CN105026362A - 双环化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了式(I)化合物和/或其盐其中R为-OH或-OP(O)(OH)2。本发明还披露了使用上述化合物作为G蛋白偶联受体S1P1的选择性激动剂的方法，以及包含上述化合物的药物组合物。这些化合物可在多种治疗领域中用于治疗、预防疾病或病症(例如自身免疫性疾病和血管疾病)或减慢其进展。

Description

双环化合物
技术领域
本发明大体涉及可用作S1P1激动剂的双环化合物。本发明提供双环化合物、包含上述化合物的组合物及其使用方法。本发明进一步涉及包含至少一种本发明化合物的药物组合物，其可用于治疗与S1P1调控相关的疾病，例如自身免疫性疾病和血管疾病。
背景技术
神经鞘胺醇-1-磷酸酯(S1P)为神经鞘胺醇(Sph)的两性离子性溶血磷脂代谢物，该神经鞘胺醇又源自神经酰胺的酶性裂解。Sph通过两种激酶(SphK1和SphK2)的酶性磷酸化使得不但由红细胞产生大量S1P，而且由可能是淋巴内皮的耐辐射来源产生大量S1P(Pappu,R.et al.,Science 2007,316,295–298)。最初认为S1P仅作为细胞内信号传导分子操作，其后来经鉴定为G蛋白偶联受体(GPCR)的内皮分化基因(EDG)类的5个成员的高亲和力配体，所述5个成员命名为S1P1或S1P1、S1P2或S1P2、S1P3或S1P3、S1P4或S1P4和S1P5或S1P5(先前分别称为EDG-1、EDG-5、EDG-3、EDG-6和EDG-8)(Chun,J.et al.,Pharmacological Rev.2010,62,579-587)。S1P与S1P受体的相互作用在许多过程中发挥基本生理学作用，包括细胞增殖、细胞形态、肿瘤细胞侵袭、血管形成、肿瘤形成、细胞支架重排、血管发生和淋巴细胞运输(Olivera,A；Rivera,J.Adv Exp Med Biol.2011,716,123–142)。因此，S1P受体为多种治疗应用(例如肿瘤生长抑制、血管疾病和自身免疫性疾病)的良好靶标。
在五种S1P受体中，S1P1分布较广泛。S1P1是在淋巴细胞上表达的主要家族成员且在淋巴细胞运输中发挥重要作用。免疫细胞由类淋巴器官(例如胸腺和***)流出进入***中需要S1P与其受体S1P1发生相互作用。S1P1受体的下调(这可通过用S1P1的激动剂进行处理经由受体内化来实现)中断淋巴细胞向多种组织的迁移和归巢。者使得淋巴细胞束缚在淋巴器官中，由此减少能够迁移至受侵袭组织的循环淋巴细胞的数量。对抑制淋巴细胞迁移至与自身免疫和异常发炎过程相关的靶标位点的S1P1受体调控剂的开发可能在多种自身免疫性和炎性疾病状态中有效。
下列申请已描述作为S1P1激动剂的化合物：WO 03/061567(美国专利申请第2005/0070506号)、WO 03/062248(美国专利第7,351,725号)、WO03/062252(美国专利第7,479,504号)、WO 03/073986(美国专利第7,309,721号)、WO 03/105771、WO 05/058848、WO 05/000833、WO 05/082089(美国专利申请第2007/0203100号)、WO 06/047195、WO 06/100633、WO06/115188、WO 06/131336、WO 2007/024922、WO 07/109330、WO 07/116866、WO 08/023783(美国专利申请第2008/0200535号)、WO 08/029370、WO08/074820、WO 08/079382、WO 08/114157、WO 09/043889、WO 09/057079和美国专利第6,069,143号。还参见Hale et al.,J.Med.Chem.,47:6662(2004)。
仍需要可用作S1P1激动剂而对S1P3具有选择性的化合物。另外，仍需要可用作S1P1激动剂的化合物，其对S1P3具有选择性且还具有最小或不具有不期望的肺效应。
申请人已发现作为S1P1激动剂具有活性的有效化合物。另外，申请人已发现作为S1P1激动剂具有活性且对S1P3具有选择性的化合物。另外，申请人已发现作为S1P1激动剂具有活性化合物对S1P3具有选择性且具有最小或不具有不期望的肺效应。这些化合物经提供可用作具有期望稳定性、生物利用度、治疗指数和对其可药性(drugability)重要的毒性值的药物。
发明内容
本发明提供双环化合物，其可用作S1P1活性的调控剂，包括其盐和前药。
本发明还提供药物组合物，其包含式(I)化合物和/或其药用盐；以及药用载体。
本发明还提供治疗与G蛋白偶联受体S1P1的活性相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物患者给药式(I)化合物和/或其药用盐。
本发明还提供用于制备式(I)化合物和/或其盐的方法和中间体。
本发明还提供式(I)化合物和/或其药用盐，其用于疗法中。
本发明还提供式(I)化合物和/或其药用盐的用途，其用于制造治疗或预防与S1P1受体相关的病况(例如自身免疫性和血管疾病)的药物。
式(I)化合物及包含式(I)化合物的组合物可用于治疗、预防或治愈各种与S1P1相关的病况。包含这些化合物的药物组合物可用于治疗、预防各种治疗领域中的疾病或病症(例如自身免疫性和血管疾病)或减慢其进展。
随着本公开内容的继续以展开形式描述本发明的这些和其他特性。
附图简述
通过参考下文所述的附图来说明本发明。
图1显示实施例2的化合物的N-1形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图2显示实施例2的化合物的单HCl盐的一水合物H-1形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图3显示实施例2的化合物的单HCl盐的一水合物H-2形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图4显示实施例2的化合物的单HCl盐的N-3形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图5显示实施例2的化合物的单HCl盐的N-4形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图6显示实施例2的化合物的半L-苹果酸盐的一水合物H-1形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图7显示实施例2的化合物的半丙二酸盐的一水合物H-1形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图8显示实施例2的化合物的2/3磷酸盐的1/3水合物H.33-1形式的实验和模拟PXRD图案(CuKα在约25℃)。
图9显示实施例2的化合物的R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式的在-70℃计算的模拟PXRD图案(CuKα)。
具体实施方式
本发明的第一方面提供至少一种式(I)化合物和/或其盐：
其中R为-OH或-OP(O)(OH)2。
一个实施方案提供式(I)化合物和/或其盐，其中R为-OP(O)(OH)2。此实施方案的化合物具有式(II)的结构：
此实施方案包括式(IIa)化合物
和式(IIb)化合物：
式(II)化合物和/或其盐可用作S1P1的选择性激动剂。
一个实施方案提供式(I)化合物和/或其盐，其中R为-OH。该实施方案的化合物具有式(III)的结构：
该实施方案包括式(IIIa)化合物
和式(IIIb)化合物：
式(III)化合物和/或其盐可用作式(II)化合物的前药。式(III)化合物在体内通过磷酸化活化从而得到式(II)化合物。式(II)化合物作为S1P1的选择性激动剂具有活性。
一个实施方案提供式(I)化合物和/或其盐，其具有式(IV)的结构：
其中R为-OH或-OP(O)(OH)2。该实施方案包括式(IIa)和式(IIIa)的化合物。
一个实施方案提供式(I)化合物和/或其盐，其具有式(V)的结构：
其中R为-OH或-OP(O)(OH)2。该实施方案包括式(IIb)和式(IIIb)的化合物。
一个实施方案提供式(IIa)化合物和/或其盐。
一个实施方案提供式(IIb)化合物和/或其盐。
一个实施方案提供式(IIIa)化合物和/或其盐。
一个实施方案提供式(IIIb)化合物和/或其盐。
一个实施方案提供式(IIa)化合物。
一个实施方案提供式(IIb)化合物。
一个实施方案提供式(IIIa)化合物。
一个实施方案提供式(IIIb)化合物。
一个实施方案提供一种或多种式(IIa)化合物的盐。
一个实施方案提供一种或多种式(IIb)化合物的盐。
一个实施方案提供一种或多种式(IIIa)化合物的盐。
一个实施方案提供一种或多种式(IIIb)化合物的盐。
一个实施方案提供呈HCl盐形式的式(III)化合物。
一个实施方案提供呈HCl盐形式的式(IIIa)化合物。
一个实施方案提供呈HCl盐形式的式(IIIb)化合物。
一个实施方案提供呈磷酸盐形式的式(III)化合物。
一个实施方案提供呈磷酸盐形式的式(IIIa)化合物。
一个实施方案提供呈磷酸盐形式的式(IIIb)化合物。
一个实施方案提供呈L-苹果酸盐形式的式(IIIb)化合物。
一个实施方案提供呈丙二酸盐形式的式(III)化合物。
一个实施方案提供呈丙二酸盐形式的式(IIIa)化合物。
一个实施方案提供呈丙二酸盐形式的式(IIIb)化合物。
一个实施方案通过呈R-(+)-苦杏仁酸盐形式的式(IIIb)化合物。
一个实施方案提供呈选自HCl盐、磷酸盐和丙二酸盐的盐形式的式(III)化合物。
一个实施方案提供呈选自HCl盐、磷酸盐和丙二酸盐的盐形式的式(IIIa)化合物。
一个实施方案通过呈选自HCl盐、磷酸盐、L-苹果酸盐、丙二酸盐、和R-(+)-苦杏仁酸盐的盐形式的式(IIIb)化合物。
一个实施方案提供选自((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇和((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇的化合物；及其盐。
一个实施方案提供选自二氢磷酸((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲基酯和二氢磷酸((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲基酯的化合物；及其盐。
一个实施方案提供选自((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇和二氢磷酸((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯的化合物；及其盐。
一个实施方案提供选自((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇和二氢磷酸((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯的化合物；及其盐。
实施例2的化合物的盐和晶体形式：
表1
实施例2的盐和结晶形式
实施例2 形式
游离碱 N-1
单HCl盐(一水合物) H-1
单HCl盐(一水合物) H-2
单HCl盐 N-3
单HCl盐 N-4
半-L-苹果酸盐(一水合物) H-1
半-丙二酸盐(一水合物) H-1
2/3-磷酸盐(1/3水合物) H.33-1
R-(+)-苦杏仁酸盐 N-1
实施例2的形式N-1，游离碱
在一个实施方案中，实施例2的化合物作为包含第一结晶形式的结晶物质提供
实施例2的化合物的第一结晶形式包括实施例2的纯净结晶形式(在本文中称作“形式N-1”或“N-1形式”)。
在一个实施方案中，实施例2的N-1形式的特征在于大约等于下列参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝90.0°
γ＝90.0°
空间群：P212121
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.098g/cm3，
其中实施例2的形式N-1的单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2的N-1形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图1中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图1中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的N-1形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.6±0.2、7.2±0.2、12.5±0.2、14.0±0.2、15.0±0.2、17.5±0.2、19.4±0.2、20.4±0.2和23.8±0.2，其中形式N-1的PXRD图案在约25℃的温度测得。
在又一实施方案中，实施例2的N-1形式是基本上纯的。
在再一实施方案中，基于实施例2的形式N-1的重量，实施例2的N-1形式含有至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％。
在再一实施方案中，实施例2的基本上纯的形式N-1具有基本上纯的相均匀性，且小于约10％、优选地小于约5％、且更优选地小于约2％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。最优选地，实施例2的基本上纯的结晶形式N-1具有基本上纯的相均匀性，且小于约1％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。
在另一实施方案中，实施例2的结晶形式基本上由形式N-1组成。基于该结晶形式的重量，该实施方案的结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的实施例2的形式N-1。
在再一实施方案中，提供药物组合物，其包含实施例2的形式N-1；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在再一实施方案中，药物组合物包含实施例2的基本上纯的形式N-1；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在又一实施方案中，将治疗有效量的实施例2的形式N-1与至少一种药用载体和/或稀释剂组合以提供至少一种药物组合物。
实施例2的HCl盐
在一个实施方案中，实施例2以盐酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，以对于每摩尔实施例2包含1摩尔HCl的单盐酸盐形式提供实施例2。
在一个实施方案中，实施例2的单盐酸盐以包含一种或多种结晶形式的结晶物质的形式提供。实施例2的单盐酸盐的适宜结晶形式的实例包括形式H-1、H-2、N-3和N-4。
在一个实施方案中，实施例2的单盐酸盐以一水合物的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2的一水合物单盐酸盐以包含一种或多种结晶形式的结晶物质的形式提供。实施例2的一水合物单盐酸盐的适宜结晶形式的实例包括形式H-1和H-2。
在一个实施方案中，实施例2的一水合物单盐酸盐以实施例2HCl盐的第二结晶形式(在本文中称作“形式H-1”或“H-1形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2HCl盐的H-1形式包含一分子水和一分子HCl。
在一个实施方案中，实施例2的单盐酸盐的H-1形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝90.0°
γ＝90.0°
空间群：P212121
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.14g/cm3，
其中实施例2的单盐酸盐的形式H-1的单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2的单盐酸盐的H-1形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图2中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图2中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的单HCl盐的一水合物H-1形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.2±0.2、6.4±0.2、9.6±0.2、13.9±0.2、14.6±0.2、17.0±0.2、19.0±0.2、20.1±0.2、21.3±0.2、21.9±0.2及24.5±0.2，其中PXRD图案在约25℃的温度测得。
在又一实施例中，实施例2的单盐酸盐的H-1形式是基本上纯的。
在再一实施方案中，基于第二结晶形式的重量，实施例2的单盐酸盐的H-1形式含有至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的实施例2HCl盐的形式H-1。
在再一实施方案中，基本上纯的第二结晶形式具有基本上纯的相均匀性，且小于约10％、优选地小于约5％且更优选地小于约2％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。最优选地，基本上纯的第二结晶形式具有基本上纯的相均匀性，且小于约1％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。
