CN105028213A - 铁皮石斛组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

铁皮石斛组培快繁方法，步骤：初代培养采用种子培养，茎尖、幼茎培养，原球茎、侧芽诱导。继代培养是把初代培养得到的芽或原球茎，用1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+马铃薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培养基上反复转接培养。生根壮苗培养的培养基是1/2MS++NAA0.2mg/L+6_BIBA0.2mg/？L++马铃薯泥5%+香蕉泥10%+糖7.5%，pH值为5.8；经过接种，采用纯松树皮，用2000倍多菌灵药液浸泡24小时，然后堆捂发酵2～3个月制得的基质炼苗。种子萌发率高，芽苗生产快，苗粗壮、叶面展开、根系发达、成活率高；实现铁皮石斛种苗快速无毒繁育的目的。

Description

铁皮石斛组培快繁方法

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛组培快繁方法。

背景技术

铁皮石斛（学名：Dendrobiumofficinale），又称黑节草，属于气生兰科草本植物附生兰类，石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。野生铁皮石斛只生长在悬崖峭壁上的阴面崖缝间或者原始森林的大树上，且对温度、湿度、光照等小气候的要求近乎苛刻，每年植株只分枝一次，长约一寸，至少要2-3年才能采收。是传统的名贵中药材，《本草纲目拾遗》中说石斛“清胃除虚热、生津，已劳损。以之代茶，开胃健脾。在临床上，石斛多用于治疗阴伤津亏、口干烦渴、食少干呕、病后虚热，以及目暗不明等症。

铁皮石斛的种子极细小，胚胎发育不完全，无胚乳组织，在自然状态下发芽率极低。加之长期以来掠夺性的采挖，致使野生的铁皮石斛资源已近枯竭，处于濒危状态。现仍存在种源混乱，种植技术参差不齐，规范化水平低，仿野生种植面积小，产品质量难以保证。

发明内容

本发明的目的是公开一种铁皮石斛组培快繁方法，以解决铁皮石斛种苗的问题，为发展铁皮石斛的人工种植提供基础条件。

铁皮石斛组培快繁方法，包括初代培养、继代培养、生根壮苗培养，具体步骤如下：

一、初代培养：

(1)、种子培养

a、果实采集，8～9月份采集成熟没有裂开的蒴果；

b、灭菌，在无菌工作台内进行表面灭菌，用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗6次；

c、播种，用无菌滤纸吸去蒴果表面水分、切开果皮，将粉末状种子均匀播撒在培养基表面或将种子直接撒在无菌水中摇匀，再用无菌吸管取此混合液置于无菌培养基上；

d、培养条件，光照强度为1600～2000LX,光照时间10h/d,培养温度25±2℃；

(2)、茎尖、幼茎培养：

a、茎尖或幼茎采集，选择长势、性状良好，无病虫的茎尖或带腋芽的幼茎，，用自来水冲洗、洗涤剂洗净；

b、灭菌，在无菌工作台内用70%的酒精浸泡30秒钟，再用0.1%升汞溶液浸泡15分钟，之后用无菌水冲洗至少6次；

c、接种，将灭菌的茎尖用无菌滤纸吸去表面水分，并切割成3～5mm长并带有一个节的茎段，接种到诱导培养基上；

(3)、原球茎、侧芽诱导

a、两种培养基

A:1/2MS+BA0.2～0.5mg/L+NAA2～0.5mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%；

B:1/2MS+6_BA1mg/L+NAA0.2mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%，pH值为5.8；

b、诱导步骤：ⅰ、茎尖、茎段接种到培养基A上进行侧芽的诱导，当诱导侧芽长成球型时，切去鳞片状叶被和周围变褐组织；ⅱ、或将新发的枝切割，反复培养，接种到B培养基上进行原球茎的诱导；ⅲ、60天后将原球茎分割成小块继续转接到B培养基上，以后每50～60天继代一次，使原球茎不断增殖；

二、铁皮石斛继代培养

(1)、将初代培养中获得的原球茎或芽转接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+马铃薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培养基上反复转接培养；反复转接的次数由需要的苗量决定；

(2)、接种时按照苗的生长情况，依大、中、小分类转接，培养瓶接种的数量因容器大小而定；

（3）40～60天转接一次；

（4）培养条件：温度25～27℃,光照8～10h/d光照强度1600～2000LX。

三、生根壮苗培养：

（1）、培养基，1/2MS++NAA0.2mg/L+6_BIBA0.2mg/L++马铃薯泥5%+香蕉泥10%+糖7.5%，pH值为5.8；

（2）、接种，将继代培养中高度2～3cm小苗分离成单株，接种到前述生根培养基上；

（3）、培养条件，光照时间10～12h/d，光照强度：前两个月1600～2000LX、以后4000LX，培养温度25±2℃；当生根苗具有5～6片展叶，高度达6cm，根系正常时即可出瓶供移栽训化；

