地，ANT和Cyclin3；1mRNA的水平都没有受到da1-1突变的显著影响，ARGOS的mRNA水平也是如此{Hu,Y.PlantCell15,1951-61(2003)}(图11c、11d、11e)。遗传分析还显示，ant-5da1-1突变体的花瓣尺寸表型基本是加和性的，从而表明DA1和ANT在独立的途径中起作用。由于axr1、arf2和ap2突变体改变了器官和/或种子尺寸，还生成了axr1-12da1-1、arf2-7da1-1和ap2-7da1-1双突变体(Lincoln,C.PlantCell2,1071-1080(1990)；Schruff,M.C.Development137,251-261(2006)；Ohto,M.A.Proc.NatnlAcad.SciUSA102,3123-3128(2005)；Jofuku,K.D.Proc.NatnlAcad.Sci.USA102,3117-3122(2005))。遗传分析揭示，与其亲本系相比，axr1-12da1-1突变体的花瓣尺寸表型或arf2-7da1-1和ap2-7da1-1的种子尺寸表型基本是加和性的(图12b、12c、12d、12e)。因此，推断出DA1可能不依赖于ANT、ARX1、ARF2和AP2而与EOD1/BB平行地起作用。

拟南芥中的DA1蛋白家族

如上所述，据预测DA1基因可编码含有两个泛素受体典型的泛素相互作用基序(UIM)和单个锌结合LIM域的532个氨基酸的蛋白，所述LIM域由其与标准的Lin-11、Isl-1和Mec-3域的保守所限定(Li等，2008)。在拟南芥中，7种其它预测蛋白与DA1共享了相当大的C末端(UIM和LIM域之外)氨基酸相似性，并且已被命名为DA1相关(DAR)蛋白，其中4种(DAR3、DAR5～7)见于染色体5的串联簇中。使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl)对不同的功能域进行表征(见表11)。

UIM是带有结合所必需的两个保守丝氨酸残基的泛素相互作用基序，其与泛素形成短的α螺旋结构(Haglund和Dikic，2005)。LIM是富含半胱氨酸的蛋白相互作用基序，其具有锌结合能力(Freyd等，1990)。NB-ARC(代表“由APAF-1、某些R基因产物和CED-4共有的核苷酸结合衔接子)将蛋白-蛋白相互作用模块与效应物域相连，它是由植物抗性基因产物和动物中的细胞死亡调节剂共享的新型信号传导基序。LRR是富含亮氨酸的重复序列，其为短序列基序并且据认为会参与蛋白-蛋白相互作用。RPW8属于由来自拟南芥的数种广谱抗霉菌蛋白组成的家族。

这些各异的蛋白结构表明该家族具有各异的功能并且近来已被功能性多样化。表11可以用于指导形成双重或三重突变体，例如，DA1、DAR1是相似的且已被表明可冗余地起作用；DA6和DAR7也可能因其相似的结构而与彼此以及DA1和DAR1冗余地起作用。

小立碗藓、江南卷柏、芜菁、二穗短柄草和水稻中的DA1样(DAL)蛋白的表征

使用拟南芥DA1和DAR1～7的氨基酸序列作为查询项来筛选可用小立碗藓、江南卷柏、芜菁、二穗短柄草和水稻数据库。然后使用不同的BLAST算法来选择候选基因以进行初步***发育分析。

早期陆生植物小立碗藓和江南卷柏中的DA1样蛋白

通过使用DA1氨基酸序列作为查询项来在NCBIBLAST中搜索小立碗藓的DA1家族直系同源物，然后在JGIP.patensBLAST(http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/runAlignment？db＝Phypa1_1&advanced＝1)中修正。基于评分、E值和初步***发育分析选择8个基因(PpDAL1～8)。根据SMART(简单分子结构研究工具)程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)，由于缺少N末端的两个UIM域(见图1)，因而所有小立碗藓DA1样蛋白都比DA1氨基酸序列短。江南卷柏测序计划提供了在第一脉管植物中研究DA1家族直系同源性的机会。通过使用JGIS.moellendorffiBLAST(http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/runAlignment？db＝Selmo1&advanced＝1)发现了两种直系同源物，且与小立碗藓DA1样蛋白相比，其具有与拟南芥DA1家族蛋白相似的氨基酸序列长度。LIM域之前的区域被SMART预测为低复杂性区，且没有发现明显的UIM蛋白序列基序。因此可以推断，在低等植物中没有发现特征性DA1蛋白结构。

芜菁中的DA1样蛋白

由于拟南芥和芸苔属的亲密进化关系，使用了核苷酸BLAST法以用于鉴定芸苔属DA1家族直系同源物。在Brassica数据库中(http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/)，使用拟南芥DA1和DAR1～7的全长cDNA序列作为查询项。由于近期的完整基因组复制，一个拟南芥基因可能具有2个或3个芜菁中的同源基因。发现了两个DA1直系同源物和一个DAR2直系同源物(图1)。这些直系同源物称作DAL(DA样)基因。DAR3～7芸苔属直系同源物也见于串联簇中。所发现的芸苔属直系同源物的数目少于预期，这可能是由于不完全的基因组测序造成的。将芸苔属DAL基因的部分序列用于设计引物以对来自芜菁的全长DAL基因进行特异性扩增。