在另一实施方案中，实施例2的单HCl盐的第二结晶形式基本上由形式H-1组成。基于第二结晶形式的重量，该实施方案的第二结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的形式H-1。
在一个实施方案中，实施例2的一水合物单盐酸盐以实施例2HCl盐的第三结晶形式(在本文中称作“形式H-2”或“H-2形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2HCl盐的H-2形式包含一分子水和一分子HCl。
在一个实施方案中，实施例2的单盐酸盐的H-2形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝96.0°
γ＝90.0°
空间群：P21
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.135g/cm3，
其中实施例2HCl盐的H-2形式的单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2HCl盐的H-2形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图3中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图3中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的单HCl盐的一水合物H-2形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.2±0.2、6.4±0.2、9.6±0.2、14.1±0.2、15.2±0.2、16.8±0.2、18.8±0.2、20.2±0.2、21.3±0.2、22.6±0.2和26.6±0.2，其中PXRD图案在约25℃的温度测得。
在又一实施例中，实施例2HCl盐的H-2形式是基本上纯的。
在再一实施方案中，基于第三结晶形式的重量，实施例2HCl盐的H-2形式含有至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％。
在再一实施方案中，实施例2HCl盐的基本上纯的H-2形式具有基本上纯的相均匀性，且小于约10％、优选地小于约5％且更优选地小于约2％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。最优选地，实施例2HCl盐的基本上结晶H-2形式具有基本上纯的相均匀性，且小于约1％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。
在另一实施方案中，实施例2的化合物的第三结晶形式基本上由实施例2HCl盐的H-2形式组成。基于第三结晶形式的重量，该实施方案的第三结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％。
在一个实施方案中，实施例2的单盐酸盐以包含一种或多种结晶形式的纯净结晶物质的形式提供。实施例2的纯净单盐酸盐的适宜结晶形式的实例包括形式N-3和N-4。
在一个实施方案中，实施例2的纯净单盐酸盐以实施例2HCl盐的第四结晶形式(在本文中称作“形式N-3”或”N-3形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2HCl盐的N-3形式包含一分子HCl。
在一个实施方案中，实施例2的HCl盐的N-3形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝91.7°
γ＝90.0°
空间群：P21
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.092g/cm3，
其中实施例2的HCl盐的形式N-3的单位晶胞参数在约27℃的温度测得。
在一个实施方案中，实施例2的HCl盐的N-3形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝90.2°
γ＝90.0°
空间群：P21
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.128g/cm3，
其中实施例2的HCl盐的形式N-3单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2HCl盐的N-3形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图4中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图4中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的单HCl盐的N-3形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.4±0.2、6.9±0.2、10.4±0.2、12.7±0.2、14.0±0.2、16.1±0.2、19.7±0.2、20.6±0.2、22.1±0.2和24.0±0.2，其中该PXRD图案系在约25℃的温度测得。
在又一实施方案中，实施例2的HCl盐的N-3形式是基本上纯的。
在再一实施方案中，基于第四结晶形式的重量，实施例2的HCl盐的N-3形式含有至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的形式N-3。
在再一实施方案中，实施例2的HCl盐的基本上纯的形式N-3具有基本上纯的相均一性，且小于约10％、优选地小于约5％且更优选地小于约2％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。最优选地，实施例2的HCl盐的基本上结晶形式N-3具有基本上纯的相均一性，且小于约1％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。
在又一实施方案中，实施例2的HCl盐的形式N-3是基本上纯的。
在另一实施方案中，实施例2的结晶形式基本上由形式N-3组成。基于结晶形式的重量，该实施方案的结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的实施例2的形式N-3。
在再一实施方案中，提供药物组合物，其包含实施例2的形式N-3；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在再一实施方案中，药物组合物包含基本上纯的实施例2的形式N-3；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在又一实施方案中，将治疗有效量的实施例2的形式N-3与至少一种药用载体和/或稀释剂组合以提供至少一种药物组合物。
在另一实施方案中，实施例2的HCl盐的第四结晶形式基本上由形式N-3组成。基于第四结晶形式的重量，该实施方案的第四结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的形式N-3。
在一个实施方案中，实施例2的纯净单盐酸盐以实施例2HCl盐的第五结晶形式(在本文中称作“形式N-4”或“N-4形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2HCl盐的N-4形式包含一分子HCl。
在一个实施方案中，实施例2的HCl盐的N-4形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝90.0°
γ＝90.0°
空间群：P212121
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.088g/cm3，
其中实施例2HCl盐的形式N-4单位晶胞参数在约27℃的温度测得。
在一个实施方案中，实施例2的HCl盐的N-4形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝90.0°
γ＝90.0°
空间群：P212121
实施例2的分子/不对称单元：1
密度(计算)＝1.119g/cm3，
其中实施例2HCl盐的形式N-4单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2HCl盐的N-4形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图5中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图5中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的单HCl盐的N-4形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.4±0.2、6.9±0.2、10.3±0.2、12.7±0.2、13.3±0.2、15.0±0.2、19.7±0.2、20.4±0.2、21.2±0.2、22.9±0.2和24.9±0.2，其中该PXRD图案在约25℃的温度测得。
在又一实施方案中，实施例2的HCl盐的N-4形式是基本上纯的。
在再一实施方案中，基于第四结晶形式的重量，实施例2的HCl盐的N-4形式含有至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的形式N-4。
在再一实施方案中，实施例2的HCl盐的基本上纯的形式N-4具有基本上纯的相均匀性，且小于约10％、优选地小于约5％且更优选地小于约2％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。最优选地，实施例2的HCl盐的基本上结晶形式N-4具有基本上纯的相均匀性，且小于约1％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。
在又一实施方案中，实施例2的HCl盐的形式N-4是基本上纯的。
在另一实施方案中，实施例2的结晶形式基本上由形式N-4组成。基于结晶形式的重量，该实施方案的结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的实施例2的形式N-4。
在再一实施方案中，提供药物组合物，其包含实施例2的形式N-4；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在再一实施方案中，药物组合物包含基本上纯的实施例2的形式N-4；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在又一实施方案中，将治疗有效量的实施例2的形式N-4与至少一种药用载体和/或稀释剂组合以提供至少一种药物组合物。
在一个实施方案中，提供包含实施例2的纯净单盐酸盐的形式N-3、形式N-4或其混合物的组合物。
L-苹果酸盐
在一个实施方案中，实施例2以L-苹果酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含0.5摩尔L-苹果酸的半-L-苹果酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含1摩尔水和0.5摩尔L-苹果酸的一水合物半-L-苹果酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2的一水合物半-L-苹果酸盐以实施例2半-L-苹果酸盐的第六结晶形式(在本文中称作“形式H-1”或“H-1形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2半-L-苹果酸盐的H-1形式包含一分子水和0.5分子L-苹果酸。
在一个实施方案中，实施例2的半-L-苹果酸盐的H-1形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝103.4°
β＝94.0°
γ＝92.6°
空间群：P1
实施例2的分子/不对称单元：4
密度(计算)＝1.165g/cm3，
其中实施例2的半-L-苹果酸盐的形式H-1单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2的半-L-苹果酸盐的H-1形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图6中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图6中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的半-L-苹果酸盐的H-1形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.2±0.2、6.3±0.2、9.5±0.2、12.8±0.2、14.3±0.2、18.0±0.2、22.4±0.2和24.8±0.2，其中该PXRD图案在约25℃的温度测得。
丙二酸盐
在一个实施方案中，实施例2以丙二酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含0.5摩尔丙二酸的半-丙二酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含1摩尔水和0.5摩尔丙二酸的一水合物半-丙二酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2的一水合物半-丙二酸盐以实施例2半-丙二酸盐的第七结晶形式(在本文中称作“形式H-1”或“H-1形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2半丙二酸盐的H-1形式包含一分子水和0.5分子丙二酸。
在一个实施方案中，实施例2的半-丙二酸盐的H-1形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝93.8°
γ＝90.0°
空间群：P21
实施例2的分子/不对称单元：2
密度(计算)＝1.137g/cm3，
其中形式H-1单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2的半丙二酸盐的H-1形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图7中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图7中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的半-丙二酸盐的H-1形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：3.5±0.2、7.1±0.2、12.3±0.2、13.5±0.2、15.5±0.2、17.6±0.2、19.1±0.2、20.2±0.2、20.6±0.2、21.7±0.2和23.8±0.2，其中该PXRD图案系在约25℃的温度测得。
磷酸盐
在一个实施方案中，实施例2以磷酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以1/3水合磷酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含0.67摩尔磷酸的磷酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含0.33摩尔水和0.67磷酸的1/3水合磷酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2的1/3水合物磷酸盐以实施例2磷酸盐的第八结晶形式(在本文中称作“形式H.33-1”或“H.33-1形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2磷酸盐的H.33-1形式包含0.33分子水和0.67分子磷酸。
在一个实施方案中，H.33-1形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝90.0°
β＝94.7°
γ＝90.0°
空间群：C2
实施例2的分子/不对称单元：3
密度(计算)＝1.181g/cm3，
其中形式H.33-1单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2的1/3磷酸盐的H.33-1形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图8中所显示图案一致和/或实测PXRD图案基本上与图8中所显示图案一致。
在再一实施方案中，实施例2的1/3-磷酸盐的H.33-1形式的特征在于包含4个或更多个、优选地5个或更多个选自以下2θ值的PXRD图案(CuKα在约25℃的温度)：2.9±0.2、5.9±0.2、8.8±0.2、13.9±0.2、15.8±0.2、16.7±0.2、17.4±0.2、18.4±0.2、19.4±0.2和20.4±0.2，其中该PXRD图案在约25℃的温度测得。
R-(+)-苦杏仁酸盐
在一个实施方案中，实施例2以R-(+)-苦杏仁酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以一水合物R-(+)-苦杏仁酸的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含1摩尔R-(+)-苦杏仁酸和R-(+)-苦杏仁酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2以对于每一摩尔实施例2而言包含1摩尔水和1摩尔R-(+)-苦杏仁酸的一水合物R-(+)-苦杏仁酸盐的形式提供。