（4）、生根苗炼苗训化：

a、炼苗基质选择，用纯松树皮，规格大小为0.5×0.5cm,经消毒、并喷水充分湿润、发酵制得，即采用2000倍多菌灵药液浸泡24小时，然后堆捂发酵2～3个月，做到手握成团松手即散。

b、移栽定植，采用消毒的穴盘定植，移栽深度控制在不埋到苗的基部。

c、移栽定植后管理，移栽定植后，浇透定根水，用遮光网遮光80%并根据空气温湿度，叶面喷雾，防止叶面脱水，7天后，以叶面不被灼伤为度，逐步增强光照；白天棚内保持27℃，夜间不低于15℃,15天后遮光70%，并补水防止干燥；每周用75%的百菌清600倍液喷雾一次，防病保苗。

d、病虫害防治，搞好大棚的温度湿度调控及通风透气工作，相对湿度控制在60%～65%，温度控制在20℃～30℃；对黑腐病、炭疽病，用75%的百菌清600倍液或25%瑞霉素600倍液，连续喷2～3次，间隔7～10天；在苗床周围撒生石灰防治蜗牛。

所述的胚培养方法中在培养基上播种方式是：成熟的种子播种于1/2MS+马铃薯泥5%的培养基上；未成熟的种子，在培养基中添加外源激素即细胞***素、生长素再播种，或播在1/2MS+NAAO0.2mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%的培养基上。

所述生根苗炼苗训化步骤中还需对种苗消毒、穴盘消毒、苗床消毒，种苗消毒采用2000倍多菌灵药液浸泡10分钟，穴盘播种前必须清洗干净，后采用0.1%高锰酸钾药液进行消毒；苗床在每育一批种苗后都须采用2000倍多菌灵药液喷湿透，反复2－3次消毒处理。

采用初代培养、继代培养（增殖培养）、生根壮苗培养三段式培养步骤，即初代培养将铁皮石斛种子在种子培养基中培养形成原球茎并进一步形成小芽，接着把铁皮石斛小芽转接于继代培养基中培养成具有2～3片真叶并带有1～2条幼根的小苗，再将小苗转移到生根壮苗培养基中培养成具有2～3条根、4片叶片、株高≥2.5cm、茎粗≥0.2cm的商品组培苗，然后将商品组培苗移栽至大棚内苗床上的基质中并培养至可采收。

通过实施本发明，种子萌发率高，芽苗生产快、污染低，商品组培苗粗壮、叶面展开、根系发达、成活率高；从而实现铁皮石斛种苗快速无毒繁育的目的，解决种苗稀缺难题。为推广栽培提供有力的科学依据和指导，使濒危铁皮石斛资源得到合理开发利用。

具体实施方式

以下作为本发明的实施例，对技术方案作进一步说明。

一、铁皮石斛初代培养：这是整个培养过程的基础，其目的是对外植体进行表面灭菌、建立无菌体系，这一阶段的效果依外植体的灭菌方法、接种操作手段以及培养基的成分而异。铁皮石斛无菌繁殖体系的建立，可通过两种方法（蒴果、茎尖或茎段）来实现。

1.种子（胚）培养，铁皮石斛的果实为蒴果、内部含有极多粉尘细小的种子（10～30万粒甚至更多），种子发育不全仅有一个简单的胚、缺少胚乳组织，自然条件下种子不发芽或发芽率极低。a、果实采集，8～9月份采集成熟种子，还没有裂开的蒴果。这时蒴果内的种子相互分离容易播种、灭菌，可只对蒴果进行表面灭菌即可。b、灭菌，去除蒴果宿存的花被、果柄，在无菌工作台内进行表面灭菌。用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗6次。C、播种，用无菌滤纸吸去蒴果表面水分、切开果皮，将粉末状种子均匀播撒在培养基表面或将种子直接撒在一定量的无菌水中摇匀，然后用无菌吸管取此混合液于无菌培养基上（此方法播种较均匀、出苗较整齐）。d、培养基，成熟的种子播种于1/2MS+马铃薯泥5%的培养基上，不需要添加外源激素。未成熟的种子，培养基需要添加外源激素，可播在1/2MS+NAAO0.2mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%的培养基上。e、培养条件，光照强度为1600～2000LX,光照时间10h/d,培养温度25±2℃。培养15～20天种子由黄色转绿、呈球形增大，基部有丝状毛的原球茎；50～60天长出大量的原球茎及分化出小苗。温度在25～27℃之间时，种子萌发生长较快；当温度低于15℃时，即使满足营养条件萌发率也较低；当温蒂在23～25℃时原球茎生长良好、增殖较快。

