CN105030771B - 连吡啶异恶唑类化合物作为法尼醇x受体激动剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制药技术领域，具体公开了一种连吡啶异恶唑类化合物作为法尼醇X受体激动剂的应用。本发明通过研究首次发现了一种新的对法尼醇X受体具有激动活性的连吡啶异恶唑类化合物，并且细胞毒试验显示该类化合物的毒性小。因此，本发明的研究开拓了非甾体类法尼醇X受体激动剂的范畴，另外，本发明公开的这类化合物可以用于治疗高脂血症、糖尿病、炎症、原发性胆汁性肝硬化等严重危害人体健康的疾病，在作为先导化合物优化研究方面具有良好的发展前景。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体地涉及法尼醇X受体激动剂技术领域，更具体地，涉及连吡啶异恶唑类化合物作为法尼醇X受体激动剂的应用。
背景技术
随着我国经济的迅速发展和人们生活水平的不断提高，心脑血管疾病患者日益增多，而高脂血症是导致这一现状的重要危险因素。高脂血症是由于人体全身脂肪代谢紊乱，引起血浆中一种或多种脂质结构失衡的疾病，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，例如冠心病、动脉粥样硬化等。最近一次全国营养与健康现状调查显示，目前我国高血脂患者超过1.6亿人，其病发率呈逐年上升趋势，而男性是高血脂的高发人群。2011年的《中国心血管病报告》认为，心脑血管疾病是我国城市居民死亡首位原因。因此，治疗和预防高脂血症有重要的临床意义。
法尼醇X受体(Farnesoid X Receptor,FXR)是核受体超家族中的一员，分布的位置主要为肝脏、小肠肾以及肾上腺等组织器官。在1999年，法尼醇X受体被证明为是胆汁酸的受体，而胆汁酸在脂肪和脂溶性维生素的吸收、转运、分配以及胆固醇动态平衡等过程中发挥了重要作用。法尼醇X受体通过参与胆汁酸代谢的基因表达来维持胆汁酸在体内的平衡。因此，法尼醇X受体可以作为高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三脂血症等疾病的治疗靶标，法尼醇X受体的激动剂是治疗高脂血症的有效药物。目前研发中的法尼醇X受体激动剂仅有Obeticholic Acid(OCA，一种鹅脱氧胆酸衍生物)进入了临床三期。OCA为甾体类化合物，存在一定的副作用，因此非甾体类法尼醇X受体激动剂仍然是研究的热点。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新骨架结构的连吡啶异恶唑类化合物。
本发明的另一个目的在于提供一种新的此非甾体类法尼醇X受体激动剂。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
连吡啶异恶唑类化合物作为法尼醇X受体激动剂的应用，所述连吡啶异恶唑类化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，R1为氢、烷基、烷氧基或卤素；
R2为
R3为苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(BOC)、9-芴甲氧羰基(FMOC)、苄基(Bn)或对甲氧苯基(PMP)。
优选地，R2中的n＝1、2或3。
更优选地，所述连吡啶异恶唑类化合物具有式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的结构式：
如上式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所述结构的连吡啶异恶唑类化合物作为法尼醇X受体激动剂的应用。
一种药物组合物，含有如上式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所述结构的连吡啶异恶唑类化合物。
含有如上式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所述结构的连吡啶异恶唑类化合物的药物组合物作为法尼醇X受体激动剂的应用。
上述药物可用于治疗和预防由法尼醇X受体引起的疾病的药物。