禾本科植物二穗短柄草和水稻中的DA1样蛋白

在二穗短柄草中，鉴定出了3种主要的DA1家族直系同源物，而在水稻中使用NCBI的PROTEINBLAST发现了4种DA1样蛋白。鉴定出水稻DA1和DAR2直系同源物并命名为OsDA1和OsDAR2。没有发现与拟南芥DAR1匹配的水稻基因。

在图14的***发育树中，所有来自脉管植物的DA样蛋白形成一个大的进化枝。在该进化枝中，江南卷柏DA样蛋白是高度发散的，但有可能其DA样蛋白可源自苔藓植物，并从第一脉管植物(石松类植物(Lycophytes))的进化开始充当尺寸调节剂。在该树中，AtDAR2、BrDAR2、BdDAL3和OsDAR2形成了一个进化枝。这些蛋白序列显示出更大的相似性，表明DAR2在单子叶植物起源之前进化(见图14的右图)并且在进化过程中是功能性保守的。另一个进化枝由AtDA1、BrDA1a和BrDA1b构成。它们之间的高度相似性表明芜菁DA1蛋白可能具有与AtDA1相同的功能。由OsDA1、BdDAL1和BdDAL2构成的进化枝与该进化枝分开，表明禾本科植物DA1蛋白可能与十字花科中那些DA1蛋白在功能上稍有分别。所有十字花科DAR1和DAR3～7位于同一进化枝中，表明这些基因可能是在十字花科内在基因组复制中由DA1或DAR2产生。该假设已被部分地由遗传分析证实，这显示出在拟南芥中DA1和DAR1是功能性冗余的。

芜菁、水稻中的DA1样蛋白的功能性分析

在计算机模拟中，鉴定了两个芜菁DA1样基因(BrDA1a,BrDA1b)和一个水稻DA1样基因(OsDA1)。合成了全长cDNA并用定向TOPO载体进行测序。AtDA1、BrDA1a、BrDA1b和OsDA1的预测生化特征如表12所示。这三个基因编码的蛋白具有非常相似的生化特征，特别是两个芸苔属基因。有趣的是，尽管基于氨基酸序列的分析显示BrDA1a与AtDA1更接近，但据预测BrDA1b具有与AtDA1更加相似的生化特性(表12)。

BrDA1a、BrDA1b和OsDA1基因对da1-1表型的挽回

将全长BrDA1a、BrDA1b和OsDA1等的cDNA亚克隆至TOPO载体中并通过LR重组转移至pMDC32二元目的载体(destinationvector)。这些载体表达从组成型35S启动子表达cDNA。对da1-1植株进行转化以测试来自芸苔属和水稻的野生型DAL基因是否能补偿da1-1植株的大生长表型。35S::BrDA1a和35S::OsDA1转基因植株显示出至少部分的补偿(见图15A～15D)。有趣的是，尽管BrDA1b不是与AtDA1最接近的同源物，但35S::BrDA1b转基因植株显示出对da1-1表型的完全补偿(见图15E～15G)，这与其同AtDA1的高度生化相似性相一致(见表12)。进行两轮转化体筛选。在第一轮中，40个35S::BrDA1a的T1植株中的10个和11个35S::OsDA1的T1植株中的3个显示出图15A～15D中的长角果表型。在第二轮中，150个35S::BrDA1b中的30个显示出图15E～15G中的莲座叶表型。这一有说服力的数据说明BrDA1b与拟南芥DA1发挥类似功能。结果，已经显示DA1和相关基因在控制芸苔属和水稻以及可能的许多其它类型植物的器官和种子尺寸上具有相似的功能。

BrDA1a^R358K能干扰Col-0植株中的AtDA1功能

使用定点突变来产生TOPO载体中的BrDA1acDNA中的等价R358K突变，然后用通路***(gatewaysystem)将突变的cDNA转移至pMDC32目的载体。在表达35S::BrDA1a^R358K的野生型Col-0植株中观察到包括大器官表型的典型da1-1表型(见图15E、15F、15H)。在本转化实验中，对60棵T1转基因植株进行筛选并发现其中7棵具有见于da1-1植株中的特征性大器官表型。

DA1蛋白稳定性

已经观察到表达GFP蛋白与全长DA1蛋白的C末端的融合物的转化体可补偿DA1^R358K大器官表型，表明该融合蛋白是全功能性的。然而，在许多转基因系中没有检测到GFP荧光，从而表明DA1GFP蛋白水平极低。这得到了以下观察结果的支持：采用良好特异性抗体在植物提取物中对DA1蛋白的检测极为困难。因此，使用表达于大肠杆菌中的DA1蛋白和来自拟南芥的无细胞蛋白提取物测试了拟南芥中的DA1蛋白的稳定性。将作为N末端GST融合蛋白表达和纯化的全长DA1蛋白与拟南芥蛋白提取物和ATP一同温育，然后使用特异性DA1抗体进行蛋白印迹分析。发现DA1蛋白在这些条件下快速降解。发现一种特异性蛋白酶体抑制剂MG132可消除这种降解。因此，DA1被拟南芥中的蛋白酶体快速降解。基于对动物细胞中UIM功能的认识，预测DA1的UIM基序会参与泛素化。有可能的是，作为生长控制机制的一部分，DA1被泛素化并靶向降解。

表1.DA1母性地起到控制种子重量的作用

表2.基于PCR的分子标记物列表

CAPS或dCAPS标记物的限制酶被标注出，其它为SSLP标记物。

表3.RT-PCR和QRT-PCR引物列表

表4.T-DNA验证用引物列表

表5.DA1控制种子重量

表6

1:CAO61229

未命名蛋白产物[葡萄]

gi|157335399|emb|CAO61229.1|[157335399]

