CN105039257A - 造血干细胞的体外扩增培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种造血干细胞的体外扩增培养方法，该培养方法包括以下步骤：分别获取造血干细胞和基质细胞；所述造血干细胞和基质细胞被具有生物相容性的培养件隔开进行共培养；其中，所述培养件具有若干通孔，所述通孔的孔径小于或等于3.0微米。本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法不仅便于纯化造血干细胞，而且可提高造血干细胞的扩增倍数，增强免疫安全性。

Description

造血干细胞的体外扩增培养方法

技术领域

本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种造血干细胞的体外扩增培养方法。

背景技术

目前造血干细胞通常有三个来源:骨髓、外周血及脐带血。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有富含更早期的造血干细胞、采集方便，造血干细胞免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例较高等优点，因而脐带血造血干细胞具有极大的临床应用价值。但是，单份脐血的造血干细胞含量低，在临床中很难用于正常体重成人患者的移植。因此，造血干细胞在移植前需要进行体外扩增。

而造血干细胞的体外扩增需要基质细胞的滋养,有关基质细胞和造血干细胞共培养的研究,目前现有技术中大部分都采用了直接接触共培养的方法。在直接接触共培养中造血干细胞会粘附在基质细胞上或进入滋养细胞层内部,虽然两种细胞呈弱结合,但是实现两种细胞完全分离非常困难,而在临床应用中又必须使用不含基质细胞的纯净造血干细胞,因此,这种直接接触共培养的方法在临床应用中存在着纯化细胞困难或免疫安全性低等安全性问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中造血干细胞与基质细胞直接接触共培养扩增造血干细胞的方式存在纯化造血干细胞困难、免疫安全性低等缺陷，提供一种便于纯化造血干细胞、免疫较安全的造血干细胞的体外扩增方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种造血干细胞的体外扩增培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

分别获取造血干细胞和基质细胞；

所述造血干细胞和基质细胞被具有生物相容性的培养件隔开进行共培养；

其中，所述培养件具有若干通孔，所述通孔的孔径小于或等于3.0微米。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞与基质细胞的浓度比为5：1-3：1。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述通孔的孔径大小在0.4-3.0微米范围内。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件呈板状将所述造血干细胞和基质细胞隔开。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件呈开口状且具有一容纳空间，套设在细胞培养容器内。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件底部与培养孔底部的间距为10-450μm。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件底部与细胞培养容器底部的间距为150-350μm。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述培养件由聚碳酸酯材料制成。

在本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法中，所述造血干细胞为脐带血干细胞，所述基质细胞为脂肪干细胞。

实施本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法，可以达到以下有益效果：通过采用具有生物相容性和通透性的培养件将造血干细胞和基质细胞隔开，并且仅能通过培养件进行物质交流，造血干细胞可通过培养件与基质细胞进行胞质绒毛间接接触，也可以是非接触，不仅解决了现有技术中造血干细胞和基质细胞直接接触共培养难分离的问题，而且也提高了造血干细胞的扩增倍数，并增强造血干细胞的免疫安全性。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法中，第一种培养容器及培养件的截面示意图；

图2为本发明提供的第二种培养容器及培养件的截面示意图；

图3为本发明提供的第三种培养件的结构示意图；

图4为本发明提供的第四种培养容器及培养件的截面示意图。

具体实施方式

为解决现有技术中造血干细胞与基质细胞直接接触共培养扩增造血干细胞的方式存在纯化干细胞困难、免疫安全性低等缺陷，本发明的创新点在于在造血干细胞和基质细胞共培养体系中，提供一种具有通透性的培养件，用于隔开造血干细胞和基质细胞，防止两者直接接触，使得造血干细胞和基质细胞可通过细胞绒毛接触间接式培养或非接触式培养，而培养液及基质细胞的分泌物可自由穿过培养件为造血干细胞和基质细胞提供营养，从而解决了现有技术中，难以分离造血干细胞和基质细胞的难题，也提高了造血干细胞的免疫安全性。

具体地，本发明提供的一种造血干细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：

S1、分别获取造血干细胞和基质细胞；

S2、采用具有生物相容性的培养件隔开造血干细胞和基质细胞，再对造血干细胞和基质细胞进行共培养；

其中，培养件具有若干通孔，且通孔的孔径小于或等于3.0微米。

进一步地，在步骤S1中，造血干细胞可来源于骨髓、外周血及脐带血，与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，采集方便，免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例较高等优点；因此，在本发明中，优先采用脐带血造血干细胞，具体地，造血干细胞的来源过程为：