优选地，法尼醇X受体引起的疾病为高脂血症、糖尿病、炎症或原发性胆汁性肝硬化。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现了一类对法尼醇X受体具有激动活性的连吡啶异恶唑类化合物，并且细胞毒试验显示该类化合物的毒性小。因此，本发明的研究开拓了非甾体类法尼醇X受体激动剂的范畴，另外，本发明公开的这类化合物可以用于治疗高脂血症、糖尿病、炎症、原发性胆汁性肝硬化等严重危害人体健康的疾病，在作为先导化合物优化研究方面具有良好的发展前景。
附图说明
图1为虚拟筛选设计流程。
图2为SYSU-23116S、SYSU-23298S两个化合物对法尼醇X受体的激动活性测试数据。
图3为SYSU-23116S、SYSU-23298S两个化合物的细胞毒性测试数据。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
多种药物的虚拟筛选
虚拟筛选具体步骤如图1所示。本流程中收集470个用于建立筛选模型的分子，其中标记有细胞水平激动活性测试EC50结果的法尼醇X受体调控剂分子有170个。采用MOE2013.08软件对分子进行加氢、去离子及络合水分子、优化二维结构等处理。使用Discovery Studio2.5.5软件包，将470个化合物随机按3：1比例分成训练集和测试集。进而在Discovery Studio2.5.5软件包中，用训练集建立朴素贝叶斯模型和递归分区模型，并用测试集评价模型预测效果。通过计算Matthews相关系数等评价指标在两种机器学习方法中各选出一种最优模型用于筛选。
虚拟筛选化合物库为自备化合物数据库。化合物库的处理方法与建立模型的分子处理方法相同。准备好的小分子库用于虚拟筛选。
分别用两个机器学习模型对小分子库进行筛选。在朴素贝叶斯模型中，模型筛选出了163个小分子；在递归分区模型中，模型筛选出了33个小分子。之后根据以下原则挑选化合物：
(1)化合物骨架新颖；
(2)分子量大于200；
(3)分子具有多样性。
最终，15个化合物被选出并作为苗头化合物进行下一步的生物学测试。
实施例2
一、15个苗头化合物经过筛选后，发现SYSU-23116S(结构式如式(Ⅱ)所示)和SYSU-23298S(结构式如式(Ⅱ)所示)两种吡啶异恶唑类化合物对法尼醇X受体具有激动活性。
SYSU-23116S(结构式如式(Ⅱ)所示)和SYSU-23298S(结构式如式(Ⅱ)所示)两种吡啶异恶唑类化合物是从北京大学化合物样品库申购得到。
为了确证SYSU-23116S和SYSU-23298S的结构，应用核磁共振仪和高分辨质谱仪对两个活性化合物进行了结构确证。结果如下：
1.SYSU-23116S的结构确证：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.46(s,1H),8.54(dd,J＝4.5,1.6Hz,2H),8.37(d,J＝5.2Hz,1H),7.24–7.21(m,2H),6.52(s,1H),4.61(d,J＝6.3Hz,2H),3.48(dd,J＝12.7,6.9Hz,2H),2.85(t,J＝7.6Hz,2H),2.04–1.94(m,2H),1.47(s,9H),1.47(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.7,163.7,159.5,158.5,156.5,153.6,150.4,146.8,122.5,101.4,83.5,79.6,42.4,39.9,28.5,28.3,27.3,24.4.HRMS(ESI):m/z calcd for C24H34N6O6:525.2432[M+Na]+；found,525.2424[M+Na]+.
2.SYSU-23298S的结构确证：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.51(d,J＝6.0Hz,2H),8.01(d,J＝6.5Hz,2H),6.74–6.64(m,1H),3.69(dd,J＝11.2,4.1Hz,2H),3.31–2.90(m,2H),1.47(s,9H),1.47(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ172.5,171.6,171.1,159.7,155.6,152.3,143.7,143.6,115.2,98.0,97.8,97.4,86.1,40.5,28.7,28.3,28.3.HRMS(ESI):m/z calcd for C22H31N7O6:490.2409[M+H]+；found,490.2391[M+H]+.