在一个实施方案中，实施例2的一水合物R-(+)-苦杏仁酸盐以实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的第九结晶形式(在本文中称作“形式N-1”或“N-1形式”)提供。对于每一分子实施例2而言，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式包含一分子水和一分子R-(+)-苦杏仁酸。
在一个实施方案中，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式的特征在于大约等于以下参数的单位晶胞参数：
晶胞尺寸：
α＝98.2°
β＝91.3°
γ＝91.7°
空间群：P1
实施例2的分子/不对称单元：2
密度(计算)＝1.171g/cm3，
其中实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的形式N-1单位晶胞参数在约-70℃的温度测得。
在另一实施方案中，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式的特征在于模拟粉末x射线衍射(PXRD)图案基本上与图9中所显示图案一致。
在又一实施方案中，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式是基本上纯的。
在再一实施方案中，基于实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的形式N-1的重量，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式含有至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％。
在再一实施方案中，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的基本上纯的形式N-1具有基本上纯的相均匀性，且小于约10％、优选地小于约5％且更优选地小于约2％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。最优选地，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的基本上纯的结晶形式N-1具有基本上纯的相均匀性，且小于约1％的实验所测得PXRD图案的总峰面积源于模拟PXRD图案不存在的峰。
在另一实施方案中，实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的结晶形式基本上由形式N-1组成。基于结晶形式的重量，该实施方案的结晶形式可包含至少约90wt.％、优选地至少约95wt.％且更优选地至少约99wt.％的实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的形式N-1。
在再一实施方案中，提供药物组合物，其包含实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的形式N-1；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在再一实施方案中，提供药物组合物，其包含实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的基本上纯的形式N-1；及至少一种药用载体和/或稀释剂。
在又一实施方案中，将治疗有效量的实施例2R-(+)-苦杏仁酸盐的形式N-1与至少一种药用载体和/或稀释剂组合以提供至少一种药物组合物。
本发明可以其他特定形式实施，而并不背离本发明的精神或基本属性。本发明涵盖本文所述的本发明的方面和/或实施例的所有组合。应当理解的是，本发明的任一及所有实施方案皆可结合任一或多个其他实施方案来阐述其他实施方案。还应当理解的是，实施实施方案的每一个别要素意欲与任一实施方案的任一及所有其他要素组合来阐述另一实施方案。
定义
本领域普通技术人员在阅读下列详细描述后可更易于了解本发明的特性和优点。应当理解的是，还可将在上下文中在单独实施方案的背景下出于清晰原因阐述的本发明的某些特性进行组合来形成单一实施方案。反之，还可将出于简洁原因在单一实施方案的背景下阐述的本发明的各种特性组合，以便形成其亚组合。在本文中标识为示例性或优选的实施方案意欲用于说明而非具有限制性。
除非本文另外明确说明，否则所提及的单数形式也可包括复数形式。例如，“一种”可指一种或者一种或多种。
如本文所使用，短语“化合物和/或其盐”是指至少一种化合物、化合物的至少一种盐或其组合。例如，式(I)化合物和/或其盐包括式(I)化合物；两种式(I)化合物；式(I)化合物的盐；式(I)化合物和一种或多种式(I)化合物的盐；及两种或更多种式(I)化合物的盐。
除非另有指示，否则假定具有未满足化合价的任一原子具有足以满足所述化合价的氢原子。
下文列示用于阐述本发明的各种术语的定义。除非在特定情况下另有限制，否则当在本说明书通篇个别地或作为较大群组的部分使用这些术语时，这些定义适用于所述术语。本文所述的定义优于通过引用的方式并入本文中的任一专利、专利申请和/或专利申请公开中所述的定义。
在本说明书通篇中，本领域技术人员可选择基团和其取代基以提供稳定的部分和化合物。
短语“药用”在本文中用来指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理医学判断范围内适于与人类和动物组织接触，而无过大毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，且与合理益处/风险比相称。
式(I)化合物可形成也在本发明范围内的盐。除非另有指示，否则对本发明化合物的提及应理解为包括体积其一种或多种盐。术语“(一种或多种)盐”表示与无机酸及碱和/或有机酸及碱形成的酸性和/或碱性盐。另外，术语“(一种或多种)盐”在(例如)式(I)化合物既含碱性部分(例如胺或吡啶或咪唑环)又含酸性部分(例如羧酸)时可包括两性离子(内盐)。优选药用(即，非毒性、生理上可接受的)盐，例如，可接受的金属和胺盐，其中阳离子不引起所述盐的显著毒性或生物活性。然而，其他盐可用于(例如)可在制备期间采用的分离或纯化步骤中，且因此，其涵盖在本发明的范围内。例如，可通过使式(I)化合物与一定量(例如，1当量量)的酸或碱在例如使盐沉淀的介质等介质中或在水性介质中反应随后实施冻干来形成式(I)化合物的盐。
示例性酸加成盐包括乙酸盐(例如与乙酸或三卤乙酸(例如三氟乙酸)形成的盐)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、枸橼酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(与盐酸形成)、氢溴酸盐(与溴化氢形成)、氢碘酸盐、马来酸盐(与马来酸形成)、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐(与甲磺酸形成)、萘-2-磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如与硫酸形成的盐)、磺酸盐(例如本文中所述的磺酸盐)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate)(例如甲苯磺酸盐(tosylate))、十一烷酸盐等。
示例性碱性盐包括铵盐；碱金属盐，例如钠盐、锂盐和钾盐；碱土金属盐，例如钙盐庚烷镁盐；钡盐、锌盐和铝盐；与有机碱(例如，有机胺)形成的盐，例如三烷基胺(例如三乙胺)、普鲁卡因(procaine)、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙胺、1-麻黄胺(1-ephenamine)、N,N'-二苄基乙二胺、去氢松香胺、N-乙基哌啶、苄胺、二环己基胺或类似的药用胺；以及与氨基酸(精氨酸、赖氨酸等)形成的盐。可使用如下试剂使碱性含氮基团季铵化：低级烷基卤化物(例如，甲基、乙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如，硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如，苄基和苯乙基的溴化物)及其他。优选的盐包括单盐酸盐、硫酸氢盐、甲磺酸盐、磷酸盐或硝酸盐。
可以非晶形固体或结晶固体形式提供式(I)化合物。可采用冻干法以固体形式提供式(I)化合物。
应当进一步理解的是，式(I)化合物的溶剂化物(例如，水合物)也在本发明的范围内。术语“溶剂化物”意指式(I)化合物与一种或多种溶剂分子(有机或无机)的物理缔合。该物理缔合包括氢键。在某些情况中，例如，在一或多个溶剂分子纳入结晶固体的晶格中时，溶剂化物将能够进行分离。“溶剂化物”涵盖溶液相和可分离溶剂化物二者。示例性溶剂化物包括水合物、乙醇合物、甲醇合物、异丙醇合物、乙腈溶剂化物和乙酸乙酯溶剂化物。溶剂化方法是本领域中已知的。
各种形式的前药是本领域中公知的且述于以下文献中：
a)Wermuth,C.G.et al.,The Practice of Medicinal Chemistry,Chapter 31,Academic Press(1996)；
b)Bundgaard,H.ed.,Design of Prodrugs,Elsevier(1985)；
c)Bundgaard,H.,Chapter 5,“Design and Application of Prodrugs”,Krogsgaard-Larsen,P.et al.,eds.,A Textbook of Drug Design and Development,pp.113-191,Harwood Academic Publishers(1991)；和
d)Testa,B.et al.,Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism,Wiley-VCH(2003)。
另外，在制备式(I)化合物后可对其实施分离和纯化，以获得含有等于或大于99wt％量的式(I)化合物(“基本上纯”)的组合物，然后如本文所述对其进行使用或调配。上述“基本上纯”的式(I)化合物也作为本发明的部分涵盖于本文中。
“稳定化合物”和“稳定结构”意欲指示化合物足够强健从而可以可用纯度从反应混合物中分离出，且可将其调配成有效治疗剂。本发明意欲体现(embody)稳定化合物。
“治疗有效量”意欲包括有效充当S1P1的激动剂或有效治疗或预防自身免疫性和/或炎性疾病状态(例如多发性硬化和类风湿性关节炎)的单独本发明化合物的量，或要求保护的化合物的组合的量，或与其他活性成分组合的本发明化合物的量。
如本文所使用，“治疗”或“处置”涵盖哺乳动物(具体为人类)中疾病状态的治疗，且包括：(a)在哺乳动物中、具体而言在该哺乳动物易患有疾病状态但尚未被诊断出患有该疾病状态时预防该疾病状态发生；(b)抑制疾病状态，即阻止其发展；和/或(c)缓解疾病状态，即使疾病状态减退。
本发明化合物意欲包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但具有不同质量数的那些原子。以一般实例的方式但并非限制，氢的同位素包含氘(D)和氚(T)。碳的同位素包括13C和14C。经同位素标记的本发明化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术来制备，或可通过与本文中所述方法类似的方法使用经适当同位素标记的试剂代替原本采用的未经标记的试剂来制备。
式(I)化合物和/或其药用盐可以适于所要治疗病况的任何方式来给药，此可取决于对位点特异性治疗或所要递送的式(I)化合物的数量的需要。
包含以下的药物组合物也涵盖于本发明内：式(I)化合物和/或其药用盐；及一种或多种非毒性、药用载体和/或稀释剂和/或佐剂(在本文中统称作“载体”材料)和(若需要)其他活性成分。式(I)化合物可通过任何适宜途径给药，优选地以适于此种途径的药物组合物形式且以对期望治疗有效的剂量给药。本发明的化合物和组合物可(例如)口服、经黏膜或胃肠外(包括血管内、静脉内、腹膜内、皮下、肌内和胸骨内)以含有常规药用载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂给药。例如，药物载体可含有甘露醇或乳糖与微晶纤维素的混合物。所述混合物可含有其他组分，例如润滑剂(例如硬脂酸镁)和崩解剂(例如交聚维酮(crospovidone))。可将载体混合物填充至明胶胶囊中或压缩成片剂。药物组合物可以(例如)口服剂型或输注形式给药。
对于口服给药而言，药物组合物可呈(例如)片剂、胶囊、液体胶囊、悬浮液或液体形式。药物组合物优选地制备成含有具体量的活性成分的剂量单位形式。例如，可以包含如下范围量的活性成分的片剂或胶囊形式提供药物组合物：约0.1mg至1000mg、优选地约0.25mg至250mg且更优选地约0.5mg至100mg。适于人类或其他哺乳动物的日剂量可取决于患者的病况及其他因素在很大范围内变化，但可使用常规方法来确定。
本文所涵盖的任一药物组合物可(例如)经由任一可接受且适宜的口服制剂口服递送。示例性口服制剂包括但不限于，例如片剂、含片、锭剂、水性和油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬胶囊和软胶囊、液体胶囊、糖浆和酏剂。意欲口服给药的药物组合物可根据本领域已知用于制造意欲口服给药的药物组合物的任何方法来制备。为提供药学上适口的制剂，本发明的药物组合物可含有至少一种选自以下的试剂：增甜剂、矫味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂和防腐剂。
可通过(例如)将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐与至少一种适于制造片剂的非毒性药用赋形剂混合来制备片剂。示例性赋形剂包括但不限于，例如惰性稀释剂，例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如，微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，例如，淀粉、明胶、聚乙烯基-吡咯烷酮和***胶(acacia)；以及润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。另外，片剂可为未经包覆的，或通过已知技术包覆的，以掩蔽不愉快味道药物的难闻味道，或延迟活性成分在胃肠道中的崩解和吸收，由此使活性成分的效应维持较长时段。示例性水溶性掩蔽材料包括但不限于，羟基丙基-甲基纤维素和羟基丙基-纤维素。示例性延时材料包括但不限于，乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
可通过例如将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其盐与至少一种惰性固体稀释剂例如，碳酸钙、磷酸钙和高岭土)混合来制备硬明胶胶囊。
可通过例如将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐与至少一种水溶性载体(例如，聚乙二醇)和至少一种油介质(例如，花生油、液体石蜡及橄榄油)混合来制备软明胶胶囊。
可通过例如，将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐与至少一种适于制造水性悬浮液的赋形剂混合来制备水性悬浮液。适于制造水性悬浮液的示例性赋形剂包括但不限于，例如悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯基-吡咯烷酮、黄耆胶和***胶；分散剂或润湿剂，例如，天然磷脂，例如，卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯；以及环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如，聚乙烯去水山梨醇单油酸酯。水性悬浮液还可含有至少一种防腐剂，例如，对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙基酯；至少一种着色剂；至少一种矫味剂；和/或至少一种增甜剂，包括但不限于，例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜(aspartame)。
可通过例如将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐悬浮于植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油和椰油)或矿物油(例如，液体石蜡)中来制备油性悬浮液。油性悬浮液还可含有至少一种增稠剂，例如，蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。为提供适口的油性悬浮液，可将至少一种已述于上文中的增甜剂和/或至少一种矫味剂添加至油性悬浮液中。油性悬浮液可进一步含有至少一种防腐剂，其包括但不限于，例如抗氧化剂，例如，丁基化羟基甲苯醚和α生育酚。
可通过例如将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐与至少一种分散剂和/或润湿剂、至少一种悬浮剂和/或至少一种防腐剂混合来制备可分散粉末和颗粒。适宜分散剂、润湿剂和悬浮剂已在上文描述。示例性防腐剂包括但不限于，例如抗氧化剂，例如，抗坏血酸。另外，可分散粉末和颗粒还可含有至少一种赋形剂，包括但不限于，例如增甜剂、矫味剂和着色剂。