2、茎尖、幼茎培养，利用茎尖或幼嫩的带腋芽的茎段为繁殖材料进行培养。种苗可较好保持母株性状、生长整齐、长势旺、易于标准化生产，对新品种的选育和扩繁是非常有效的方法；但技术要求高、周期长、成本高、难度大，选择适宜的培养基及其方法至关重要。a、外植体（茎尖或幼茎）采集，选择长势、性状良好，无病虫的茎尖或带腋芽的幼茎，去除不要的叶、叶鞘等，用自来水冲洗、洗涤剂洗净，所述洗涤剂为餐具或水果用的洗涤用品。b、灭菌，在无菌工作台内用70%的酒精浸泡30秒钟，再用0.1%升汞溶液浸泡15分钟，之后用无菌水冲洗6次。c、接种，将灭菌的外植体用无菌滤纸吸去表面水分，并切割成3_5mm长带有一个节的茎段接种到诱导培养基上。

3、原球茎、侧芽诱导，A:1/2MS+BA0.2_0.5mg/L+NAA2_0.5mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%。B:1/2MS+6_BA1mg/L+NAA0.2mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%，pH值为5.8；茎尖、茎段接种到培养基A上进行侧芽的诱导，当诱导侧芽长成球型时，切去鳞片状叶被和周围变褐组织；也可以将新发的枝切割，反复培养，接种到B培养基上进行原球茎的诱导。60天后将原球茎分割成小块继续转接到B培养基上，以后每50～60天继代一次，使原球茎不断增殖。原球茎不经切割在诱导培养基B上培养60天左右，不定芽会逐渐产生，最后发育成带叶幼芽。

低浓度糖（2%）比较适合分化生长。培养条件：光照强度为1600～2000LX，光照时间10h/d,培养温度25±2℃。

二、铁皮石斛继代培养（增殖培养）：这一阶段培养目的是繁殖大量有效的芽尖或幼苗，使之数量扩大，迅速获得大量的无菌繁殖体系，达到组培快繁目的。1、将初代培养中获得的原球茎或芽转接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+马铃薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培养基上反复转接培养，母瓶转接的数量依生产规模、生产计划而定。2、接种时按照苗的生长情况，依大、中、小分类转接，培养瓶接种的数量因容器大小而定，疏密适中均匀，大小要一致。3、40～60天转接一次，时间过长易出现早衰、老化等现象。4、培养条件：温度25～27℃,光照8～10h/d光照强度1600～2000LX。

三、生根壮苗培养：瓶苗增值到一定数量，就要对部分苗分流进入壮苗与生根阶段，包括培养基、接种、培养条件、生根苗炼苗训化环节。1、培养基，1/2MS++NAA0.2mg/L+6_IBA0.2mg/L++马铃薯泥5%+香蕉泥10%+糖7－5%，pH值为5～8。2、接种，将继代培养中高度大2－3cm小苗分离成单株，接种到生根培养基上，接种密度因培养容器而定。3、培养条件，光照时间10～12h/d，光照强度：前两个月1600～2000LX、以后4000LX，培养温度25±2℃。当生根苗具有5～6片展叶，高度达6cm，根系正常时即可出瓶供移栽训化。3、生根苗炼苗训化，a、穴盘选择，不同规格的穴盘对种苗的生长影响差异很大，生产中应根据种苗大小、生长速度等因素来选择适合的穴盘，以兼顾生产效能和种苗质量，选用50孔穴盘。b、消毒，包括种苗消毒、穴盘消毒、基质消毒、苗床消毒等。种苗消毒采用2000倍多菌灵药液浸泡10分钟，穴盘播种前必须清洗干净，后采用0.1%高锰酸钾药液进行消毒处理，未经消毒的穴盘禁止反复使用。苗床在每育一批种苗后都要进行消毒处理。基质采用2000倍多菌灵药液浸泡24小时，然后堆捂发酵2～3个月。c、基质配制，炼苗基质用纯松树皮，规格大小为0.5×0.5cm,经消毒、发酵，并喷水充分湿润不能有块状，做到手握成团松手即散。d、移栽定植，要保证每个穴孔都有种苗，并且都要在孔的正中，移栽深度要适宜，不能埋到基部。e、移栽定植后管理，移栽定植后，浇透定根水，用遮光网遮光80%并根据空气温湿度，适当进行叶面喷雾，防止叶面脱水，7天后，逐步适当增强光照，避免强光直射。一般白天棚内保持27℃，夜间不低于15℃,15天后遮光70%，适时适量补水，防止干燥。每周用75%的百菌清600倍液喷雾一次，防病保苗。水肥管理是穴盘炼苗驯化能否成功的关键因素，频繁浇水会加速基质养分淋失，降低透气性，不利于根系生长，同时湿度过大，诱导病害发育，出现落叶、封顶等情况。因此穴盘苗浇水方法很重要，应在早晨浇足、浇透水，不要每天都浇水，做到适时适量浇透水，对水分不足的孔穴，可在下午进行点片补水。炼苗驯化20天后，施用颗粒缓释肥2kg/亩，01%花多多进行叶面喷雾，以保证种苗健壮、整齐。f、病虫害防治，搞好大棚的温度湿度调控，以及通风透气工作，以防病虫害发生，倘若发生黑腐病、炭疽病等，常用75%的百菌清600倍液或25%瑞霉素600倍液，连续喷2～3次，间隔7～10天。对蜗牛的防治，在苗床周围撒生石灰方法防治。