S11a、采集脐带血；

S12a、分离获取脐带血单个核细胞；

S13a、将脐带血单个核细胞诱导培养成脐带血造血干细胞。

在步骤S11a中，脐带血均来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿,每次采集量为50-100mL；在步骤S12a中，首先将步骤S11a中采集的脐带血与PBS缓冲液以1：1混合稀释得到脐带血稀释液；然后，在15mL无菌塑料离心管内加入4mL密度为1.077g/mL的Ficoll分离液(Ficoll分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，购自于Sigma公司),然后用吸管轻轻地将脐带血稀释液滴加到Ficoll液面上,以2500转/分钟的转速密度梯度离心25分钟,其中Ficoll分离液与脐带血稀释液的比例为1:(1-2)；离心结束后,用吸管吸取中间白膜层,获得UCB-MNCS(脐带血单个核细胞)；分离后的细胞用IMDM基础培养基离心洗涤两次(1000rpm,5分钟),调整单个核细胞密度为2×10⁵cells/ml备用。由于脐带血中含有大量的造血干细胞，因此，在该步骤中获得单个核细胞中已含有脐带造血干细胞，将其与单个核细胞一起共培养，能够模拟一个脐带造血干细胞的微环境，更有助于脐带造血干细胞的扩增。在步骤S13a中，将步骤S12a中获取的单个核细胞以2×10⁵cells/ml的密度接种在底面积为25cm²并装有培养液的组织培养瓶(T-flask)中,并在37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下培养7天，至单个核细胞转化成造血干细胞，并采用流式细胞仪分离出脐带血来源的造血干细胞。

其中，培养液为IMDM培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium,Gibco公司生产)，且IMDM培养基中添加有体积分数为10％的HS(马血清),10％FBS,16ng/mlSCF(人类干细胞因子),7.47ng/ml的FL(Flt-3配体),7.47ng/m1的TPO(血小板生成素),5.33ng/ml的IL-3(白细胞介素3，造血干细胞生长因子),3.33ng/ml的G-CSF(粒细胞集落刺激因子),2.13ng/ml的GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)。

另外，在步骤S1中，由于脂肪干细胞提供脂肪组织终生的自我更新，具有多向分化潜能，可分泌多种已知和未知的生长因子，以维持和扩增造血干细胞，并且脂肪干细胞存在于脂肪组织内，提取较方便等优点，因此，本发明优选选用脂肪干细胞作为基质细胞。

脂肪干细胞的获取过程为：

S11b、获取脂肪组织；

S12b、从脂肪组织中提取脂肪干细胞；

S13b、对脂肪干细胞进行传代培养，并获取第三代脂肪干细胞。

在步骤S11b中，脂肪组织取自外科手术患者(年龄16-60岁)的皮下正常脂肪组织。

步骤S12b具体为：取步骤S11b中获取的皮下脂肪约5g，用含有500U/mL双抗的PBS缓冲液充分漂洗3遍，剔除肉眼可见的血管及***，用眼科剪将其充分剪碎，再用PBS反复冲洗，尽量除去红细胞。然后加入2倍体积的0.2％Ⅰ型胶原酶，振荡混匀后，于37℃的恒温水浴箱消化60min，加入等体积的含有体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM终止消化，1800r/min离心10min，离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀。弃上层和中层，加入完全培养基(完全培养基为低糖DMEM，其中，还含有体积分数为10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)重悬细胞沉淀，70μm细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为1×10⁸cells/L接种至60mm培养皿中，于37℃、体积分数5％CO₂，饱和湿度的条件下培养。24h后半量换液，48h后全量换液，以后每2d换液1次。

步骤S13b具体为：原代培养7～9d生长融合达到90％，用0.25％胰酶(含有0.2％EDTA)常规消化后，按1:2或1∶3传代接种到含血清的培养液，放入37℃,5％CO₂培养箱中进行体外传代扩增培养，获取第3代脂肪干细胞。

可以理解的是，上述步骤S1中，造血干细胞和基质细胞的获取方式仅为本发明提供的其中一种实施例，现有技术中用于获取造血干细胞和基质细胞的技术手段同样适用于本发明。

在S2步骤中，当培养件上的通孔的孔径大于3.0微米时，基质细胞可穿过通孔迁移到造血干细胞一侧，与造血干细胞直接接触共培养，此时，与现有技术中的造血干细胞与基质细胞共培养方式基本相同；因此，本发明中限定通孔的孔径小于或等于3微米，优选地，通孔的孔径大小在0.4-3.0微米范围内，而当孔径为0.45微米时，基质细胞的胞质绒毛可以穿过通孔与造血干细胞实现间接接触；培养基通过通孔传递基质细胞的旁分泌，促进造血干细胞的扩增。

进一步地，培养件是由聚碳酸酯膜或具有生物相容性的半透膜制成，由于聚碳酸酯具有良好的生物相容性，且可溶性溶液可自由通过，与细胞培养液接触不会释放毒素或黏附培养基中的关键成分，较适宜造血干细胞的扩增培养环境，因此，本发明中优先采用聚碳酸酯膜制成培养件，当然培养件的材料也并不局限于此，可根据共培养的细胞类型及所采用的培养液类型进行选择，以不影响造血干细胞扩增效果为宜，具有生物相容性及通透性材料均可。