可将至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐的乳液制备成(例如)水包油乳液。可以已知方式由已知成分构成包含式(I)化合物的乳液的油相。可通过例如但不限于以下的油提供油相：植物油，例如，橄榄油和花生油；矿物油，例如，液体石蜡；及其混合物。虽然该相可仅包含乳化剂，但其可包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油二者的混合物。适宜乳化剂包括但不限于，例如天然磷脂，例如，大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如，去水山梨醇单油酸酯；及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯。优选地，包括亲水性乳化剂以及充当稳定剂的亲脂性乳化剂。优选包括油和脂肪二者。总之，具有或不具有(一种或多种)稳定剂的(一种或多种)乳化剂构成所谓的乳化蜡，且上述蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，从而形成乳膏制剂的油性分散相。乳液还可含有增甜剂、矫味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适用于调配本发明的乳化剂和乳液稳定剂包括单独的Tween 60、Span 80、鲸蜡硬脂醇、肉豆蔻基醇、甘油单硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、甘油基二硬脂酸酯或者以及蜡或本领域中公知的其他材料。
式(I)化合物和/或至少一种其药用盐还可以(例如)静脉内、皮下和/或肌内方式经由任一药学上可接受且适宜的可注射形式递送。示例性可注射形式包括但不限于，例如包含可接受的媒介物和溶剂(例如，水)的无菌水溶液、林格氏溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液；无菌水包油微乳液；及水性或油性悬浮液。
用于胃肠外给药的制剂可呈水性或非水性等渗无菌注射溶液或悬浮液形式。这些溶液和悬浮液可由无菌粉末或颗粒使用针对用于口服给药制剂中所提及的一种或多种载体或稀释剂或通过使用其他适宜分散剂或润湿剂和悬浮剂制备。所述化合物可溶于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化钠、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其他佐剂和给药模式为药学领域充分且广泛已知的。还可以与适宜载体(包括盐水、右旋糖或水)或环糊精(即)、共溶剂增溶剂(即丙二醇)或胶束增溶剂(即Tween 80)的组合物形式通过注射给药活性成分。
无菌可注射制剂还可为无毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如呈在1,3-丁二醇中的溶液形式。属于可用的可接受媒介物和溶剂为水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，照例采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用任一温和不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。另外，在可注射制剂中可使用例如油酸等脂肪酸。
无菌可注射水包油微乳液可通过以下方式制备：例如，1)将至少一种式(I)化合物溶于油相(例如，大豆油与卵磷脂的混合物)中；2)将含式(I)的油相与水和甘油的混合物合并；及3)处理该组合以形成微乳液。
可根据本领域已知的方法来制备无菌水性或油性悬浮液。例如，可利用非毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如，1,3-丁二醇)制备无菌水溶液或悬浮液；且可利用无菌非毒性可接受的溶剂或悬浮介质(例如，无菌不挥发性油(例如，合成甘油单酯或甘油二酯)和脂肪酸(例如，油酸))制备无菌油性悬浮液。
可用于本发明药物组合物中的药用载体、佐剂和媒介物包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送***(SEDDS)(例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、药物剂型中使用的表面活性剂(例如Tween、聚乙氧基化蓖麻油(例如表面活性剂(BASF))或其他类似聚合递送基质)、血清蛋白(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精(例如α-、β-和γ环糊精)或经化学修饰的衍生物(例如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-环糊精)或其他增溶衍生物也可有利地用于增强本文所述各式化合物的递送。
本发明的药学活性化合物可根据常规制药方法处理以产生向患者(包括人类和其他哺乳动物)给药的药物。药物组合物可经受常规药学操作(例如灭菌)和/或可含有常规佐剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液等)。可另外制备具有肠溶包衣的片剂和丸剂。上述组合物还可包含诸如润湿剂、增甜剂、矫味剂和芳香剂等佐剂。
所给药化合物的量和利用本发明化合物和/或组合物治疗疾病病况的剂量方案取决于各种因素，包括个体的年龄、重量、性别和医学病况、疾病类型、疾病的严重度、给药的途径和频率及所用具体化合物。因此，该剂量方案可在很大范围内变化，但可使用标准方法常规地确定。适当的日剂量可为约0.001mg/kg体重至100mg/kg体重、优选地约0.0025mg/kg体重与约50mg/kg体重且最优选地约0.005mg/kg体重至10mg/kg体重。日剂量可每天给药一至四次。其他给药时间表包括每周给药一次和每两天循环给药一次。
出于治疗目的，本发明的活性化合物通常与一种或多种适于所指示给药途径的佐剂组合。若口服给药，则化合物可与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、***胶、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，且然后制片或包囊以方便给药。上述胶囊或片剂可含有控制释放制剂，其可以活性化合物在羟丙基甲基纤维素中的分散液提供。
本发明药物组合物包含至少一种式(I)化合物和/或至少一种其药用盐，及任选地选自任一药用载体、佐剂和媒介物的其他药物。本发明的替代组合物包含本文所述的式(I)化合物或其前药和药用载体、佐剂或媒介物。
效用
人类免疫***已经进化以使身体防御可造成感染、疾病或死亡的微生物、病毒和寄生虫。复杂调节机制确保免疫***的各种细胞组分靶向外来物质或有机体，而不会对个体造成永久性或显著损害。尽管未能充分了解当时的起始事件，但在自身免疫性疾病状态中，免疫***引导其炎性反应指向受折磨个体的靶标器官。不同的自身免疫性疾病的特征通常在于主要或初始靶标器官或组织受侵袭；例如关节(在类风湿性关节炎的情形下)、甲状腺(在桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)的情形下)、中枢神经***(在多发性硬化的情形下)、胰脏(在I型糖尿病的情形下)和肠(在炎性肠疾病的情形下)。因此已观测到，作用于免疫***或免疫***的某些细胞类型(例如B-淋巴细胞和T淋巴细胞、T细胞)的治疗剂可用于一种以上自身免疫性疾病中。
本领域(包括本文引用的参考文献)充分认识到，S1P受体是多种治疗应用(包括自身免疫性疾病)的良好靶标。由于个别受体既具组织特异性又具反应特异性，使得S1P受体成为良好药物靶标。由于选择性针对一种受体的激动剂或拮抗剂的开发可使细胞反应局限于含有该受体的组织，从而限制不期望的副效应，所以S1P受体的组织特异性是重要的。由于允许开发起始或抑制某些细胞反应而不影响其他过程的激动剂或拮抗剂，所以S1P受体的反应特异性也是重要的。因此，作用于一些S1P受体家族成员而对其他家族成员具有降低的活性或没有活性的化合物是合意的且预计其提供治疗效应以及改善的副效应个整(即，减少或消除不期望的副作用)。
如本文使用的术语“激动剂”在提及S1P1时是指产生诸如以下药理学效应的药物：T细胞的运动性降低、T细胞的运输降低或T细胞从类淋巴组织的流出降低。(Rosen et al.,Trends in Immunology,28:102(2007))。
由于本发明化合物作为激动剂对S1P1具有活性，故其可用于治疗或预防自身免疫性或慢性炎性疾病的免疫调节剂。本发明化合物可用于在免疫抑制状况良好的情况中抑制免疫***，例如骨髓、器官或移植排斥、自身免疫性和慢性炎性疾病，包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、I型糖尿病、炎性肠病、胆汁性肝硬化、葡萄膜炎(uveitis)、多发性硬化、克罗恩病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎、大水疱性类天孢疮(bullous pemphigoid)、结节病(sarcoidosis)、牛皮癣、自身免疫性肌炎、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、鱼鳞癣、格雷夫斯眼病(Graves ophthalmopathy)和哮喘。
更具体而言，本发明化合物可用于治疗或预防选以下的疾病或病症：器官或组织移植；由移植引起的移植物抗宿主疾病；自身免疫性综合征，包括类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、***性红斑狼疮、皮肤性红斑狼疮(盘状红斑狼疮、亚急性红斑狼疮)和狼疮性肾炎；桥本氏甲状腺炎；多发性硬化；重症肌无力；I型糖尿病；葡萄膜炎；后葡萄膜炎；过敏性脑脊髓炎；肾小球肾炎(glomerulonephritis)；感染后自身免疫性疾病，包括风湿热和感染后肾小球肾炎；炎性和过度增殖性皮肤疾病；牛皮癣；牛皮癣性关节炎；特应性皮炎；接触性皮炎；湿疹性皮炎；脂溢性皮炎；扁平苔癣；天疱疮；大水疱性类天孢疮；大孢性表皮松懈；荨麻疹；血管性水肿；血管炎，包括ANCA相关性血管炎、巨细胞动脉炎、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、显微镜型多血管炎(microscopic poliangiitis)、中枢神经***血管炎、Churg-Strauss综合征和类风湿性血管炎；红斑；皮肤性嗜酸性粒细胞增多症；痤疮；斑秃；角膜结膜炎；春季结膜炎；与贝切特病(Behcet’s disease)相关的葡萄膜炎；角膜炎；疱疹性角膜炎；圆锥形角膜；角膜上皮营养不良；角膜白斑；眼天疱疮；角膜侵蚀性溃疡(Mooren’s ulcer)；巩膜炎；格雷夫斯眼病；沃格特-小柳-原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)；结节病；花粉过敏；可逆阻塞性气道疾病；支气管哮喘；过敏性哮喘；内源性哮喘；外源性哮喘；尘埃性哮喘；慢性或难治性哮喘；晚发性哮喘和气道高反应性；支气管炎；胃溃疡；由缺血性疾病和血栓形成造成的血管损害；缺血性肠病；炎性肠病；坏死性小肠结肠炎；与热烧伤相关的肠病灶；乳糜泻(coeliacdiseases)；直肠炎；嗜酸细胞性胃肠炎；肥大细胞增多症；克罗恩病；溃疡性结肠炎；偏头痛；鼻炎；湿疹；间质性肾炎；古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)；溶血性尿毒综合征；糖尿病性肾病；多发性肌炎；格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)；梅尼尔氏病(Meniere’s disease)；多神经炎；多发性神经炎(multiple neuritis)；单神经炎；神经根病；甲状腺功能亢进；巴塞多氏病(Basedow’s disease)；纯红细胞再生障碍(pure red cellaplasia)；再生障碍性贫血；发育不全性贫血；特发性血小板减少性紫癜症；自身免疫性溶血性贫血；粒细胞缺乏症；恶性贫血；巨红细胞性贫血；红细胞发生不能；骨质疏松症；结节病；纤维性肺；特发性间质性肺炎；皮肌炎；寻常性白斑病(leukoderma vulgaris)；寻常性鱼鳞癣；光过敏性敏感；皮肤性T细胞淋巴瘤；动脉硬化；动脉粥样硬化；主动脉炎综合征；结节性多动脉炎；非炎性心肌病；硬皮病；韦格纳氏肉芽肿；舍格伦综合征(syndrome)；肥胖症；嗜酸性粒细胞增生性筋膜炎；牙龈、牙周组织、牙槽骨、牙骨质病灶；肾小球肾炎；由预防脱发或提供毛发萌发和/或促进毛发产生和毛发生长引起的男性型脱发或老年性脱发；肌肉萎缩症(musculardystrophy)；脓皮病和赛杂瑞氏综合征(Sezary’s syndrome)；爱迪生氏病(Addison’s disease)；在保持、移植或缺血性疾病后发生的器官缺血再灌注损伤；内毒素性休克；假膜性结肠炎；由药物或辐射造成的结肠炎；缺血性急性肾功能不全；慢性肾功能不全；由肺氧或药物造成的毒素病；肺癌；肺气肿；白内障；铁质沉着病(siderosis)；色素性视网膜炎；老年性黄斑变性；玻璃体瘢痕形成(vitreal scarring)；角膜碱烧伤；多形性皮炎红斑(dermatitiserythema multiforme)；线性IgA大疱性皮肤炎和水泥皮肤炎；牙龈炎；牙周炎；败血症；胰腺炎；由环境污染造成的疾病；老化；癌变(carcinogenesis)；癌转移和低气压病；由组胺或白三烯-C4释放造成的疾病；贝切特病；自身免疫性肝炎；原发性胆汁性肝硬化；硬化性胆管炎；肝部分切除；急性肝坏死；由毒素、病毒性肝炎、休克或缺氧症造成的肝坏死；乙型病毒肝炎；非甲型/非乙型肝炎；肝硬化(cirrhosis)；酒精性肝硬化；肝衰竭；暴发性肝衰竭；晚发型肝衰竭；慢加急性肝衰竭("acute-on-chronic"liver failure)；化学治疗效应增强；巨细胞病毒感染；HCMV感染；AIDS；癌症；老年性痴呆；创伤；神经性疼痛；慢性细菌感染；血小板减少症；IgA肾病变；系膜增生性肾小球肾炎；IgG4相关性疾病；强直性脊柱炎和复发性多软骨炎。幼年特发性关节炎包括少关节型关节炎发作型幼年特发性关节炎、多关节型关节炎发作型幼年特发性关节炎、***性发作型幼年特发性关节炎、幼年牛皮癣性关节炎和起止点炎相关性幼年特发性关节炎。
一个实施方案提供治疗自身免疫性和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给药至少一种式(I)化合物或其药用盐。另一实施方案提供式(I)化合物或其药用盐，其用于治疗自身免疫性和/或炎性疾病的疗法中。在另一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药用盐的用途，其用于制造用以治疗或预防自身免疫性和/或炎性疾病的药物。可在这些实施方案中采用治疗有效量。优选地，在这些实施方案中，自身免疫性和炎性疾病选自多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、牛皮癣，且可作为预防移植器官排斥的药物。本发明实施方案的方法包括给药治疗有效量的式(I)化合物或其药学上有效的盐。
在另一实施方案中，提供治疗血管疾病的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给药至少一种式(I)化合物或其药用盐。另一实施方案提供式(I)化合物或其药用盐，其用于治疗血管疾病的疗法中。在另一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药用盐的用途，其用于制造用以治疗血管疾病的药物。可在这些实施方案中采用治疗有效量。优选地，在这些实施方案中，血管疾病选自动脉粥样硬化和缺血再灌注损伤。
在另一实施方案中，提供治疗炎性肠病的方法，所述方法包含向有此需要的哺乳动物给药至少一种式(I)化合物或其药用盐。另一实施方案提供式(I)化合物或其药用盐，其用于治疗炎性肠病的疗法中。在另一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药用盐的用途，其用于制造用以治疗炎性肠病的药物。可在这些实施方案中采用治疗有效量。优选地，在这些实施方案中，炎性肠病选自克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转流性结肠炎(diversion colitis)、贝切特病和未确定型结肠炎。
在另一实施方案中，提供治疗狼疮的方法，该方法包含向有此需要的哺乳动物给药至少一种式(I)化合物或其药用盐。另一实施方案提供式(I)化合物或其药用盐，其用于治疗狼疮的疗法中。在另一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药用盐的用途，其用于制造用以治疗狼疮的药物。可在这些实施方案中采用治疗有效量。狼疮包括***性红斑狼疮、皮肤性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、亚急性红斑狼疮和狼疮性肾炎。
在另一实施方案中，提供治疗多发性硬化的方法，该方法包含向有此需要的哺乳动物给药至少一种式(I)化合物或其药用盐。另一实施方案提供式(I)化合物或其药用盐，其用于治疗多发性硬化的疗法中。在另一实施方案中，本发明提供式(I)化合物或其药用盐的用途，其用于制造用以治疗多发性硬化的药物。可在这些实施方案中采用治疗有效量。优选地，在这些实施方案中，多发性硬化包括复发缓解型多发性硬化、原发进展型多发性硬化、继发进展型多发性硬化和进展复发型多发性硬化。