2:EAZ36049

假定蛋白OsJ_019532[水稻(粳稻品种(japonicacultivar)组)]

gi|125596269|gb|EAZ36049.1|[125596269]

3:EAY99923

假定蛋白OsI_021156[水稻(籼稻品种(indicacultivar)组)]

gi|125554318|gb|EAY99923.1|[125554318]

4:NP_001056985

Os06g0182500[水稻(粳稻品种组)]

gi|115466772|ref|NP_001056985.1|[115466772]

5:CAO22922

未命名蛋白产物[葡萄]

gi|157348212|emb|CAO22922.1|[157348212]

6:EAZ21100

假定蛋白OsJ_035309[水稻(粳稻品种组)]

gi|125579954|gb|EAZ21100.1|[125579954]

7:NP_001067188

Os12g0596800[水稻(粳稻品种组)]

gi|115489402|ref|NP_001067188.1|[115489402]

8:CAO22921

未命名蛋白产物[葡萄]

gi|157348211|emb|CAO22921.1|[157348211]

9:AAW34243

假定的含LIM域的蛋白[水稻(粳稻品种组)]

gi|57164484|gb|AAW34243.1|[57164484]

10:AAW34242

假定的含LIM域的蛋白[水稻(粳稻品种组)]

gi|57164483|gb|AAW34242.1|[57164483]

11:NP_001050702

Os03g0626600[水稻(粳稻品种组)]

gi|115454203|ref|NP_001050702.1|[115454203]

12:EAY83760

假定蛋白OsI_037719[水稻(籼稻品种组)]

gi|125537272|gb|EAY83760.1|[125537272]

13:EAZ27845

假定蛋白OsJ_011328[水稻(粳稻品种组)]

gi|125587181|gb|EAZ27845.1|[125587181]

14:NP_001049668

Os03g0267800[水稻(粳稻品种组)]

gi|115452135|ref|NP_001049668.1|[115452135]

15:EAY91080

假定蛋白OsI_012313[水稻(籼稻品种组)]

gi|125544941|gb|EAY91080.1|[125544941]

16:AAP06895

假定蛋白[水稻(粳稻品种组)]

gi|29893641|gb|AAP06895.1|[29893641]

17:EAY89390

假定蛋白OsI_010623[水稻(籼稻品种组)]

gi|125543251|gb|EAY89390.1|[125543251]

18:CAO16347

未命名蛋白产物[葡萄]

gi|157346464|emb|CAO16347.1|[157346464]

19:CAN64300

假定蛋白[葡萄]

gi|147817187|emb|CAN64300.1|[147817187]

20:CAN69394

假定蛋白[葡萄]

gi|147768077|emb|CAN69394.1|[147768077]

表7

水稻(粳稻品种组)Os06g0182500(Os06g0182500)mRNA,完整cds

gi|115466771|ref|NM_001063520.1|[115466771]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:001-201-F10,全***序列

gi|32990928|dbj|AK105719.1|[32990928]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J023004G21,全***序列

gi|32979080|dbj|AK069056.1|[32979080]

水稻(粳稻品种组)Os12g0596800(Os12g0596800)mRNA,完整cds

gi|115489401|ref|NM_001073720.1|[115489401]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J013039D10,全***序列

gi|32975778|dbj|AK065760.1|[32975778]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J013073O11,全***序列

gi|32976683|dbj|AK066665.1|[32976683]

水稻(粳稻品种组)Os03g0626600(Os03g0626600)mRNA,部分cds

gi|115454202|ref|NM_001057237.1|[115454202]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:001-043-H07,全***序列

gi|32972053|dbj|AK062035.1|[32972053]

水稻(粳稻品种组)Os03g0267800(Os03g0267800)mRNA,完整cds

gi|115452134|ref|NM_001056203.1|[115452134]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J023020C05,全***序列

gi|32979610|dbj|AK069586.1|[32979610]

水稻(粳稻品种组)分离体29050未知mRNA

gi|29368349|gb|AY224559.1|[29368349]

水稻(粳稻品种组)分离体29050抗疾病样蛋白mRNA,部分cds

gi|29367476|gb|AY224475.1|[29367476]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体6

gi|58531193|dbj|AP008212.1|[58531193]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体6,BAC克隆体:OSJNBb0036B04

gi|50657316|dbj|AP007226.1|[50657316]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体12

gi|58531199|dbj|AP008218.1|[58531199]

水稻染色体12,来自水稻的粳稻亚种的日本晴品种(cultivarNipponbare)的染色体12的OSJNBa库的.BACOSJNBa0056D07，完整序列

gi|23897123|emb|AL928754.2|[23897123]

水稻染色体12,来自水稻的粳稻亚种的日本晴品种的染色体12的Monsanto库的.BACOJ1306_H03，完整序列

gi|20513132|emb|AL713904.3|[20513132]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体3

gi|58530789|dbj|AP008209.1|[58530789]

水稻(粳稻品种组)染色体3克隆体OSJNBa0002I03映射图E1419S,完整序列

gi|57164481|gb|AC091246.8|[57164481]

水稻(粳稻品种组)染色体3克隆体OJA1364E02,完整序列

gi|27901829|gb|AC139168.1|[27901829]