进一步地，培养件可以呈板状或与细胞培养容器同轴的管状将细胞培养容器分成两个或多个培养区，不同培养区之间仅可通过培养件上的通孔进行物质交流。由于造血干细胞和基质细胞均为贴壁生长，因此，当培养件呈板状时，优选地，培养件将细胞培养容器分隔成其轴向上的不同培养区，即竖直方向上的不同培养区，便于控制造血干细胞与基质细胞的距离，提高基质细胞对造血干细胞的营养支持作用；同时，为保证培养液的高渗透性，培养件的厚度小于20微米。而培养件与细胞培养容器内壁可活动连接，便于在不同培养区内接种细胞，在细胞培养容器2内壁设置用于安放培养件100的凸台21(如图1所示)或在细胞培养容器2内壁开设用于卡设培养件110的凹槽22(如图2所示)亦或是如图3所示，培养件120底部设置用于支撑培养件120的支撑部121，支撑部121由两个或多个支撑腿组成的支架，可将培养件120直接放置于细胞培养容器2中，方便培养件120的取放。另外，为防止造血干细胞和基质细胞通过培养件与细胞培养容器之间的缝隙迁移至两种细胞直接接触，在培养件的四周设置有密封胶圈，以密封两者之间的缝隙，密封胶圈的材质以不与扩增培养体系发生化学反应为宜。

可以理解的是，培养件与细胞培养容器内壁也可固定连接，此时，在细胞培养容器靠近其底部的侧壁上开设接种口，并配置密封塞，接种时可拔出密封塞，将基质细胞或造血干细胞加入位于细胞培养容器底部的培养区内；接种完成，将用密封塞密封接种口防止培养液流出。

如图4所示，培养件130也可以呈开口状并具有一容纳空间，套设在细胞培养容器2内，并沿细胞培养容器2轴向将细胞培养容器2分成不同的培养区；优选地，培养件130呈杯状，杯状培养件130的底部为通透性膜，为保证培养液及基质细胞分泌物的高渗透性，膜的厚度小于20微米；杯状培养件130的侧壁材料与细胞培养容器2相同或同样由聚碳酸酯膜制成，可直接套设在细胞培养容器2内；也可在培养件130开口处向外延伸出一支撑平台131，培养件可通过该支撑平台131与细胞培养容器2开口处配合，使得培养件130可直接套设或悬挂于细胞培养容器2中，对培养件130进一步支撑限位以避免培养件130不至于接触到细胞培养容器2底部，当然也可使培养件130与细胞培养容器2过盈配合等方式来实现培养件的固定；基质细胞接种于细胞培养容器2中，培养件130的外部；造血干细胞接种于培养件130内，由于细胞培养容器2中放置了培养件130，因此培养件130中的容纳空间相对于细胞培养容器2中的剩余空间较大，较适于为造血干细胞提供一个相对适宜的扩增空间；当然造血干细胞和基质细胞的相对位置也并不局限于此，可根据具体需要进行配置。可以理解的是，培养件的形状结构也并不局限于此，也可为膜滤器或通透性支架。

进一步地，当培养件将细胞培养容器分成竖向上的不同培养区时，培养件底部与细胞培养容器底部之间的间距过大或过小，均会影响基质细胞旁分泌对造血干细胞的支持和扩增作用，因此，在本发明中，培养件底部与细胞培养容器底部的间距为10-450μm，使得基质细胞与造血干细胞通过细胞绒毛间接接触或非接触，同时，培养件与细胞培养容器底部之间的距离也决定了基质细胞近分泌和/旁分泌的浓度，进而影响其对造血干细胞扩增的支持作用的强弱；而当培养件与细胞培养容器底部的间距为150-350μm时，造血干细胞和基质细胞既能进行细胞信号传递，有旁分泌和近分泌，并且旁分泌占主导作用，在这个间距下单个核细胞所需的养分被基质细胞吸收的很少，能够保持细胞扩增所需，因此，造血干细胞的扩增效果最好。可以理解的是，若培养件底部与细胞培养容器底部之间的间距过大或过小时，可通过调整造血干细胞和基质细胞的浓度来实现造血干细胞的扩增，具体可根据实际情况和实验进行调整。

进一步地，在步骤S2中，将浓度比为5：1-3：1的造血干细胞和基质细胞分别接种于细胞培养孔内被培养件分隔而成的不同培养区，添加含有10％FBS的DMEM培养液对造血干细胞和基质细胞同时进行培养，共培养过程中始终保持培养体系中的细胞总浓度为(1.0-1.5)x10⁶个/mL；若细胞浓度超过2×10⁶cells/ml时，可从体系中取出部分细胞悬液，同时添加新鲜培养液，使培养基体系中的细胞浓度保持(1.0-1.5)x10⁶个/mL。