治疗与S1P1相关的病况的方法可包括单独或彼此组合和/或与可用于治疗上述病况的其他适宜治疗剂组合给药式(I)化合物。因此，“治疗有效量”还意欲包括有效充当S1P1受体的激动剂的要求保护化合物组合的量。所述化合物组合优选地是协同性组合。如由例如Chou et al.,Adv.Enzyme Regul.,22:27-55(1984)所述，当化合物在组合给药时的效应大于化合物在作为单一药物单独给药时的加和效应时发生协同作用。一般而言，在化合物的次佳浓度下可最明确证实协同性效应。与个别组分相比，协同作用可体现以下方面：组合的细胞毒性降低、效能增加或一些其他有益效应。
上述其他治疗剂的实例包括皮质类固醇或糖皮质素，例如***(dexamethasone)、甲强龙(methylprednisolone)、***龙(prednisolone)和***(prednisone)；PDE4抑制剂，例如咯利普兰(rolipram)、西洛司特(cilomilast)、罗氟司特(roflumilast)和奥格司特(oglemilast)；细胞因子抑制型抗炎药物(CSAID)和p38激酶的抑制剂，如美国专利第4,200,750号披露的4-取代咪唑并[1,2-A]喹喔啉；靶向细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如)、CD25、CD30、CD40、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA)(例如阿巴西普(abatacept)贝拉西普(belatacept))或其配体(包括CD154(GP39或CD40L))的抗体或融合蛋白；融合蛋白或人类细胞因子或生长因子(例如，TNF)(例如英夫利昔单抗(infliximab)依那西普(etanercept)(Embrel)、阿达木单抗(adalimumab))、LT、Il-1(例如阿那白滞素(anakinra)(IL-1受体拮抗剂))、IL-2、IL-4、IL-5、Il-6(例如CNTO 328(嵌合抗IL-6抗体))、Il-7、Il-8、Il-12、Il-15、Il-16、Il-17、Il-21、Il-23(例如优特克单抗(Ustekinumab)(人类抗IL-12/23单克隆抗体))和干扰素(例如干扰素β1a干扰素β1b)的可溶性受体的抗体；整合素受体拮抗剂，例如聚合剂，例如乙酸格拉默(glatirameracetate)柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、美沙拉嗪(mesalamine)、羟基氯喹(hydroxychloroquine)、非载体抗炎药物(NSAID)(例如水杨酸盐(包括阿司匹林(aspirin)、双水杨酸酯(salsalate)和水杨酸镁)和非水杨酸盐(例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、美洛昔康(meloxicam)、塞来昔布(celecoxib)和罗非昔布(rofecoxib)))；抗病毒药物，例如阿巴卡韦(abacavir)；抗增殖药物，例如甲氨喋呤(methotrexate)、巯嘌呤(mercaptopurine)、来氟米特(leflunomide)、环孢霉素(cyclosporine)、麦考酚酯(mycophenololate)、FK506(他克莫司(tacrolimus)，)；细胞毒性药物，例如硫唑嘌呤(azathioprine)和环磷酰胺；核转位抑制剂，例如脱氧精胍菌素(deoxyspergualin，DSG)；含金产品，例如金诺芬(auranofin)；青霉胺(penicllamine)和雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)或)或其衍生物。
上述其他治疗药物在与本发明化合物组合采用时可以(例如)Physicians’Desk Reference(PDR)中所指示的量使用，或如由本领域普通技术人员以其他方式进行确定。在本发明的方法中，上述(一种或多种)其他治疗剂可在给药本发明化合物之前、同时或之后给药。
实施例
在下列实施例中对本发明进行进一步定义。应当理解的是，所述实施例仅以说明性方式给出。由上述论述和实施例，本领域技术人员可确定本发明的基本特征，且可在不背离其精神和范围的情形下作出各种改变和修改，以使本发明适用于各种用途和条件。因此，本发明并不限于下文所述说明性实施例，而是由随附于所述实施例的权利要求书加以界定。
缩写
Ac        乙酰基
anhyd.    无水
aq.       水性
Bn        苄基
Bu        丁基
Boc       叔丁氧基羰基
CV        柱体积
DCM       二氯甲烷
DEA        二乙胺
DMA        N,N-二甲基乙酰胺
DMF        二甲基甲酰胺
DMPU       1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮
DMSO       二甲基亚砜
EtOAc      乙酸乙酯
Et         乙基
Et3N       三乙胺
EtOH       乙醇
H或H2       氢
h、hr或hrs 小时
hex        己烷
i          异
HOAc       乙酸
HPLC       高效液相色谱
LC         液相色谱法
LDA        二异丙基氨基锂
LiHMDS     双(三甲基硅烷基)氨基锂
M          摩尔浓度
mM         毫摩尔浓度
Me         甲基
MeCN       乙腈
MeOH       甲醇
MHz        兆赫
min.       分钟
mins       分钟
M+1         (M+H)+
MS         质谱
n或N       当量浓度
nM         纳摩尔浓度
NMP        N-甲基吡咯烷
Pd/C           碳载钯
Pd2(dba)3      三-(二亚苄基丙酮)二钯
Ph             苯基
Pr             丙基
PSI            磅/平方英寸
R-BINAP        (R)-(+)-2,2'-双(二苯基膦基)-1,1’-联萘
Ret Time或RT   保留时间
sat.           饱和
S-BINAP       (S)-(-)-2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘
SFC           超临界流体色谱
TFA           三氟乙酸
THF           四氢呋喃
HPLC条件：
条件C：柱：YMC CombiScreen S5 50×4.6mm(在4分钟内为0至100％溶剂B的线性梯度，然后以100％B保持1-4分钟；溶剂A＝90％水/10％MeOH/0.2％H3PO4；溶剂B＝90％MeOH/10％水/0.2％H3PO4。流速：4mL/min；在220nm检测产物。
条件G：柱：Waters Acquity BEH C18 2.1×50mm 1.7μm；在3分钟内为0-100％溶剂B的线性梯度，然后以100％B保持0.75分钟；流速：1.11mL/min；溶剂A：具有10mM乙酸铵的5:95乙腈:水；溶剂B：具有10mM乙酸铵的95:5乙腈:水；温度＝50℃；在220nm波长检测产物。
条件H：柱：Sunfire C18(150×3.0mm)，3.5μm；在25分钟内为10％至100％溶剂B的线性梯度，然后以100％B保持5分钟；流速：1mL/min；缓冲液：0.5％TFA水溶液，且使用稀氨将pH调节至2.5；溶剂A：缓冲液:乙腈(95:5)；溶剂B：缓冲液:乙腈(5:95)；在220nm检测产物。
条件I：柱：Waters Acquity SD BEH C18，2.1×50mm，1.7μm微粒；流动相A：具有0.05％TFA的100％H2O；流动相B：具有0.05％TFA的100％乙腈；温度：50℃；梯度：在1分钟内为98:2至2:98(A％:B％)，且以2:98保持0.5分钟；流速：0.800mL/min，在220nm检测产物。
条件J：柱：Chromolith SpeedROD(4.6×50mm)；在4分钟内为0至100％溶剂B的线性梯度，且以100％B保持1分钟；溶剂A：10％MeOH，90％H2O，0.1％TFA；溶剂B：90％MeOH，10％H2O，0.1％TFA；流速：4mL/min；在220nm检测产物。
中间体1
(1R,3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯
中间体1A：(S)-3-(4-溴苯基)环戊酮
将500ml烧瓶中的4-溴苯基硼酸(20g,100mmol)在1,4-二噁烷(120mL)中的溶液用氮吹扫5分钟。在氮正压下将S-BINAP(0.992g,1.593mmol)和双(降莰二烯)四氟硼酸铑(I)(0.559g,1.494mmol)依序添加至溶液中。在室温搅动2小时后，相继添加水(20mL)和环戊-2-烯酮(8.06mL,100mmol)和Et3N(13.88mL,100mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。经由过滤除去所得深色固体，并将滤液倾入250ml乙酸乙酯中。用水将溶液洗涤2次并浓缩有机层。通过快速柱色谱(分成2批，各自在330g二氧化硅柱上以0％-25％乙酸乙酯/己烷运行)纯化残余物，得到12.1克(S)-3-(4-溴苯基)环戊酮。HPLC纯度>98％，且手性HPLC分析表明大约90％ee。在下文所述的手性SFC条件下进一步纯化该位置。实验细节：仪器：Berger SFC MGIII；制备条件：柱：ChiralPak AD-H 25×5cm，5μm；柱温：40℃；流速：200mL/min；流动相：CO2/MeOH＝80/20；检测器波长：225nm；注射体积：1.0mL；样品制备：12.1g在210mL MeOH中(浓度为60mg/ml)；分析条件：柱：AD 25×0.46cm，10μm；柱温：40℃；流速：2.0min；流动相：CO2/MeOH＝70/30；检测器波长：220nm；注射体积：5μL。
分离期望对映异构体(主要异构体)且基于洗脱顺序称其为“PK2”。基于220nm的SFC/UV面积％，所分离异构体的对映异构纯度经确定大于99.6％。蒸发后，回收到10.5克期望对映异构体。HPLC保留时间＝LC/MS M+1＝239/241。1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.43-7.51(2H,m),7.10-7.19(2H,m),3.32-3.46(1H,m),2.67(1H,dd,J＝18.27,7.48Hz),2.39-2.54(2H,m),2.23-2.39(2H,m),1.97(1H,ddd,J＝12.98,11.00,9.02Hz)。
中间体1B：(7S)-7-(4-溴苯基)-1,3-二氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮
使用总计9.8g(S)-3-(4-溴苯基)环戊酮，将其分成2批，各自含有4.9g。在与下文所述相同的条件下处理这两批。
向玻璃压力容器中的(S)-3-(4-溴苯基)环戊酮(I-1A,4.9g,20.49mmol)和***(1.935g,29.7mmol)在EtOH(40mL)和水(20mL)中的混合物中添加碳酸铵(4.92g,51.2mmol)。密封反应容器，置于在80℃加热的油浴中并保持24小时，从而形成白色固体。在冰浴中使反应容器冷却后，打开容器并添加30ml水，从而形成额外固体。经由过滤收集固体，用5ml水洗涤2次，然后在高真空下干燥。合并这两批，得到13.9g(7S)-7-(4-溴苯基)-1,3-二氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮)，其未经进一步纯化即用于后续反应中。HPLC保留时间＝0.82分钟(条件G)LC/MS M+Na＝331,2M+H＝619。
中间体1C：(3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸
向圆底烧瓶中的在1,4-二噁烷(40mL)中的(7S)-7-(4-溴苯基)-1,3-二氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(I-1B,13.9g,45.0mmol)中添加NaOH水溶液(2N,100mL,200mmol)。将混合物加热至95℃，并搅拌24小时。添加额外NaOH(25mL,50mmol)，并再继续加热两天。用冰浴使溶液冷却，用5N HCl中和至大约pH 7，从而形成白色沉淀物。经由过滤收集固体并在高真空下干燥2天，得到14g(3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷羧酸，其为白色固体，未经进一步纯化即原样用于后续步骤中。HPLC保留时间＝0.64分钟(条件G)LC/MSM+1＝284/286。
中间体1D：(3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯
在室温经由滴液漏斗历时20分钟向(3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷羧酸(I-1C,14g,49.3mmol)在MeOH(250mL)中的非均匀混合物中滴加亚硫酰氯(36.0mL,493mmol)(放热)。将反应混合物置于油浴中并加热至70℃并保持4小时。在真空下除去溶剂，且使残余物溶于乙酸乙酯(200mL)中，并用1N NaOH洗涤2次。然后，将有机层经Na2SO4干燥且浓缩，得到10.8g(3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯。HPLC保留时间＝0.68分钟(条件G)；LC/MS M+1＝298/300。
中间体1：(1R,3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯
通过手性SFC分离非对映异构体的混合物(I-1D,9.5g)。先前已阐述中间体1及其非对映异构体的绝对立体化学指派(Wallace,G.A.et al.,J.Org.Chem.2009,74,4886-4889)。实验细节：仪器：制备型：Thar SFC350；分析型：Berger分析型SFC；制备条件：柱：Lux-纤维素-425×3cm，5μm；柱温：35℃；流速：200ml/min；流动相：CO2/(具有0.1％DEA的MeOH)＝87/13；检测器波长：220nm；注射体积：0.6ml；样品制备：9.5g在400ml MeOH中(浓度为23.7mg/ml)。分析条件：柱：Lux-纤维素-4 25×0.46cm，5μm；柱温：35℃；流速：3ml/min；流动相：CO2/(具有0.1％DEA的MeOH)＝85/15；检测器波长：220nm；注射体积：5μL。
中间体1：峰2：4.06g；在上述分析型手性SFC条件下，保留时间＝6.64分钟。光学纯度：98.2％；LC/MS M+1＝298/300；峰1：3.96g；在上述分析型手性SFC条件下，保留时间＝5.47分钟。光学纯度：99.4％。
替代制备：中间体1的HCl盐
在冰浴中使(3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷羧酸(10.2g,35.9mmol)在MeOH(100mL)中的溶液冷却，随后滴加SOCl2(15.72mL,215mmol)。在完成添加后，将溶液回流3小时，此时通过HPLC确定反应的完成。浓缩溶液以除去甲醇，得到固体。将固体吸收在50ml 3％H2O/EtOAc中，并充分搅拌30分钟。经由过滤收集所形成的白色固体。将湿白色固体吸收在50ml 4％H2O/1,2-二甲氧基乙烷中，加热至50℃并保持3小时，然后在室温搅拌过夜。经由过滤收集所得白色固体并干燥，得到(1R,3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯盐酸盐(3.5g,10.35mmol)。HPLC保留时间＝6.6分钟(条件H)LC/MS M+1＝298/300。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(br.s,3H)7.50-7.53(m,2H),7.35-7.37(m,2H),3.81(s,3H)3.17-3.28(m,1H),2.57(dd,J＝14,7Hz,1H),2.0-2.28(m,5H)。
中间体2
(1R,3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯
中间体2A：(R)-3-(4-溴苯基)环戊酮
用氮气将4-溴苯基硼酸(20g,100mmol)在1,4-二噁烷(120mL)中的溶液吹扫10分钟。依序添加(R)-BINAP(0.992g,1.593mmol)和双(降莰二烯)四氟硼酸铑(I)(0.559g,1.494mmol)，并将悬浮液超声处理5分钟。将混合物搅拌20分钟。添加水(20mL)，然后反应混合物变得均匀。10分钟后，添加环戊-2-烯酮(8.06mL,100mmol)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。HPLC和LCMS分析表明，反应继续进行，但起始物质多于产物。经由硅藻土垫过滤反应混合物并使用乙酸乙酯(100mL)洗涤硅藻土。用额外乙酸乙酯(150mL)稀释滤液，用水(2×)洗涤，用盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。通过快速硅胶色谱使用乙酸乙酯与己烷的混合物纯化产物混合物，得到(R)-3-(4-溴苯基)环戊酮(6.09g,25.5mmol)，其为白色固体。通过HPLC，产物为98％纯，且保留时间＝2.11分钟–(条件J)。LC/MS M+1＝241。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.57-7.39(m,2H),7.22-7.06(m,2H),3.39(ddd,J＝10.9,6.8,4.1Hz,1H),2.67(dd,J＝18.2,7.4Hz,1H),2.57-2.38(m,2H),2.38-2.21(m,2H),1.99-1.85(m,1H)。
