CN105037498A - 源于武夷湍蛙的抗氧化肽及其基因与应用 - Google Patents
源于武夷湍蛙的抗氧化肽及其基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及源于武夷湍蛙的抗氧化肽，首先通过基因克隆得到抗氧化肽Wuyienin-1与抗氧化肽Wuyienin-2的编码基因，再通过化学合成的方法得到两种抗氧化肽的一级结构序列，两种抗氧化肽均含13个氨基酸残基，该两种抗氧化肽有很强抗氧化活性，且溶血活性极低，可以用于制备抗氧化药物、保健品、化妆品，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，尤其是涉及源于武夷湍蛙的抗氧化肽及其基因，本发明还涉及该肽在制备抗氧化药物等方面的应用。
背景技术
自由基指任何包含一个未成对电子的原子或原子团，生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基。
在较高浓度下，活性氧自由基会对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤；例如，造成DNA损伤，会进一步引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。
目前研究已经发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关，如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。
为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除***，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶***和谷胱甘肽酶***；
各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽，基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。
蛙类皮肤提取的小分子多肽具有极高的抗氧化性和极低的溶血性，且有热稳定性强、水溶性好、无毒副作用，在人体内可被降解消化的优势，在制备抗氧化药物、保健品、化妆品具有很好的应用前景。
武夷湍蛙为蛙科湍蛙属的两栖动物，是中国的特有物种，目前关于武夷湍蛙来源的抗氧化多肽的研究还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供源于武夷湍蛙的抗氧化肽及其基因与应用。
本发明采取以下技术方案来实现这些内容：
本发明的目的之一是提供源于武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1和Wuyienin-2；
所述抗氧化肽Wuyienin-1分子量1519.8Da，等电点8.82，由13个氨基酸残基组成，全序列的一级结构为SEDIDNO:1，其具体结构为：Cys1Gly2Tyr3Lys4Tyr5Gly6Cys7Met8Val9Lys10Val11Asp12Arg13，其中Cys1和Cys7之间形成一对分子内二硫键；
所述抗氧化肽Wuyienin-2分子量1523.8Da，等电点8.86，由13个氨基酸残基组成，全序列的一级结构为SEDIDNO:3，其具体结构为：Cys1Ser2Tyr3Lys4His5Gly6Cys7Met8Val9Lys10Val11Asp12Arg13，其中Cys1和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
本发明的目的之二是提供源于武夷湍蛙抗氧化肽基因；
抗氧化肽Wuyienin-1前体的编码基因由308个核苷酸组成，其5’端至3’端的核苷酸序列(SEDIDNO:2)：
编码抗氧化肽Wuyienin-1为上述核苷酸序列的第141-180位核苷酸；
抗氧化肽Wuyienin-2前体的编码基因由307个核苷酸组成，其5’端至3’端核苷酸序列(SEDIDNO:4)：
编码抗氧化肽Wuyienin-2为上述核苷酸序列的第141-180位核苷酸。
本发明还提供了源于武夷湍蛙的抗氧化肽的应用，所述武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1、武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2或含有武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1和武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2中的至少一种的组合物在制备抗氧化药物、保健品及化妆品中的应用；在制备能够利用该武夷湍蛙抗氧化肽对哺乳动物红细胞具有低溶血活性的药物中的应用。
本发明还提供了源于武夷湍蛙的抗氧化肽的编码基因的应用，在多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分或植物细胞中的应用。
本发明通过ABTS·+自由基清除活性(ABTS·+radicalcationdecolourisationassay)实验检测抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2抗氧化活性，并通过抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2分别与动物红细胞悬液混合，检测溶血活性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1抗氧化活性；
图2是武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2抗氧化活性；
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2编码基因克隆：
1)武夷湍蛙皮肤总RNA提取：
①取200mg武夷湍蛙背部皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1ml总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。
②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。
③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为武夷湍蛙皮肤总RNA。
2)武夷湍蛙皮肤cDNA文库构建：
采用CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit合成。
(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
①RNase-free的PCR管中加入1μl武夷湍蛙皮肤总RNA、1μl3’端一链合成引物(3’In-FusionSMARTerCDSPrimer)和2.5μlRNase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。
②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备)，2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl100mMDTT、1.0μl10mMdNTPMix、1.0μlSMARTerVOligonucleotide、0.25μlRNaseInhibitor和1.0μlSMARTScribeReverseTranscriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。
(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit建库试剂盒中配备)
①将2μlcDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲液、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl50×Advantage2PolymeraseMix在95℃预热的PCR管中进行混合。
②在PCR仪中按以下程序扩增：
95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链在-80℃保存。
(3)武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2编码基因克隆：