3.结果分析：根据图谱结果，各个吸收峰可归属到相应的结构特征当中，确证了SYSU-23116S和SYSU-23298S的结构。
二、化合物SYSU-23116S和SYSU-23298S对法尼醇X受体激动活性测试方法如下：
法尼醇X受体的质粒、相应的报告基因质粒以及内参质粒共转染到工具细胞中，利用化合物作用后的荧光素酶的荧光值来研究化合物对法尼醇X受体转录活性的调控作用。具体测试步骤如下：
1、细胞接种：HEK293细胞被接种在含有10％牛胎儿血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的细胞培养基中，温度控制在37℃，环境中CO2浓度为5％。对数生长期的细胞被接种于96孔板中，每组做3个复孔，至细胞在96孔板中覆盖率达到80～85％时即可进行转染。
2、质粒转染：按照脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书，采用瞬时转染法将人源FXR质粒pSG5/hFXR、人源RXR质粒pSG5/hRXRα、报告质粒pGL3/(DR-4)-c-fos-FF-luc、内参质粒pCMV/Renilla-luc共转染进细胞中。
3、化合物处理：细胞转染10小时后，更换含化合物的培养基，设空白对照组、阳性化合物组和待测化合物组。药物干预20小时后进行荧光素酶报告基因检测。
4、荧光报告基因的检测：使用多功能酶标仪工作站Flex Station 3(MolecularDevices,美国)，按照双荧光素酶报告基因测定试剂盒检测报告基因的酶活性。
5、数据处理：活性值表示为相对荧光素酶活性，即实验组荧光素酶活性/溶媒组荧光素酶活性。所有数据以平均值±标准方差表示，采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。
6、结果分析：化合物SYSU-23116S和SYSU-23298S对法尼醇X受体激动活性测试结果见图2。由图2可知：在10μM浓度下，SYSU-23116S和SYSU-23298S的相对荧光素酶活性值分别为2.29和2.21，接近于细胞水平EC50为90nM的阳性对照GW4064的3.70。对比于空白对照，展现了对FXR较强的激动活性。
实施例3化合物SYSU-23116S和SYSU-23298S的细胞毒性测试
利用人类肾胚胎HEK293细胞模型，应用MTT法评估实施例1中的两种连吡啶异恶唑类化合物的细胞毒性。具体测试方法如下：
1、配置MTT溶液：取125mg MTT粉末用50ml无菌PBS(0.01mM，pH＝7.4)溶解，配成2.5mg/mL，在超声清洗仪振荡数十秒，过滤除菌，然后于4℃避光保存。两周内使用有效，最好现配现用。
2、HEK293细胞培养：HEK293细胞使用含10％牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。
3、接种细胞：将生长良好的HEK293细胞，小心弃去培养皿内的大部分细胞培养液，然后800rpm/min离心3min；弃去离心后的上清液，重新加入培养基，用血细胞计数板计数。用8道加样器吸取单细胞悬液加入96孔板中，100μl/孔，即50000个细胞/孔。
4、药物干预：在37℃，5％CO2培养箱培养24h，待细胞贴壁后，分别用培养基稀释不同浓度药物处理细胞，设立不加任何处理因素的对照组、空白孔，每个浓度设3个平行复孔，将待测药物(SYSU-23116S、SYSU-23298S)配置成5μM和10μM两个浓度。加入待测药物溶液至100μl微孔中，与细胞于37℃，5％CO2培养箱培养48h。每孔加入2.5mg/mL的MTT20μL，于37℃，5％CO2培养箱培养4h。弃去上清，每孔加100μL的DMSO，振荡20min，测量492nm处吸收值(A)。
细胞毒性评价：各组细胞抑制率(％)＝1-{(试验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)}×100％，进而得出各组细胞抑制率。
5、实验结果：根据图3结果显示，可以看出两个化合物SYSU-23116S、SYSU-23298S对HEK293细胞无明显毒性。
Claims (6)
1.连吡啶异恶唑类化合物作为制备法尼醇X受体激动剂的应用，其特征在于，所述连吡啶异恶唑类化合物的结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
其中，R1为氢；
R2为 ，其中n=1、2 或3；
R3为叔丁氧羰基；
Y为或。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述连吡啶异恶唑类化合物的结构式如式（Ⅱ）或式（Ⅲ）所示：
式（Ⅱ） 式（Ⅲ）。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求2式（Ⅱ）或式（Ⅲ）所示的连吡啶异恶唑类化合物。
4.权利要求3所述的药物组合物作为制备法尼醇X受体激动剂的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗和预防由法尼醇X受体引起的疾病的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，由法尼醇X受体引起的疾病为高脂血症、糖尿病、炎症或原发性胆汁性肝硬化。
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