手性HPLC表明，化合物为90-95％对映异构纯。通过手性SFC使用下文所列条件进一步纯化该化合物(6.03g)。分离期望对映异构体且以洗脱顺序称其为“PK1”。基于220nm的SFC/UV面积％，所分离异构体的对映异构纯度经确定大于99.9％。在浓缩后回收到5.45克期望对映异构体。实验细节：仪器：Berger SFC MGIII；制备条件；柱：ChiralPak AD-H 25×3cm，5μm；柱温：40℃；流速：180mL/min；流动相：CO2/MeOH＝87/13；检测器波长：225nm；注射体积：0.5mL；样品制备：6.03g于100mL MeOH中(浓度为60mg/ml)。分析条件：柱：ChiralPak AD 25×0.46cm，10μm；柱温：40℃；流速：2.0分钟；流动相：CO2/MeOH＝70/30；检测器波长：220nm；注射体积：5μL。
中间体2B：(7R)-7-(4-溴苯基)-1,3-二氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮
向玻璃压力容器中的(R)-3-(4-溴苯基)环戊酮(I-2A,5.4g,22.58mmol)和***(2.132g,32.7mmol)在EtOH(40mL)和水(20mL)中的混合物中添加碳酸铵(5.42g,56.5mmol)。密封反应容器，置于在80℃加热的油浴中并保持20小时。在浅黄色溶液中形成大量白色的自由流动的固体。LCMS分析表明剩余起始物质，故再继续反应24小时。由于转化不完全，故使油浴温度上升至120℃。白色固体在该较高温度下完全溶解。3小时后，使溶液冷却至室温。使溶液在冰浴中进一步冷却，添加水(30mL)，并经由过滤收集所得白色固体，用水洗涤，风干，然后置于高真空下，得到目标化合物(6.9g,22.32mmol)，其未经额外纯化即用于后续反应中。HPLC保留时间＝0.81分钟(条件G)；LC/MS MH＝309/311；2M+H＝619。
中间体2C：(3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸
在设为95℃的油浴中加热(7R)-7-(4-溴苯基)-1,3-二氮杂螺[4.4]壬烷-2,4-二酮(I-2B,6.80g,22mmol)在二噁烷(20mL)和NaOH(2N aq)(120mL,240mmol)中的溶液。将所得澄清浅黄色溶液搅拌整个周末。使溶液在冰浴中冷却，并用6N HCl中和至大约pH 7，从而形成沉淀物。收集固体并使其风干过夜。在热乙醇(约100mL)中浆化白色固体，并经由过滤再收集，风干固体，然后置于高真空下。(5.8g,20.41mmol)。HPLC保留时间＝0.64分钟(条件G)；LC/MS M+1＝284/286。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.52-7.38(m,2H),7.31-7.17(m,2H),3.55-3.40(m,1H),2.68(dd,J＝13.3,6.7Hz,1H来自单一非对映异构体),2.58-2.39(m,1H),2.26-2.15(m,1H),2.10-1.98(m,1H),1.98-1.81(m,1H),1.70(dd,J＝13.2,11.8Hz,1H来自单一非对映异构体)。
中间体2D：(3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯
在含有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，将(3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸(I-2C,5.4g,19.00mmol)悬浮于甲醇(100mL)中，得到白色浆液。用亚硫酰氯(13.87mL,190mmol)装填滴液漏斗，并以阻止混合物达到回流温度的速率滴加试剂。在完成添加后，将浅黄色乳状溶液置于设为70℃的油浴中，并附接空气冷却型回流冷凝器。将溶液加热若干小时，然后使其冷却至室温过夜。在真空下蒸发溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯中，用1N NaOH(水溶液)洗涤，用水洗涤，然后经MgSO4干燥，之后过滤并浓缩。在温热乙酸乙酯中浆化所得黄色固体，进行超声处理，然后过滤。风干固体，置于真空下并蒸发滤液，得到固体1：白色固体，4.28g，LCMS显示>98％AP。蒸发滤液，得到黄色固体(1.89g)。在最少量热乙酸乙酯中浆化来自滤液的固体，进行超声处理，然后冷却(冰浴)并进行冷过滤。风干固体并置于真空下，得到固体2：1.44g白色固体。合并固体(5.7g)。
中间体2：(1R,3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯
使用非对映异构体的手性SFC分离来分离(3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯的合并的固体(I-2D,4g)。先前(Wallace,G.A.et al.,J.OrganicChem.2009,74,4886-4889)已描述中间体2及其非对映异构体的绝对立体化学指派。实验细节：仪器：制备型：Thar SFC350；分析型：Thar分析型MDS。制备条件：柱：ChiralPak AD-H 25×5cm，5μm；柱温：35℃；流速：300ml/min；流动相：CO2/(具有0.1％DEA的MeOH)＝82/18；检测器波长：230nm；注射体积：0.4-0.5ml；样品制备：4g在120ml MeOH中(浓度为33mg/ml)。分析条件：柱：ChiralPak AD-H 25×0.46cm,5μm；柱温：35℃；流速：3ml/min；流动相：CO2/(具有0.1％DEA的MeOH)＝80/20；检测器波长：222nm；注射体积：5μL。
中间体2(峰1)：1.56g(在222nm的光学纯度为99.3％)，在分析型手性SFC上的保留时间＝7.18分钟。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.45-7.39(m,2H),7.23-7.17(m,2H),3.78(s,3H),3.40-3.48(m,1H),2.40(ddd,J＝13.0,8.9,3.6Hz,1H),2.28-2.21(m,1H),2.18(dd,J＝13.0,11.7Hz,1H),2.04(dd,J＝13.0,7.2Hz,1H),1.88-1.79(m,1H),1.79-1.70(m,1H)。
峰2： 1.8g(在222nm下的光学纯度为97.2％)。在分析型手性SFC上的保留时间＝7.71分钟。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.45-7.38(m,2H),7.26-7.20(m,2H),3.78(s,3H),3.28-3.20(m,1H),2.66-2.57(m,1H),2.25(ddd,J＝12.8,11.0,7.2Hz,1H),2.10(dt,J＝12.2,6.8Hz,1H),2.03-1.93(m,1H),1.84(ddd,J＝13.0,7.8,2.2Hz,1H),1.65(dd,J＝13.3,11.1Hz,1H)。
中间体3
(5R,7S)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
中间体3A：((1R,3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊基)甲醇
在0℃向(1R,3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯HCl(I-1HCl,15g,44.8mmol)在MeOH(100mL)中的混合物中滴加硼氢化钠(4g,106mmol)。使反应混合物升温至室温，滴加硼氢化钠直至通过HPLC分析确定反应完成为止。添加水以淬灭反应。用乙酸乙酯稀释反应混合物并用饱和NaCl洗涤。将水层反萃取若干次。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在浓缩后回收产物(11g)。HPLC保留时间＝0.65分钟(条件G)；LC/MS M+1＝272：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.51-7.40(m,2H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),3.32-3.20(m,2H),3.09-2.92(m,1H),2.11(dd,J＝12.9,8.7Hz,1H),1.98-1.87(m,1H),1.80(qd,J＝11.1,7.9Hz,1H),1.69-1.58(m,1H),1.48(ddd,J＝12.4,7.9,2.2Hz,1H),1.32(dd,J＝12.8,10.1Hz,1H)。
中间体3：(5R,7S)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
向((1R,3S)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊基)甲醇(11g,40.7mmol)和吡啶(I-3A,3.29mL,40.7mmol)在二噁烷(300mL)中的混合物中添加1,1'-羰基二咪唑(19.81g,122mmol)。将反应混合物搅拌4小时。用乙酸乙酯稀释反应混合物并用1M HCl、盐水与饱和NaHCO3洗涤。将混合物反萃取若干次。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到10.5g期望产物，其为灰白色固体。HPLC保留时间＝0.87分钟(条件G)。LC/MS M+1＝297.9；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),6.42(br.s.,1H),4.41-4.21(m,2H),3.17-2.91(m,1H),2.34(dd,J＝13.3,7.4Hz,1H),2.23-2.11(m,2H),2.01-1.90(m,2H),1.88-1.74(m,1H)。
中间体4
(5R,7R)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
中间体4A：((1R,3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊基)甲醇
将(1R,3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊烷甲酸甲酯(I-2,3.88g,13.01mmol)溶于MeOH(65.1ml)中，滴加硼氢化钠(1.477g,39.0mmol)。滴加额外硼氢化钠(每1小时0.5当量)直至通过HPLC分析确定反应完成为止。在2小时后发现反应完成。用水淬灭反应混合物且用乙酸乙酯稀释。用EtOAc将水层反萃取3次。合并有机层，用饱和NaCl洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到((1R,3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊基)甲醇(3.19g,11.81mmol)。HPLC保留时间＝0.68分钟；LC/MS M+1＝272：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(d,J＝8.4Hz,2H),3.49(s,2H),3.32-3.41(m,1H),2.19-2.25(m,1H),1.98-2.07(m,1H),1.90-1.95(m,1H),1.66-1.74(m,2H),1.52-1.60(m,1H)。
中间体4：(5R,7R)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
将((1R,3R)-1-氨基-3-(4-溴苯基)环戊基)甲醇(I-4A,3.19g,11.81mmol)溶于THF(59.0ml)中。滴加吡啶(0.955ml,11.81mmol)和1,1'-羰基二咪唑(5.74g,35.4mmol)。将反应混合物搅拌4小时，随后实施LCMS。在完成后，用EtOAc稀释混合物并用1M HCl洗涤。用EtOAc将水层反萃取2次。合并有机层，用饱和NaCl洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，在快速色谱(24g硅胶柱；洗脱剂：己烷2CV，随后经15CV梯度达100％EtOAc)后，得到(5R,7R)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(2.5g,8.44mmol)
HPLC保留时间＝0.91分钟；LC/MS M+1＝298。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46(d,J＝8.5Hz,2H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),5.72-5.81(m,1H),4.35(dd,J＝13Hz,8Hz,2H),3.19-3.24(m,1H),2.38-2.44(m,1H),2.15-2.26(m,1H),2.11-2.14(m,1H),1.99-2.05(m,1H),1.79-1.85(m,1H),1.65-1.72(m,1H)。
中间体5
(5R,7S)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
中间体5A： 2-(4-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸叔丁酯
在室温向(5R,7S)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(I-3,1g,3.38mmol)在二噁烷(10mL)中的混合物中添加双(三甲基硅烷基)氨基锂(3.71mL,3.71mmol)。将混合物搅拌30分钟，然后添加1,2,3,4,5-五苯基-1'-(二-叔丁基膦基)二茂铁(0.121g,0.169mmol)、Pd2(dba)3(0.155g,0.169mmol)和(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)氯化锌(II)(8.10mL,4.05mmol)。将反应混合物在80℃加热2小时，然后冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并用1M HCl洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在硅胶筒(cartridge)(40g)上使用EtOAc/己烷梯度(在20分钟内为0-100％EtOAc)纯化粗物质，得到950mg2-(4-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸叔丁酯。HPLC保留时间＝0.93分钟(条件G)；LC/MS M+1＝332。
中间体5B： 2-(4-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸
向2-(4-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸叔丁酯(I-5A,1g,3.02mmol)在DCM(20mL)中的混合物中添加TFA(10mL)。2小时后，在真空中浓缩溶液且未经进一步纯化即原样用于后续步骤中。HPLC保留时间＝0.65分钟(条件G)；LC/MS M+1＝276。
中间体5：(5R,7S)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
向2-(4-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸(I-5B,800mg,2.91mmol)在DCM(20mL)中的混合物中添加草酰氯(1ml,11.42mmol)和几滴DMF。1小时后，在真空中浓缩反应混合物。将残余物再溶于玻璃压力容器中的DCM(20mL)中。添加颗粒氯化铝(1550mg,11.62mmol)，并使反应混合物冷却至-78℃。使乙烯鼓泡通过溶液达5分钟，然后密封反应容器。使反应混合物缓慢升温至室温并搅拌4小时。将混合物倾倒在冰上，用二氯甲烷稀释并用1M HCl洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在硅胶筒(80g)上使用MeOH/DCM梯度(在13CV内为0-10％MeOH)纯化粗物质。收集含产物的级分并在真空中干燥，得到770mg(5R,7S)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮。HPLC保留时间＝0.74分钟(条件G)；LC/MS M+1＝286：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.20-7.00(m,3H),5.49(br.s.,1H),4.45-4.25(m,2H),3.59(s,2H),3.08(t,J＝6.8Hz,3H),2.58(t,J＝6.7Hz,2H),2.38(dd,J＝13.2,7.3Hz,1H),2.27-2.11(m,2H),2.05-1.92(m,2H),1.92-1.74(m,1H)。