水稻(粳稻品种组)染色体3克隆体OJ1364E02,完整序列

gi|27901828|gb|AC135208.3|[27901828]

水稻染色体3BACOSJNBb0013K08基因组序列，完整序列

gi|16356889|gb|AC092390.3|[16356889]

水稻(籼稻品种组)克隆体OSE-97-192-H5Zn离子结合蛋白mRNA,部分cds

gi|149390776|gb|EF575818.1|[149390776]

水稻(籼稻品种组)cDNA克隆体:OSIGCRA102J03,全***序列

gi|116633496|emb|CT833300.1|[116633496]

水稻(粳稻品种组)Os01g0916000(Os01g0916000)mRNA,完整cds

gi|115441820|ref|NM_001051725.1|[115441820]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体1

gi|58530787|dbj|AP008207.1|[58530787]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体1,PAC克隆体:P0413C03

gi|19386744|dbj|AP003451.4|[19386744]

水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体1,PAC克隆体:P0004D12

gi|20804980|dbj|AP003433.3|[20804980]

水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:002-101-C04,全***序列

gi|32991509|dbj|AK106300.1|[32991509]

水稻(粳稻品种组)cDNA，克隆体:J100024O13,全***序列

gi|116012466|dbj|AK243101.1|[116012466]

玉米克隆体EL01N0524A08.dmRNA序列

gi|54653541|gb|BT018760.1|[54653541]

玉米PCO156068mRNA序列

gi|21212590|gb|AY109151.1|[21212590]

玉米克隆体EL01N0553E07mRNA序列

gi|85540336|gb|BT024085.1|[85540336]

玉米克隆体E04912705F06.cmRNA序列

gi|54651736|gb|BT016955.1|[54651736]

玉米硝酸还原酶基因，启动子区

gi|4894987|gb|AF141939.1|AF141939[4894987]

大麦亚种大麦cDNA克隆体:FLbaf82h16,mRNA序列

gi|151419042|dbj|AK250393.1|[151419042]

葡萄，全基因组鸟枪序列，重叠群VV78X106678.4，克隆体ENTAV115

gi|123680846|emb|AM488121.1|[123680846]

葡萄重叠群VV78X222701.5，全基因组鸟枪序列

gi|147817185|emb|AM484789.2|[147817185]

葡萄，全基因组鸟枪序列,重叠群VV78X165152.5，克隆体ENTAV115

gi|123703056|emb|AM483648.1|[123703056]

葡萄重叠群VV78X263569.4，全基因组鸟枪序列

gi|147790377|emb|AM453516.2|[147790377]

葡萄重叠群VV78X179395.3，全基因组鸟枪序列

gi|147769864|emb|AM456337.2|[147769864]

葡萄重叠群VV78X219892.2，全基因组鸟枪序列

gi|147780236|emb|AM461946.2|[147780236]

葡萄，全基因组鸟枪序列,重叠群VV78X014445.8，克隆体ENTAV115

gi|123704690|emb|AM483793.1|[123704690]

葡萄重叠群VV78X193742.9，全基因组鸟枪序列

gi|147768076|emb|AM435996.2|[147768076]

百脉根基因组DNA,染色体2,克隆体:LjB06D23,BM0787,完整序列

gi|37591131|dbj|AP006541.1|[37591131]

冰草分离体Bsy1y型高分子量麦谷蛋白亚基假基因，完整序列

gi|71159564|gb|DQ073532.1|[71159564]

冰草分离体Bty1y型高分子量麦谷蛋白亚基假基因，完整序列

gi|71159568|gb|DQ073535.1|[71159568]

冰草分离体Bfy1y型高分子量麦谷蛋白亚基假基因，完整序列

gi|71159563|gb|DQ073531.1|[71159563]

火炬松假定细胞壁蛋白(lp5)基因，完整cds

gi|2317763|gb|AF013805.1|[2317763]

芜菁亚种白菜克隆体KBrH011G10,完整序列

gi|110797257|gb|AC189577.1|[110797257]

芜菁亚种白菜克隆体KBrB032C14,完整序列

gi|110796986|gb|AC189306.1|[110796986]

芜菁亚种白菜克隆体KBrB011P07,完整序列

gi|110744010|gb|AC189225.1|[110744010]

杨树cDNA序列

gi|115416791|emb|CT029673.1|[115416791]

杨树cDNA序列

gi|115416790|emb|CT029672.1|[115416790]

小果咖啡微卫星DNA，克隆体26-4CTG

gi|13398992|emb|AJ308799.1|[13398992]

蒺藜苜蓿克隆体mth2-34m14,完整序列

gi|61675739|gb|AC126779.19|[61675739]

蒺藜苜蓿染色体5克隆体mth2-5p5,完整序列

gi|119359633|emb|CU302347.1|[119359633]

蒺藜苜蓿染色体8克隆体mth2-14m21,完整序列

gi|50355770|gb|AC148241.21|[50355770]

番茄cDNA，克隆体:LEFL1035BC02,叶中的HTC

gi|148538338|dbj|AK247104.1|[148538338]

多斑沟酸浆克隆体MGBa-44P14,完整序列

gi|150010729|gb|AC182564.2|[150010729]

多斑沟酸浆克隆体MGBa-64L10,完整序列

gi|154350257|gb|AC182570.2|[154350257]

江南卷柏克隆体JGIASXY-5I19,完整序列

gi|62510100|gb|AC158187.2|[62510100]