生产过程中的影响因素与解决措施：1、培养基，在规模化生产中，培养基的配制和使用很关键。应根据苗的长势情况适当调整培养基中生长调节剂的浓度，否则会造成因为生长调节剂过高或过低而严重影响繁殖和生长。2、培养条件，光对苗的生长繁殖有明显影响，表现在光强、光质、光周期等方面，要结合自己的情况，作适应的调整。培养瓶的透气状况对苗生长也有较大影响。3、继代周期，继代时间不是一成不变的，要根据培养目的、培养条件、所使用的培养基及苗的生长情况考虑。在前期扩繁阶段，为加快繁殖速度，当苗刚分化时就切割继代；后期在保持一定的繁殖基数的前提下，进行定量生产时，为了更多的大苗可以用来生根，可以间隔较长时间的继代，达到即可维持一定繁殖量又可以提高组培苗的目的。4、继代次数，继代次数不宜太多，具体表现为：生长不良、再生能力和增殖率下降等。5、污染，组织培养中污染是经常发生的，若控制不好必将增加生产成本，严重时导致造成毁灭性的损失。因此在整个生产过程中应加强管理、加强无菌意识，严格按照无菌操作程序和要求严格操作。

在海拔2050米的靖外村，按组培的目的、规模进行车间的设计和布局，按组培的自然工作程序先后安排成一条连续的生产线，避免环节倒排、造成日后的工作负担和引起混乱。

根据预期产量和投资规模以及植物组织培养生产的工艺流程，包括洗涤车间、培养基配制车间（称量室、配制室、灭菌室）、接种车间、培养车间、阳光大棚等。

采用初代培养、继代培养（增殖培养）、生根壮苗培养三段式培养步骤，即初代培养将铁皮石斛种子在种子培养基中培养形成原球茎并进一步形成小芽，接着把铁皮石斛小芽转接于继代培养基中培养成具有2～3片真叶并带有1～2条幼根的小苗，再将小苗转移到生根壮苗培养基中培养成具有2～3条根、4片叶片、株高≥2.5cm、茎粗≥0.2cm的商品组培苗，然后将商品组培苗移栽至大棚内苗床上的基质中并培养至可采收。通过实施本发明，种子萌发率高，芽苗生产快、污染低，商品组培苗粗壮、叶面展开、根系发达、成活率高；从而实现铁皮石斛种苗快速无毒繁育的目的，解决种苗稀缺难题。

探索研究大面积规范化种植的关键技术，总结栽培管理技术，使铁皮石斛大田推广种植有据可依。使濒危铁皮石斛资源得到合理开发利用。

采用内外遮塑膜大棚、架花床高密度无土基质栽培模式连片栽培，提高成活率达98%以上，铁皮石斛无土栽培方式不受场地限制，无论是阳台、窗台、桌面，还是地上、田间、树上、房间等都可用花盆、穴盘等种植，一个人就可以非常轻松地管理。最重要的是它的生长周期短，种植半年左右即可采收。

Claims (3)