中间体6
三氟甲磺酸6-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)-3,4-二氢萘-2-基酯
在-78℃向(5R,7S)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(I-5,340mg,1.192mmol)和DMPU(0.431mL,3.57mmol)在THF(10mL)中的混合物中添加LDA(1.456mL,2.62mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后添加在THF(10mL)中的1,1,1-三氟-N-苯基-N-(三氟甲基)磺酰基甲烷磺酰胺(639mg,1.787mmol)。使反应混合物升温至0℃。1小时后，用水淬灭反应。用乙酸乙酯稀释反应混合物并用饱和NaCl水溶液洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在硅胶筒(40g)上使用EtOAc/己烷梯度(在20分钟内为0-100％EtOAc)纯化粗物质，得到400mg三氟甲磺酸6-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)-3,4-二氢萘-2-基酯。HPLC保留时间＝1.01分钟(条件G)；LC/MS M+1＝418。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.17-6.95(m,3H),6.74(s,1H),6.48(s,1H),4.48-4.20(m,2H),3.17-2.95(m,3H),2.81-2.60(m,2H),2.33(dd,J＝13.3,7.2Hz,1H),2.24-2.08(m,2H),2.05-1.74(m,3H)。
中间体7
(5R,7R)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
中间体7A：2-(4-((5R,7R)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸叔丁酯
在室温，向(5R,7R)-7-(4-溴苯基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(中间体4,2.1g,7.09mmol)在THF(25.3ml)中的溶液中添加LiHMDS(7.80ml,7.80mmol)。将溶液搅拌15分钟。接下来，依序添加Pd2(dba)3(0.195g,0.213mmol)、1,2,3,4,5-五苯基-1'-(二-叔丁基膦基)二茂铁(0.151g,0.213mmol)和(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)溴化锌(II)、四氢呋喃(7.07g,21.27mmol)。将浆液在24℃搅拌2小时。LCMS分析显示起始物质完全耗尽。用乙酸乙酯稀释反应混合物并用1M HCl洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在硅胶筒(40g)上使用己烷:丙酮100:0至0:100(经25CV)纯化粗物质。分离出2-(4-((5R,7R)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸叔丁酯(2.35g,7.09mmol)。HPLC保留时间＝0.95分钟(条件I)：LC/MS M+1＝332：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.27-7.21(m,2H),7.21-7.15(m,2H),5.11(br.s.,1H),4.40-4.26(m,2H),3.53(s,2H),3.22-3.01(m,1H),2.36(dd,J＝13.2,7.3Hz,1H),2.25-2.10(m,2H),2.04-1.92(m,2H),1.91-1.76(m,1H),1.47(s,9H)。
中间体7：(5R,7R)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
将棕色液体2-(4-((5R,7R)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸叔丁酯(I-7A,2.35g,7.09mmol)溶于DCM(60mL)中，随后添加三氟乙酸(20mL,260mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，此时在减压下除去溶剂。将所得物质稀释在DCM(60mL)中，通过酸/碱萃取纯化并在真空下放置1小时。将所得棕色胶状2-(4-((5R,7R)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)苯基)乙酸(1.952g,7.09mmol)溶于DCM(60mL)中，随后添加草酰氯(1.862mL,21.27mmol)和DMF(0.027mL,0.355mmol)。在室温搅拌所得溶液直至停止释放气体为止(约30分钟)。经MeOH淬灭的等份试样的LCMS显示酸完全耗尽(RT＝0.65分钟，条件I)，且推定的甲酯的出现是由于甲醇淬灭而作为唯一产物(RT＝0.77分钟，条件I)。在减压下除去溶剂并将产物置于真空下。将棕色胶状物转移至具有DCM(60mL)的密封管中(未完全溶解，获得棕色悬浮液)。使反应混合物冷却至-78℃，随后添加颗粒氯化铝(2.84g,21.27mmol)。使乙烯鼓泡通过溶液达7分钟且将管密封。形成沉淀物且将反应混合物在-78℃下搅拌15分钟，然后使其达到室温。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后进行减压。LCMS分析显示起始物质消失且出现四氢萘酮产物。将反应混合物倾倒在冰上，用DCM稀释并搅拌直至冰融化为止。用盐水洗涤有机层，干燥并在减压下浓缩。在硅胶上纯化，得到(5R,7R)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(1.05g,3.68mmol)。HPLC保留时间＝0.74分钟(条件I)；LC/MS M+1＝286；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.23-7.11(m,3H),5.68(br.s.,1H),4.45-4.30(m,2H),3.59(s,2H),3.31-3.18(m,1H),3.08(t,J＝6.8Hz,2H),2.58(t,J＝6.7Hz,2H),2.42-2.39(m,1H),2.32-2.15(m,2H),2.09-1.99(m,1H),1.91-1.83(m,1H),1.82-1.72(m,1H)。
中间体8
(1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇
中间体8A： 6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-酮
在0℃向6-氨基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(15g,93mmol)在乙酸(150mL)和水(150mL)中的搅拌澄清溶液中滴加硫酸(5.5mL,101mmol)。然后，在相同温度下历时40分钟滴加亚硝酸钠(12.90g,187mmol)在水(100mL)中的溶液。将混合物在0℃搅拌10分钟，然后在0℃历时2小时缓慢添加至碘化钠(55.8g,372mmol)在水(600mL)中的搅拌溶液中。将所得棕色悬浮液在0℃搅拌30分钟并在室温搅拌1小时。用乙酸乙酯(400mL,2×100mL)萃取混合物。将合并的乙酸乙酯萃取物用水(60mL)、饱和Na2S2O3水溶液(直至棕色消失为止)与饱和K3PO4水溶液(60mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。快速色谱纯化(330g硅胶柱，5％至15％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)得到6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(17.3g,63.6mmol)，其为固体。LC/MS M+1＝273。
中间体8B：(S)-N-(6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-亚基)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-胺
在室温在氮气下向6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(I-8A,20.90g,77mmol)、对甲苯磺酸一水合物(0.584g,3.07mmol)和环己烷(40mL)的搅拌混合物中滴加(S)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-胺(10g,77mmol)。将混合物在共沸除去水下加热5小时。用乙酸乙酯(20mL)稀释反应混合物，并与饱和碳酸氢钠水溶液(15mL)混合。分离水层并用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。将合并的有机溶液经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。快速色谱纯化(330g硅胶柱，0％至20％EtOAc/己烷梯度洗脱)得到(S)-N-(6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-亚基)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-胺(29.1g,76mmol)，其为黄色液体。LC/MS M+1＝385。
中间体8C：(R)-2-己基-6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-酮
在0℃在氮气下向二异丙基胺(19.43mL,136mmol)在无水四氢呋喃(250mL)中的搅拌溶液中滴加丁基锂溶液(2.5M于己烷中，39.4mL，98mmol)。将所得溶液在相同温度下搅拌15分钟，然后滴加(S)-N-(6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-亚基)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-胺(I-8B,29.1g,76mmol)在无水四氢呋喃(100mL)中的溶液。将反应溶液在0℃搅拌2小时。在-78℃滴加1-碘己烷(22.35mL,151mmol)在四氢呋喃(50mL)中的溶液，并将混合物在相同温度下搅拌2小时。历时1.5小时使温度上升至室温。用饱和氯化铵水溶液(50mL)和水(50mL)淬灭反应混合物。用己烷(200mL)和乙酸乙酯(3×50mL)萃取混合物。将合并的萃取物经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到油状物。将油状物溶于THF(200mL)中。在0℃滴加氯化铜二水合物(52g)在水(220mL)中的溶液，并将混合物在室温剧烈搅拌过夜。添加氨水溶液以使pH上升至大约9。用己烷(100mL)和***(2×100mL)萃取混合物。将合并的萃取物经无水硫酸钠干燥并浓缩。快速色谱纯化(330g硅胶柱，0至15％EtOAc/己烷梯度洗脱)，得到(R)-2-己基-6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(21.6g,60.6mmol)，其为含有一些(S)异构体的白色固体，所述(S)异构体在后续步骤中被除去。LC/MS M+1＝357。
中间体8D：(R)-2-己基-6-碘-1,2,3,4-四氢萘
向(R)-2-己基-6-碘-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(I-8C,21.6g,60.6mmol)在二氯甲烷(10mL)和100％EtOH(100mL)中的搅拌溶液中滴加硼氢化钠(4.59g,121mmol)。将混合物在室温搅拌2小时，然后通过缓慢添加丙酮(经水浴冷却)淬灭。在减压下浓缩混合物。将残余物与饱和氯化铵水溶液(100mL)和水(50mL)混合，并用乙酸乙酯(100mL,2×50mL)萃取。将合并的乙酸乙酯萃取物经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到油状物。将油状物溶于三乙基硅烷(70mL,438mmol)中。在剧烈搅拌下添加TFA(100mL,1298mmol)。将混合物在室温在氮气下搅拌2.5小时。添加水(150mL)后，用己烷(100mL,2×50mL)萃取混合物。先后用水(50mL)与饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)洗涤合并的萃取物，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到黄色液体。快速色谱纯化(330g硅胶柱，0至12％EtOAc/己烷梯度洗脱)，得到(R)-2-己基-6-碘-1,2,3,4-四氢萘(18.4g,53.8mmol)，其为无色液体。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.41(s,1H),7.38(dd,J＝7.9,1.8Hz,1H),6.79(d,J＝8.1Hz,1H),2.82-2.71(m,3H),2.31(dd,J＝16.5,10.6Hz,1H),1.93-1.85(m,1H),1.72-1.60(m,1H),1.41-1.24(m,11H),0.92-0.85(m,3H)。手性SFC分离(ChiralPak AS-H 25×3.0cm,5μm,CO2/MeOH＝95/5,180mL/min,230nm)得到液体状(R)-2-己基-6-碘-1,2,3,4-四氢萘(11.8g,PK2)及其(S)-异构体(1.4g,PK1)。
中间体8E：3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊酮
使氮气鼓泡通过(R)-2-己基-6-碘-1,2,3,4-四氢萘(I-8D,11.8g,34.5mmol)、四丁基氯化铵(9.58g,34.5mmol)、乙酸钾(10.15g,103mmol)、乙酸钯(II)(0.774g,3.45mmol)和无水DMF(100mL)的混合物达3分钟，然后添加环戊-2-烯醇(6.8g，81mmol，根据R.C.Larock et al.,Tetrahedron,199450(2),305-321制备)。使氮气再鼓泡通过该溶液达2分钟。将混合物在80℃在氮气下搅拌2.5小时，然后浓缩以除去DMF。将残余物与水(150ml)混合，并用乙酸乙酯(4×50mL)萃取。用水(30mL)洗涤合并的乙酸乙酯溶液，经无水硫酸钠干燥，经由硅胶垫过滤，并在减压下浓缩。快速色谱纯化(220g硅胶柱，5％至50％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)，得到3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊酮(5.96g,19.97mmol)LC/MS M+1＝299。
中间体8F：1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊烷甲酸甲酯
将3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊酮(I-8E,5.96g,19.97mmol)、氯化铵(5.34g,100mmol)、***(4.89g,100mmol)、7M氨的甲醇溶液(28.5ml,200mmol)和二氯甲烷(15mL)的混合物在室温搅拌1天。添加额外7M氨的甲醇溶液(15mL)。将混合物在室温搅拌1天，然后浓缩。将残余物在乙酸乙酯(70mL)与饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)之间进行分配。分离水层并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的乙酸乙酯溶液经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩，得到1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊烷甲腈，其为半固体。将半固体物质与浓盐酸(56ml,1843mmol)、水(28ml,1554mmol)、乙酸(35ml)和二噁烷(35ml)的混合物混合。将混合物在100℃在氮气下搅拌10小时，然后浓缩，得到固体。将固体溶于甲醇(20mL)中并与甲苯(20mL)混合。将混合物浓缩至干。将此干燥程序再重复一次，得到干燥的固体。将该固体溶于无水甲醇(300mL)中。在0℃在氮气下滴加亚硫酰氯(11.66mL,160mmol)。将反应混合物在70℃搅拌7小时，然后进行浓缩。用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)与一些碳酸钾固体使残余物变成碱性，并用乙酸乙酯(100mL,3×30mL)萃取。将合并的有机乙酸乙酯萃取物经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。快速色谱纯化(80g硅胶柱，20％至100％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)，得到1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊烷甲酸甲酯(5.7g,15.94mmol)，其为液体。LC/MS M+1＝358。