来自染色体3上的克隆体MTH2-170H18的蒺藜苜蓿DNA序列，完整序列

gi|115635794|emb|CT967314.8|[115635794]

豇豆谷蛋白2mRNA,部分cds

gi|4973069|gb|AF142332.1|AF142332[4973069]

表8

大豆cDNA克隆体

gb|CX711863.1|CX711863

gb|BM525343.1|BM525343

gb|BG156297.1|BG156297

gb|BM308148.1|BM308148

gb|AI856660.1|AI856660

gb|BF596520.1|BF596520

gb|BI472193.1|BI472193

gb|CO982042.1|CO982042

gb|BM143278.1|BM143278

gb|AW831270.1|AW831270

gb|BE329874.1|BE329874

gb|BG652163.1|BG652163

gb|BI967821.1|BI967821

gb|BI321493.1|BI321493

gb|BU546579.1|BU546579

gb|CO984945.1|CO984945

gb|DW247614.1|DW247614

gb|BG726202.1|BG726202

gb|BI968915.1|BI968915

gb|BG043212.1|BG043212

gb|BG510065.1|BG510065

gb|BG043153.1|BG043153

gb|AW832591.1|AW832591

gb|AI856369.1|AI856369

gb|BI699452.1|BI699452

gb|BG650019.1|BG650019

gb|AW234002.1|AW234002

gb|AW310220.1|AW310220

gb|AW394699.1|AW394699

gb|AW832462.1|AW832462

gb|AW459788.1|AW459788

gb|BM731310.1|BM731310

gb|BI317518.1|BI317518

gb|AI988431.1|AI988431

gb|CA801874.1|CA801874

gb|BE057592.1|BE057592

gb|AW102002.1|AW102002

gb|CA938750.1|CA938750

gb|AW397679.1|AW397679

表9.由Blastp鉴定的BB多肽

emb|CAO40855.1|未命名蛋白产物[葡萄]

gb|EAY88740.1|假定蛋白OsI_009973[水稻(籼稻品种组)]

gb|EAZ25768.1|假定蛋白OsJ_009251[水稻(粳稻品种组)]

ref|NP_001049123.1|Os03g0173900[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAO21927.1|未命名蛋白产物[葡萄]

emb|CAD41576.3|OSJNBa0088I22.8[水稻(粳稻品种组)]

gb|EAY95219.1|假定蛋白OsI_016452[水稻(籼稻品种组)]

emb|CAH67282.1|OSIGBa0111L12.9[水稻(籼稻品种组)]

ref|NP_001053604.1|Os04g0571200[水稻(粳稻品种组)]

ref|NP_001063719.1|Os09g0525400[水稻(粳稻品种组)]

gb|EAZ09811.1|假定蛋白OsI_031043[水稻(籼稻品种组)]

gb|EAZ45411.1|假定蛋白OsJ_028894[水稻(粳稻品种组)]

ref|NP_001062434.1|Os08g0548300[水稻(粳稻品种组)]

gb|EAZ07897.1|假定蛋白OsI_029129[水稻(籼稻品种组)]

ref|NP_001063778.1|Os09g0535100[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAC10211.1|假定蛋白[鹰嘴豆]

emb|CAO44394.1|未命名蛋白产物[葡萄]

gb|ABG73441.1|锌指C3HC4型家族蛋白[短药野生稻]

ref|NP_001056653.1|Os06g0125800[水稻(粳稻品种组)]

gb|EAZ09879.1|假定蛋白OsI_031111[水稻(籼稻品种组)]

gb|EAZ45482.1|假定蛋白OsJ_028965[水稻(粳稻品种组)]

dbj|BAD82497.1|RING-H2指蛋白RHG1a样[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAN71989.1|假定蛋白[葡萄]

dbj|BAD05399.1|DNA结合锌指蛋白样[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAH65886.1|OSIGBa0148J22.5[水稻(籼稻品种组)]

emb|CAE02518.2|OSJNBb0003A12.5[水稻(粳稻品种组)]

ref|NP_001052192.1|Os04g0185500[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAO71872.1|未命名蛋白产物[葡萄]

emb|CAO39354.1|未命名蛋白产物[葡萄]

emb|CAE01827.2|OSJNBa0041A02.20[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAO71869.1|未命名蛋白产物[葡萄]

emb|CAA85320.1|C末端锌指[大豆]

gb|EAZ08608.1|假定蛋白OsI_029840[水稻(籼稻品种组)]

gb|EAY75305.1|假定蛋白OsI_003152[水稻(籼稻品种组)]

ref|NP_001043810.1|Os01g0667700[水稻(粳稻品种组)]

dbj|BAD73651.1|RING指蛋白样[水稻(粳稻品种组)]

emb|CAO71875.1|未命名蛋白产物[葡萄]

ref|NP_001062870.1|Os09g0323100[水稻(粳稻品种组)]

gb|EAZ35180.1|假定蛋白OsJ_018663[水稻(粳稻品种组)]

dbj|BAA74802.1|DNA结合锌指蛋白(Pspzf)[豌豆]

ref|NP_001056239.1|Os05g0550000[水稻(粳稻品种组)]

gb|EAY98923.1|假定蛋白OsI_020156[水稻(籼稻品种组)]

emb|CAN83345.1|假定蛋白[葡萄]

emb|CAO43928.1|未命名蛋白产物[葡萄]

emb|CAN79375.1|假定蛋白[葡萄]