1.铁皮石斛组培快繁方法，包括初代培养、继代培养、生根壮苗培养，其特征在于具体步骤如下：

一、初代培养

(1)、种子培养：a、果实采集，8～9月份采集成熟没有裂开的蒴果；b、灭菌，在无菌工作台内进行表面灭菌，用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗6次；c、播种，用无菌滤纸吸去蒴果表面水分、切开果皮，将粉末状种子均匀播撒在培养基表面或将种子直接撒在无菌水中摇匀，再用无菌吸管取此混合液置于无菌培养基上；d、培养条件，光照强度为1600～2000LX,光照时间10h/d,培养温度25±2℃；

(2)、茎尖、幼茎培养：a、茎尖或幼茎采集，选择长势、性状良好，无病虫的茎尖或带腋芽的幼茎，用自来水冲洗、洗涤剂洗净；b、灭菌，在无菌工作台内用70%的酒精浸泡30秒钟，再用0.1%升汞溶液浸泡15分钟，之后用无菌水冲洗至少6次；c、接种，将灭菌的茎尖用无菌滤纸吸去表面水分，并切割成3～5mm长并带有一个节的茎段，接种到后述的诱导培养基上；

(3)、原球茎、侧芽诱导：a、两种培养基：A:1/2MS+BA0.2～0.5mg/L+NAA2～0.5mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%；B:1/2MS+6_BA1mg/L+NAA0.2mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%，pH值为5.8；b、诱导步骤：ⅰ、茎尖、茎段接种到培养基A上进行侧芽的诱导，当诱导侧芽长成球型时，切去鳞片状叶被和周围变褐组织；ⅱ、或将新发的枝切割，反复培养，接种到B培养基上进行原球茎的诱导；ⅲ、60天后将原球茎分割成小块继续转接到B培养基上，以后每50～60天继代一次，使原球茎不断增殖；

二、铁皮石斛继代培养

(1)、将初代培养中获得的原球茎或芽转接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+马铃薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培养基上反复转接培养；反复转接的次数由需要的苗量决定；

(2)、接种时按照苗的生长情况，依大、中、小分类转接，培养瓶接种的数量因容器大小而定；

（3）40～60天转接一次；

（4）培养条件：温度25～27℃,光照8～10h/d光照强度1600～2000LX；

三、生根壮苗培养

（1）、培养基，1/2MS++NAA0.2mg/L+6_BIBA0.2mg/L++马铃薯泥5%+香蕉泥10%+糖7.5%，pH值为5.8；

（2）、接种，将继代培养中高度2～3cm小苗分离成单株，接种到步骤（1）所述生根培养基上；

（3）、培养条件，光照时间10～12h/d，光照强度：前两个月1600～2000LX、以后4000LX，培养温度25±2℃；当生根苗具有5～6片展叶，高度达6cm，根系正常时即可出瓶供移栽训化；

（4）、生根苗炼苗训化

a、炼苗基质选择，用纯松树皮，规格大小为0.5×0.5cm,经消毒、并喷水充分湿润、发酵制得，即采用2000倍多菌灵药液浸泡24小时，然后堆捂发酵2～3个月，做到手握成团松手即散；b、移栽定植，采用消毒的穴盘定植，移栽深度控制在不埋到苗的基部；c、移栽定植后管理，移栽定植后，浇透定根水，用遮光网遮光80%并根据空气温湿度，叶面喷雾，防止叶面脱水，7天后，以叶面不被灼伤为度，逐步增强光照；白天棚内保持27℃，夜间不低于15℃,15天后遮光70%，并补水防止干燥；每周用75%的百菌清600倍液喷雾一次，防病保苗；d、病虫害防治，搞好大棚的温度湿度调控及通风透气工作，相对湿度控制在60%～65%，温度控制在20℃～30℃；对黑腐病、炭疽病，用75%的百菌清600倍液或25%瑞霉素600倍液，连续喷2～3次，间隔7～10天；在苗床周围撒生石灰防治蜗牛。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛组培快繁方法，其特征在于胚培养方法中的在培养基上播种方式是：成熟的种子播种于1/2MS+马铃薯泥5%的培养基上；未成熟的种子，在培养基中添加外源激素即细胞***素、生长素再播种，或播在1/2MS+NAAO0.2mg/L+糖2%+马铃薯泥5%+香蕉泥5%的培养基上。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛组培快繁方法，其特征在于生根苗炼苗训化步骤中还需对种苗消毒、穴盘消毒、苗床消毒，种苗消毒采用2000倍多菌灵药液浸泡10分钟，穴盘播种前必须清洗干净，后采用0.1%高锰酸钾药液进行消毒；苗床在每育一批种苗后都须采用2000倍多菌灵药液喷湿透，反复2－3次消毒处理。