以上仅为本发明提供的其中一种造血干细胞和基质细胞共培养过程，在本发明的改进点基础上，现有技术中造血干细胞和基质细胞共培养过程同样适用于本发明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式为：

实施例1

本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法为：

1、分别获取脐带血造血干细胞和第三代脂肪干细胞，并调整造血干细胞浓度为1×10⁶个/m1，脂肪干细胞浓度为2×l0⁵个/m1；

2、采用如图1所示的培养件，将培养板的培养孔分割成垂直方向上的两个培养区；其中，该培养件呈开口杯状并具有一容纳空间，且其开口处向外侧延伸出一支撑平台，用于与培养孔上断面配合，对培养件提供支撑限位作用；培养件底部为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.4微米，厚度为10微米，且该聚碳酸酯膜与培养孔底部的距离为350微米。

首先，将浓度为2×l0⁵个/m1的脂肪干细胞接种到经过预处理的6孔板中，待多数细胞贴壁融合后将培养件放入6孔板中的培养孔内，再在培养件的容纳空间内接种浓度为1×10⁶个/m1造血干细胞，并添加含10％FBS的DMEM培养基进行共培养。在共培养过程中,当培养件中的单个核细胞总的细胞密度超过2×10⁶个/ml时,从体系中取出部分细胞悬液,同时添加新鲜培养液,使得体系中细胞密度降低到(1.0-1.5)×10⁶个/m1的范围内,即采用稀释换液的方法。

为进一步验证本发明提供的造血干细胞体外扩增培养方法的显著效果，通过以下实验进行检测验证。

该实验过程中，对照组为直接共培养组,将2种细胞直接混合培养；其余的6组实验组分别为培养件通孔孔径在0.45微米、且培养件底部与培养孔底部间距在10-450μm范围内的间接接触培养实验,即6组实验组中培养件底部与培养孔底部间距分别为10μm、50μm、150μm、250μm、350μm、450μm，每组共培养实验进行7天。

1.CD34+细胞的流式细胞仪分析

应用BectonDickinson型流式细胞仪对扩增前后的细胞进行CD34-FITC抗体检测,细胞标记方法为:细胞用PBS缓冲盐溶液洗涤一次,加入CD34-FITC抗体10μL,4℃避光孵育30分钟；孵育结束后用PBS缓冲盐溶液再洗涤一次,使用流式细胞仪分析CD34+细胞的含量，如下表1。

2.扩增倍数计算

在共培养过程中,当实验组培养件中的单个核细胞总的细胞密度超过2×10⁶个/ml时,从体系中取出部分细胞悬液,同时添加新鲜培养液,使得体系中细胞密度降低到(1.0-1.5)×10⁶个/m1的范围内,即采用稀释换液的方法。计算细胞扩增倍数时，认为被取出的细胞具有和留在体系中的细胞一样的扩增能力，如下表1。

试验结果：

表1

由以上结果可以看出，本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法所获得造血干细胞扩增倍数明显提高；且在电镜显示中可以看出，当培养件底部与培养孔底部间距为350微米时，电镜显示造血干细胞和脂肪干细胞的细胞绒毛可相互接触，造血干细胞的扩增倍数最高。

综上所述，本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法，造血干细胞和基质细胞被培养件隔开进行共培养，两种细胞之间通过细胞绒毛间接接触，或非接触，从而省去造血干细胞扩增后与基质细胞分离的步骤，解决了现有技术中将造血干细胞与基质细胞直接接触共培养，难以分离等问题，提高了造血干细胞的免疫安全性，同时，通过本发明提供的造血干细胞的体外扩增培养方法，大大提高了造血干细胞的扩增倍数。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述培养方法包括以下步骤：

分别获取造血干细胞和基质细胞；

所述造血干细胞和基质细胞被具有生物相容性的培养件隔开进行共培养；

其中，所述培养件具有若干通孔，所述通孔的孔径小于或等于3.0微米。

2.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细胞与基质细胞的浓度比为5：1-3：1。

3.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述通孔的孔径大小在0.4-3.0微米范围内。

4.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述培养件呈板状将所述造血干细胞和基质细胞隔开。

5.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述培养件呈开口状且具有一容纳空间，套设在细胞培养容器内。

6.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，且所述培养件底部与细胞培养容器底部的间距为10-450μm。

7.根据权利要求6所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述培养件底部与细胞容器底部的间距为150-350μm。

8.根据权利要求1所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述培养件由聚碳酸酯材料制成。

9.根据权利要求1-8任一项所述的造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细胞为脐带血干细胞，所述基质细胞为脂肪干细胞。