表10.由tBlastn鉴定的编码BB多肽的核酸

ref|NM_001055658.1|水稻(粳稻品种组)Os03g0173900(Os03g0173900)mRNA,完整cds

dbj|AK063978.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:001-124-C08,全***序列

dbj|AP006425.1|百脉根基因组DNA,染色体1,克隆体:LjT39B10,TM0315,完整序列

gb|AY110224.1|玉米CL5837_1mRNA序列

ref|NM_001060139.1|水稻(粳稻品种组)Os04g0571200(Os04g0571200)mRNA,部分cds

dbj|AK071401.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J023097G23,全***序列

ref|NM_001068969.1|水稻(粳稻品种组)Os08g0548300(Os08g0548300)mRNA,完整cds

dbj|AK073266.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J033029A20,全***序列

emb|CT832808.1|水稻(籼稻品种组)cDNA克隆体:OSIGCSN035L02,全***序列

ref|NM_001070254.1|水稻(粳稻品种组)Os09g0525400(Os09g0525400)mRNA,完整cds

dbj|AK104112.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:006-202-G09,全***序列

dbj|AK066238.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J013059J01,全***序列

emb|CT832015.1|水稻(籼稻品种组)cDNA克隆体:OSIGCRA126H24,全***序列

dbj|AK250973.1|大麦亚种大麦cDNA克隆体:FLbaf101a03,mRNA序列

dbj|AK249803.1|大麦亚种大麦cDNA克隆体:FLbaf58c16,mRNA序列

emb|CT832014.1|水稻(籼稻品种组)cDNA克隆体:OSIGCRA115D08,全***序列

gb|BT016451.1|玉米克隆体Contig284mRNA序列

emb|AJ299062.1|假定蛋白(ORF1)用CAR299062鹰嘴豆部分mRNA，克隆体Can183

gb|AY109631.1|玉米CL5026_1mRNA序列

gb|AY108288.1|玉米PCO148716mRNA序列

ref|NM_001070313.1|水稻(粳稻品种组)Os09g0535100(Os09g0535100)mRNA,完整cds

dbj|AK069888.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J023039O04,全***序列

gb|AY103990.1|玉米PCO093361mRNA序列

emb|AM485242.1|葡萄，全基因组鸟枪序列,重叠群VV78X218805.2，克隆体ENTAV115

gb|BT018037.1|玉米克隆体EL01N0530G02.cmRNA序列

emb|CT829435.1|水稻(籼稻品种组)cDNA克隆体:OSIGCRA107A15,全***序列

ref|NM_001063188.1|水稻(粳稻品种组)Os06g0125800(Os06g0125800)mRNA,完整cds

gb|AY225189.1|水稻(籼稻品种组)锌指蛋白mRNA,完整cds

gb|AY207044.1|水稻(籼稻品种组)锌指蛋白mRNA,完整cds

dbj|AK104425.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:006-205-F10,全***序列

dbj|AK068302.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J013144A04,全***序列

gb|AY112568.1|玉米CL32837_1mRNA序列

emb|AM453896.2|葡萄重叠群VV78X100953.6，全基因组鸟枪序列

gb|AC157490.18|蒺藜苜蓿克隆体mth2-123f23,完整序列

gb|AC151824.13|蒺藜苜蓿克隆体mth2-45n18,完整序列

ref|NM_001058727.1|水稻(粳稻品种组)Os04g0185500(Os04g0185500)mRNA,完整cds

gb|BT019187.1|玉米克隆体Contig858.FmRNA序列

dbj|AK064939.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J013000P06,

gb|AY110468.1|玉米CL16240_2mRNA序列

gb|AY110685.1|玉米CL9024_1mRNA序列

dbj|AK246964.1|番茄cDNA，克隆体:LEFL1004CA06,叶中的HTC

dbj|AP008214.1|水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体

ref|NM_001050479.1|水稻(粳稻品种组)Os01g0692700(Os01g0692700)mRNA,部分cds

dbj|AK065626.1|水稻(粳稻品种组)cDNA克隆体:J013028F14,

dbj|AP004704.3|水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体8,PAC克隆体:P0544G09

dbj|AP006265.2|水稻(粳稻品种组)基因组DNA,染色体8,BAC克隆体:OJ1112_E06表11

表12

序列

MGWFNKIFKGSNQRLRVGNNKHNHNVYYDNYPTASHDDEPSAADTDADNDEPHHTQEPSTSEDNTSNDQENEDIDRAIALSLLEENQEQTSISGKYSMPVDEDEQLARALQESMVVGNSPRHKSGSTYDNGNAYGAGDLYGNGHMYGGGNVYANGDIYYPRPITFQMDFRICAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPFHKACYRERYHPKCDVCSHFIPTNHAGLIEYRAHPFWVQKYCPSHEHDATPRCCSCERMEPRNTRYVELNDGRKLCLECLDSAVMDTMQCQPLYLQIQNFYEGLNMKVEQEVPLLLVERQALNEAREGEKNGHYHMPETRGLCLSEEQTVSTVRKRSKHGTGKWAGNITEPYKLTRQCEVTAILILFGLPRLLTGSILAHEMMHAWMRLKGFRTLSQDVEEGICQVMAHKWLDAELAAGSTNSNAASSSSSSQGLKKGPRSQYERKLGEFFKHQIESDASPVYGDGFRAGRLAVHKYGLRKTLEHIQMTGRFPV