根据蛙科抗氧化肽编码基因信号肽区的保守序列，人工设计合成正向引物5’-WYAOP:5’-ATGTTCACCTTGAAGAAAACC-3’(SEDIDNO:5)，反向引物为CLONTECH公司In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’(SEDIDNO:6)。PCR反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测***片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用AppliedBiosystemsDNAsequencer,modelABIPRISM377进行核苷酸测序。
测定结果：
编码武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1前体的基因自5’端至3’端序列为SEDIDNO:2：
武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为308个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：武夷湍蛙皮肤。
编码武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1为第141-180位核苷酸。
编码武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2前体的基因自5’端至3’端序列为SEDIDNO:4：
武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为307个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：武夷湍蛙皮肤。
编码武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2为第141-180位核苷酸。
实施例2武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2的制备：
(1)武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
(3)纯化的武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1由13个氨基酸残基组成，分子量1519.8Da，等电点8.82，其氨基酸序列为SEDIDNO:1：
Cys1Gly2Tyr3Lys4Tyr5Gly6Cys7Met8Val9Lys10Val11Asp12Arg13，其中Cys1和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2由13个氨基酸残基组成，分子量1523.8Da，等电点8.86，其氨基酸序列为SEDIDNO:3：
Cys1Ser2Tyr3Lys4His5Gly6Cys7Met8Val9Lys10Val11Asp12Arg13，其中Cys1和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
实施例3武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2抗氧化活性检测：
武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2抗氧化活性利用ABTS·+自由基清除活性(ABTS·+radicalcationdecolourisationassay)检测方法进行。
2,2′-azino-bis(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonicacid)diamoniumsalt,ABTS,TCI，日本)储存液配制：将ABTS溶于PBS缓冲液(8.18gNaCl,0.27gKH2PO4,3.58gNaHPO4·11H2O,0.15gKCl溶于1L去离子水，用0.1MNaOH调pH至7.4)配成2mM的溶液。
ABTS·+溶液配制：将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K2S2O8)水溶液按体积比250:1混合，于室温避光放置15-16h。试验开始前，将ABTS·+溶液用PBS稀释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。
将2μl武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2样品(2mg/ml)分别和48μl上述校正过的ABTS·+溶液混合，室温放置10min后，于734nm波长处检测反应液的吸光值。样品溶解介质作为空白对照。
ABTS·+清除率I(％)＝(AB－AA)/AB×100(AB:absorbanceofblank；AA:absorbanceofsample)。
如图1和图2所示，Wuyienin-1，Wuyienin-2具有极强的抗氧化活性，随着浓度的升高，Wuyienin-1，Wuyienin-2表现出浓度依赖的ABTS·+自由基清除活性。在浓度为400μg/ml时，Wuyienin-1和Wuyienin-2的ABTS·+自由基清除活性均超过80％。
实施例4武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2溶血活性测定：
将采集的新鲜C57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1，Wuyienin-2样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用TritonX-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。
结果表明Wuyienin-1和Wuyienin-2浓度为200μg/ml时，其溶血百分比分别为1.55％和1.69％，说明Wuyienin-1和Wuyienin-2对哺乳动物红细胞具有极低的溶血活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.源于武夷湍蛙的抗氧化肽，其特征在于：包括武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1和武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2，其中所述武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1分子量为1519.8Da，等电点8.82，由13个氨基酸残基组成，全序列的一级结构为：Cys1Gly2Tyr3Lys4Tyr5Gly6Cys7Met8Val9Lys10Val11Asp12Arg13，其中Cys1和Cys7之间形成一对分子内二硫键；所述武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2分子量为1523.8Da，等电点8.86，由13个氨基酸残基组成，全序列的一级结构为：Cys1Ser2Tyr3Lys4His5Gly6Cys7Met8Val9Lys10Val11Asp12Arg13，其中Cys1和Cys7之间形成一对分子内二硫键。
2.根据权利要求1所述的源于武夷湍蛙的抗氧化肽的编码基因，其特征在于：武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1前体的编码基因由308个核苷酸组成，其5’端至3’端的核苷酸序列为SEDIDNO:2；武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2前体的编码基因由307个核苷酸组成，其5’端至3’端核苷酸序列为SEDIDNO:4。
3.根据权利要求2所述的源于武夷湍蛙的抗氧化肽的编码基因，其特征在于：武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1的编码基因为SEDIDNO:2的第141-180位核苷酸，武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2的编码基因为SEDIDNO:4的第141-180位核苷酸。
4.根据权利要求1所述的源于武夷湍蛙的抗氧化肽的应用，其特征在于：所述武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1、武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2或含有武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-1和武夷湍蛙抗氧化肽Wuyienin-2中的至少一种的组合物在制备抗氧化药物、保健品及化妆品中的应用。
5.根据权利要求1所述的源于武夷湍蛙的抗氧化肽的应用，其特征在于：在制备能够利用该武夷湍蛙抗氧化肽对哺乳动物红细胞具有低溶血活性的药物中的应用。
6.根据权利要求2或3所述的源于武夷湍蛙的抗氧化肽的编码基因的应用，其特征在于：在多肽重组表达、转基因动物、植物、植物部分或植物细胞中的应用。
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