SEQIDNO:1

atgggttggtttaacaagatctttaaaggctctaaccaaaggctccgggttgggaataat

aagcacaatcacaatgtttattacgataattatccgactgcttcacatgatgatgagcct

agtgcggcggatacagatgctgataatgatgaacctcatcatactcaggaaccatctaca

tctgaggataatacatcgaatgaccaggaaaatgaagacatagaccgtgcaattgcattg

tcgcttttagaagagaatcaagaacagacaagtataagcgggaaatactcgatgccggtg

gatgaagatgagcaacttgctagagccctacaagaaagtatggtagttgggaattcaccc

cgtcacaaaagtggaagtacatatgataatgggaatgcatatggagctggagatttatat

gggaatggacatatgtatggaggaggaaatgtatatgcaaatggagatatttattatcca

agacctattacttttcaaatggatttcaggatttgtgctggctgtaatatggagattggc

catggaagatttctgaattgccttaattcactatggcatccagaatgttttcgatgttat

ggctgcagtcagccgatttctgagtacgagttttcaacatcagggaactacccttttcac

aaggcttgttacagggagagatatcatcctaaatgtgatgtctgcagccactttatacca

acaaatcatgctggtcttattgaatatagggcacatcctttttgggttcagaagtattgt

ccttctcacgaacacgatgctaccccgagatgttgcagttgtgaaagaatggagccacgg

aatacgagatatgttgaacttaacgatggacggaaactttgccttgagtgtttggactcg

gcggtcatggacaccatgcaatgccaacctctgtacttgcaaatacaaaatttctatgaa

ggactcaacatgaaggtagagcaggaagttccactcctcttggttgagagacaagcactt

aacgaagccagagaaggtgaaaagaatggtcactatcacatgccagaaacaagaggactc

tgcctttcagaagaacaaactgttagtactgtaagaaagcgatcaaagcatggcacagga

aaatgggccgggaatattacagaaccttacaagttaacacggcaatgtgaagttaccgcc

attctcatcttattcgggctccctaggttacttactggttcgattctagctcatgagatg

atgcatgcgtggatgaggctcaaaggattccgaacactgagccaagatgttgaagaaggt

atatgtcaagtgatggctcataaatggttagatgctgagttagctgctggttcaacaaat

agcaatgctgcatcatcatcctcctcttctcaaggactgaaaaagggaccgagatctcag

tacgagagaaagcttggtgagtttttcaagcaccaaatcgagtctgatgcttctccggtt

tatggagacgggttcagagctgggaggttagctgttcacaagtacggtttgcgaaaaaca

cttgagcatatacagatgaccggtagattcccggtttaa

SEQIDNO:2

p---pLpbAlpb.Sbp-.ppp

SEQIDNO:3

p---pLpbAlpb.Sbp-sppp

SEQIDNO:4

pCs.CscsIhs.....bhlptb.sp.aH...pCFpCs..pCppsLss....p.ab.pcspbaCpps...

其中：

C是带电荷的氨基酸残基，例如，D、E、H、K、R；

p是极性氨基酸残基，例如，C、D、E、H、K、N、Q、R、S或T；

t是极小氨基酸残基，例如，A、G或S；

a是芳香性氨基酸残基，例如，F、H、W或Y；

b是大氨基酸残基，例如，E、F、H、I、K、L、M、Q、R、WorY；

s是小氨基酸残基，例如，A、C、D、G、N、P、S、TorV；

l是脂肪族氨基酸残基，例如，I、LorV；

.是缺失或任何氨基酸；和

-是任何氨基酸。

SEQIDNO:5

QENEDIDRAIALSLLEENQE

SEQIDNO:6

DEDEQIARALQESMVVGNSP

SEQIDNO:7

ICAGCNMEIGHGRFLNCLNSLWHPECFRCYGCSQPISEYEFSTSGNYPFHKAC

SEQIDNO:8

SEQIDNO:9

SEQIDNO:10

SEQIDNO:11(OsDAR2)

SEQIDNO:12(BrDAR1)

SEQIDNO:13(BrDAR2)

SEQIDNO:14BrDAR3-7

SEQIDNO:15BrDA1b

SEQIDNO:16BrDA1a

SEQIDNO:17OsDA1

序列比对

A.DA1的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和核苷酸序列(SEQIDNO:2)和da1-1、sod1-1、sod1-2和sod1-3的突变位点。

显示了通过使用SMART软件预测的域。

B.不同的含UIM基序的蛋白之间的UIM基序的比对。通过使用SMART软件预测UIM基序。所预测的UIM1(E值，6.39e-02)和UIM2(E值，7.34e-02)序列显示于A中。

C.含LIM域的蛋白之间的LIM域比对。在LIM域中，存在数个保守的半胱氨酸残基和一个保守组氨酸。这些保守残基所遵循的排列是C-x(2)-C-x(16,23)-H-x(2)-[CH]-x(2)-C-x(2)-C-x(16,21)-C-x(2,3)-[CHD]。LIM域(E值，3.05e-10)使用SMART软件进行预测并且显示于A中。

D.拟南芥中的DA1和DA1相关蛋白的比对。DA1与DAR当中的保守区域是在其C末端区中。da1-1等位基因具有在基因At1g19270中的G至A的单核苷酸转变，且据预测其导致358位处的保守氨基酸从精氨酸(R)变为赖氨酸(K)。星号表示比对中相同的氨基酸残基。冒号表示比对中的保守取代，“.”表示比对中的半保守取代。

E.DA1样蛋白的氨基酸比对。采用缺省设置的ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)来对来自小立碗藓(Pp)、江南卷柏(Sm)、芜菁(Br)、拟南芥(At)、二穗短柄草(Bd)和水稻(Os)的DA1样蛋白的全长氨基酸序列进行比对，并在VectorNTi中编辑显示设置。红色箭头显示da1-1等位基因中的突变。DAL代表DA1样蛋白。

序列比对B

UIM1

UIM2

序列比对C

LIM

CHROMA所用彩色代码的说明

序列比对D

da1-1(R/K)

序列比对E

Claims

1.一种增加植物寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的方法，所述方法包括：

在所述植物的细胞内表达编码显性负向DA多肽的核酸，

其中所述显性负向DA多肽具有在所述显性负向DA多肽的氨基酸序列的与SEQIDNO:1的358位等同的位置处R被K取代的突变，并且

(a)所述DA多肽由对选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:309、SEQIDNO:310和SEQIDNO:317组成的组中的氨基酸序列进行一个或数个氨基酸的添加、取代、缺失和/或***而获得的氨基酸序列组成；

(b)所述DA多肽由与选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:309、SEQIDNO:310和SEQIDNO:317组成的组中的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列组成；

(c)所述DA多肽由在严格条件下与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17的核苷酸序列杂交的核酸编码；或

(d)所述DA多肽由与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17的核苷酸序列的不同之处在于一个或数个核苷酸的***、添加、取代或缺失的核酸序列编码。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括减少或消除所述植物的细胞内的大哥(BB)多肽的表达，所述BB多肽具有E3泛素连接酶活性，并且具有氨基酸序列SEQIDNO:9。

3.一种生产具有增加的寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的植物的方法，所述方法包括：

通过转化将编码显性负向DA多肽的异源核酸引入植物细胞内；和

从一个或多个转化的细胞使植物再生；

其中所述显性负向DA多肽包含在与SEQIDNO:1的358位等同的位置处R被K取代的突变，并且

4.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括将异源抑制子核酸引入所述植物细胞内，所述异源抑制子核酸表达dsRNA分子和/或siRNA分子和/或shRNA分子和/或miRNA分子和/或其它RNA干扰构建体中的一种或多种，所述dsRNA分子和/或siRNA分子和/或shRNA分子和/或miRNA分子和/或其它RNA干扰构建体在严格条件下与核苷酸序列SEQIDNO:10杂交并且减少BB多肽的表达，

其中所述BB多肽具有E3泛素连接酶活性，并且具有氨基酸序列SEQIDNO:9。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，编码所述显性负向DA多肽和/或所述抑制子核酸的核酸与异源启动子可操作性相连。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述启动子是组织特异性启动子。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述启动子是诱导型启动子。

8.如权利要求5所述的方法，其中，编码所述显性负向DA多肽和/或所述抑制子核酸的核酸包含在一个或多个载体中。

9.如权利要求1～4中任一项所述的方法，所述方法包括有性或无性繁殖或生长表达DA多肽的显性负向形式的植物的子代或后代。

10.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述植物是高等植物。

11.一种通过增加植物的寿命、器官尺寸和/或种子尺寸来增加植物产量的方法，所述方法包括：

通过以下方式减少或消除所述植物的一个或多个细胞中编码DA多肽的两个或多于两个核酸的表达：

使植物细胞中编码两个或多于两个DA多肽的核酸序列突变；或

在所述植物的细胞内表达抑制所述两个或多于两个核酸的表达的两个或多于两个异源核酸；

其中

12.一种生产相对于野生型植物具有增加的寿命、器官尺寸和/或种子尺寸以及增加的产量的植物的方法，所述方法包括：

减少或消除植物细胞中编码DA多肽的两个或多于两个核酸的表达；和

从所述植物细胞再生所述植物；

其中减少或消除所述表达通过以下方式实现：

其中

13.一种减少植物的寿命、器官尺寸和/或种子尺寸的方法，所述方法包括：

相对于对照植物在所述植物的细胞内表达编码DA多肽的核酸；

其中

14.一种鉴定显性负向DA多肽的方法，所述方法包括：

提供编码DA多肽的分离核酸，

在所述核酸内引入一个或多个突变，

通过转化将所述核酸导入植物细胞内，

从一个或多个转化细胞再生所述植物，和

鉴定再生的植物的表型，

其中，包括相对于对照植物正常的能育性以及减少的寿命、减少的器官尺寸和减少的种子尺寸中的一个或多个的改变的表型表明突变的DA多肽是负向植物生长调节物，

其中

15.一种显性负向DA多肽的制备方法，所述方法包括：

提供编码植物DA多肽的核酸序列，

鉴定与SEQIDNO:1的358位等同的位置处的所编码的植物DA多肽中的R残基，和

使所述核酸突变以将所编码的植物DA多肽中的所述R残基改变为K残基，

突变体核酸序列编码显性负向DA多肽，

其中

16.如权利要求1、3、11～15中任一项所述的方法，其中所述DA多肽由与SEQIDNO:309具有至少95％序列同一性的氨基酸序列组成。

17.如权利要求1、3、11～15中任一项所述的方法，其中所述DA多肽由与SEQIDNO:310具有至少95％序列同一性的氨基酸序列组成。