中间体8：
将1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊烷甲酸甲酯(I-8F,5.7g,16mmol)溶于EtOH(60mL)和二氯甲烷(15mL)中。添加硼氢化钠(2.5g，67mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。在0℃缓慢添加盐酸(6N水溶液，40mL)以使pH大约为1。将混合物在室温搅拌60分钟后，添加氢氧化钠(10g于20mL水中)以使pH为大约12。将混合物在室温搅拌40分钟，然后浓缩以除去有机溶剂。用水(20mL)稀释水性残余物，并用EtOAc(100mL,2×50mL)萃取。将合并的乙酸乙酯萃取物经无水硫酸钠干燥，经木炭脱色，经由硅藻土垫过滤，并在减压下浓缩，得到(1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇(5.0g,15mmol)，其为白色固体状。
实施例1和2及化合物3和4
使用手性SFC(柱：ChiralPak AD-H 25×3cm，5μm；流动相：CO2/(MeOH+0.1％DEA)＝88/12；流速：200mL/min；检测器波长：220nm；柱温：35℃)将中间体8分离成3个级分：F1(峰1)、F2(峰2和峰3)、F3(峰4))。使用手性SFC(柱：ChiralPak AS-H 25×3cm，5μm；流动相：CO2/[MeOH-MeCN(1:1)+0.5％DEA]＝88/12；流速：180mL/min；检测器波长：220nm；柱温：35℃)再次分离第二级分(F2)，得到峰2和峰3。所有四种异构体均是白色固体，其中LC/MS M+1＝330。
实施例1(峰2)：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.07-6.95(m,3H),3.54-3.44(m,2H),3.34(tt,J＝11.0,7.0Hz,1H),2.92-2.74(m,3H),2.39(dd,J＝16.4,10.7Hz,1H),2.29-2.14(m,1H),2.08-1.84(m,3H),1.76-1.65(m,3H),1.46-1.26(m,12H),0.99-0.85(m,3H)。
实施例2(峰4)：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.06-6.92(m,3H),3.52-3.37(m,2H),3.09-2.93(m,1H),2.88-2.72(m,3H),2.35(dd,J＝15.8,10.6Hz,1H),2.26(dd,J＝12.7,7.8Hz,1H),2.11-2.00(m,1H),1.97-1.84(m,2H),1.78-1.60(m,3H),1.43-1.22(m,12H),0.95-0.83(m,3H)。
化合物3(峰1)：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.03-6.92(m,3H),3.46(s,2H),3.39-3.24(m,1H),2.88-2.72(m,3H),2.36(dd,J＝16.3,10.8Hz,1H),2.27-2.13(m,1H),2.08-1.82(m,3H),1.76-1.63(m,3H),1.43-1.20(m,12H),0.94-0.85(m,3H)。
化合物4(峰3)：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.02-6.92(m,3H),3.51-3.37(m,2H),3.08-2.94(m,1H),2.87-2.71(m,3H),2.35(dd,J＝16.2,11.1Hz,1H),2.25(dd,J＝13.1,7.8Hz,1H),2.12-1.97(m,1H),1.97-1.83(m,2H),1.81-1.59(m,3H),1.43-1.21(m,12H),0.96-0.74(m,3H)。
根据用于中间体8、实施例1-2和化合物3-4的一般合成和分离程序使用碘化物中间体I-8D的(S)-对映异构体(PK1)制备化合物5-8。所有四种异构体(化合物5-8)均具有MW＝329.5；LC/MS M+1＝330；HPLC条件：C。
表1
表2
实施例2的替代制备
制备2A：(5R,7S)-7-(6-己基-7,8-二氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
在-40℃向三氟甲磺酸6-((5R,7S)-2-氧代-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-7-基)-3,4-二氢萘-2-基酯(中间体6,1g,2.396mmol)和NMP(2.306mL,23.96mmol)在THF(20mL)中的混合物中添加双(三甲基硅烷基)氨基锂在THF中的溶液(2.396mL,2.396mmol)。将反应混合物搅拌15分钟，然后添加乙酰丙酮铁(0.042g,0.120mmol)和在***(ether)中的己基溴化镁(2.396mL,4.79mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，然后用水淬灭。用乙酸乙酯稀释反应混合物并用1M HCl洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在硅胶筒(40g)上使用EtOAc/己烷梯度(0-100％EtOAc，经12CV)纯化粗物质，得到662mg(5R,7S)-7-(6-己基-7,8-二氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮，其为白色固体。HPLC保留时间＝1.28分钟(条件G)；LC/MS M+1＝354：1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.03-6.88(m,3H),6.21(s,1H),5.16(br.s.,1H),4.44-4.15(m,2H),3.13-2.96(m,1H),2.80(t,J＝8.0Hz,2H),2.47-2.08(m,6H),2.05-1.93(m,2H),1.90-1.73(m,1H),1.68-1.43(m,4H),1.41-1.22(m,5H),1.01-0.83(m,3H)。
制备2B：(5R,7S)-7-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
使用100mL HEL高压釜将(5R,7S)-7-(6-己基-7,8-二氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(2A,760mg,2.15mmol)和(-)-2,3-双[(2R,5R)-2,5-二甲基磷杂环戊基]-N-[3,5-双(三氟甲基)苯基]马来酰亚胺(1,5-环辛二烯)四氟硼酸铑(I)(273mg,0.43mmol)在MeOH(27mL)中的混合物在850PSI下氢化1000分钟。过滤反应混合物并在真空中浓缩。在硅胶筒(40g)上使用EtOAc/己烷梯度(在20分钟内为0-100％EtOAc)纯化粗物质，得到640mg(5R,7S)-7-(6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮，其中两种异构体的比率为1:2。使用AS-H柱在SFC条件(35％MeOH/CO2)下分离期望主要异构体。保留时间＝5.14分钟。回收到400mg(5R,7S)-7-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.02-6.91(m,3H),4.47-4.20(m,2H),3.02(tt,J＝11.0,7.2Hz,1H),2.87-2.74(m,3H),2.41-2.24(m,2H),2.17-2.03(m,2H),2.00-1.89(m,3H),1.86-1.74(m,1H),1.73-1.61(m,1H),1.51-1.28(m,11H),0.99-0.88(m,3H)。
制备2B的替代制备
在-35℃在氮气下将(5R,7S)-7-(6-己基-7,8-二氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(2A,2.1g,5.94mmol)在DCM(10ml)中的混合物滴加至((1R,2S,3R,5R)-2,6,6-三甲基双环[3.1.1]庚-3-基)硼烷于DCM(30ml)中的溶液中。(硼烷试剂如下进行制备：在室温向S-异松蒎基硼烷四甲基乙二胺络合物(S-Alpine-Boramine)(8.4g,20.18mmol)在THF(35ml)中的混合物中添加三氟化硼醚化物(BF3ethereate)(5.11ml,40.4mmol)。将混合物在室温搅拌1.5小时，在氮气下过滤，并用冷THF(2×6ml)洗涤滤饼。合并滤液和洗涤物并在真空下浓缩。向残余物中添加DCM(20ml)并再次浓缩溶液。将所获得试剂再溶于DCM(30ml)中并将其直接用于硼氢化步骤中)。在-35℃至-30℃搅拌4小时且在-25℃至-20℃搅拌2小时后，添加MeOH(3.6mL)并将反应混合物在-10℃搅拌10分钟且在0℃搅拌10分钟。用THF(25ml)稀释混合物，然后相继滴加NaOH溶液(6N,9.9ml,59.4mmol)和H2O2(30％,6.07ml,59.4mmol)，并将混合物在室温搅拌16小时。向混合物中添加DCM(100ml)和水(50ml)。经由硅藻土垫过滤全部溶液并用DCM洗涤滤饼。分离两层，用DCM(50ml)萃取水层，将该DCM与有机层合并。用水(100ml)和盐水(100ml)洗涤合并的有机层，经无水Na2SO4干燥，然后在真空中浓缩。在硅胶筒(40g)上使用EtOAc/己烷梯度(在55分钟内为0-50％EtOAc)纯化粗物质，得到1.9g(86％)(5R,7S)-7-(6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮，其中两种异构体的比率为8:1。混合物未分离非对映异构体即传递至下一步骤中。
向在MeOH(30ml)中的(5R,7S)-7-(6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(3.2g,8.61mmol)中添加Pd/C(10％,1.1g)。向反应烧瓶中施加少量真空，随后用来自氢气球的氢气回填。在室温搅拌6小时后，添加EtOAc(20ml)以溶解沉淀物。向反应烧瓶中施加少量真空，随后用来自氢气球的氢气回填，然后将内容物在室温搅拌16小时。经由硅藻土垫过滤混合物并用EtOAc、DCM、MeOH和EtOAc洗涤滤饼。在真空中浓缩合并的溶剂，得到粗制混合物(3.06g)，其为8:1非对映异构体混合物。使用AS-H柱在SFC条件(35％MeOH/CO2)下分离主要异构体。保留时间＝4.64分钟。回收到2.35g(77％)(5R,7S)-7-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮。
实施例2：
向(5R,7S)-7-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(400mg,1.125mmol)在二噁烷(30mL)中的混合物中添加NaOH水溶液(1N,20mL)。将反应混合物在100℃加热3天，冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在硅胶筒(24g)上使用在DCM中的20％(2N NH3/MeOH)/DCM梯度(在DCM中的0-75％20％(2NNH3/MeOH)，经13CV)纯化粗物质，得到290mg((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇。HPLC保留时间＝10.09分钟(条件H)；LC/MS M+1＝330；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.03-6.91(m,3H),3.54-3.41(m,2H),3.01(tt,J＝11.1,7.2Hz,1H),2.87-2.69(m,3H),2.34(dd,J＝16.2,10.5Hz,1H),2.20(dd,J＝13.0,7.5Hz,1H),2.07-1.84(m,3H),1.83-1.60(m,3H),1.60-1.48(m,1H),1.47-1.25(m,11H),1.00-0.88(m,3H)。
实施例2的游离碱形式N-1
实施例2的游离碱形式N-1通过以下方式获得：制备含有溶于18mlTHF与1.25ml H2O的混合物中的385mg实施例2的储备溶液(20mg/ml)。接下来，将52μl储备溶液蒸发至干。向干燥物质中添加52μl比率为50:50的乙醇:庚烷溶液。蒸发所得溶液，得到结晶物质的片状物。
实施例2的单HCl盐一水合物形式H-1
实施例2的单HCl盐一水合物形式H-1通过以下方式获得：制备含有3.2mg实施例2的50:50甲醇水溶液(200μl)。接下来，伴随搅拌滴加400μl0.025M HCl水溶液。蒸发所得溶液，得到结晶物质的片状物。
实施例2的单HCl盐一水合物形式H-2
实施例2的单HCl盐一水合物形式H-2通过以下方式获得：制备含有3.2mg实施例2的50:50THF水溶液(200μl)。接下来，伴随搅拌滴加400μl0.025M HCl水溶液。然后蒸发溶液，得到实施例2的单HCl盐的一水合物H-2形式的片状物。
实施例2的单HCl盐形式N-3
实施例2的单HCl盐形式N-3通过以下方式获得：制备200μl含有3.2mg实施例2的异丙醇溶液。接下来，伴随搅拌滴加400μl 0.025M醇性HCl溶液。蒸发溶液，得到实施例2的单HCl盐的N-3形式的片状物。
实施例2的单HCl盐形式N-4
实施例2的单HCl盐形式N-3通过以下方式获得：制备200μl含有3.2mg实施例2的50:50甲醇/THF溶液。接下来，伴随搅拌滴加400μl 0.025M醇性HCl溶液。蒸发所得溶液，得到实施例2的单HCl盐的N-4形式的片状物。
实施例2的一水合物半-L-苹果酸盐形式H-1
一水合物半-L-苹果酸盐形式H-1通过以下方式获得：制备200μl含有3.2mg实施例2的50:50THF水溶液。接下来，伴随搅拌滴加240μl 0.042M醇性L-苹果酸溶液。蒸发所得溶液，得到实施例2的半-L-苹果酸盐的H-1形式的片状物。
实施例2的一水合物半-丙二酸盐形式H-1
一水合物半-丙二酸盐形式H-1通过以下方式获得：制备200μl含有3.2mg实施例2的50:50 THF水溶液。接下来，伴随搅拌滴加193μl 0.052M醇性丙二酸溶液。蒸发所得溶液，得到实施例2的半-丙二酸盐的H-1形式的片状物。
实施例2的1/3水合物磷酸盐形式H.33-1
1/3水合物磷酸盐形式H.33-1通过以下方式获得：制备200μl含有3.2mg实施例2的50:50甲醇水溶液。接下来，伴随搅拌滴加136μl 0.073M醇性磷酸溶液。蒸发所得溶液，得到实施例2的磷酸盐的H.33-1形式的片状物。
实施例2的R-(+)-苦杏仁酸盐形式N-1
R-(+)-苦杏仁酸盐形式N-1通过以下方式制备：将实施例2和等摩尔量的R-(+)-苦杏仁酸添加至甲醇与乙腈的混合物中。蒸发溶液，得到实施例2的单R-(+)-苦杏仁酸盐的N-1形式的片状物。
实施例9
二氢磷酸((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯
在0℃向((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇(实施例1,10mg,0.030mmol)在无水乙腈(1mL)中的搅拌溶液中添加焦磷酰氯(0.042mL,0.303mmol)。将所获得澄清溶液在相同温度搅拌5分钟并在室温搅拌过夜。添加水(0.4mL)后，将混合物在室温搅拌1小时。使用反相HPLC(Luna AXIA 5u c18 30×100mm,10分钟梯度，40％至100％溶剂B，溶剂A：0.1％TFA水溶液，溶剂B：0.1％TFA/MeCN)纯化，浓缩并冻干，得到二氢磷酸((1R,3R)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯(2mg,4.15μmol,13.68％产率)，其为白色固体。HPLC保留时间＝3.94分钟(条件C)；LC/MS M+1＝410；1H NMR(500MHz,甲醇-d4+KOH)δ6.97-6.87(m,3H),3.77-3.71(m,1H),3.71-3.66(m,1H),2.83-2.70(m,3H),2.32(dd,J＝16.2,10.7Hz,1H),2.14-1.98(m,2H),1.96-1.83(m,2H),1.74-1.60(m,3H),1.59-1.49(m,1H),1.45-1.26(m,11H),0.94-0.87(m,3H)，一个质子在甲醇溶剂峰下(约3.3ppm)。
实施例10
二氢磷酸((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯
将五氧化二磷(150mg,0.528mmol)与85％磷酸(0.15mL,10.01μmol)的混合物在100℃在氮气下搅拌1小时，然后添加((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇(实施例1,6mg,0.018mmol)。将该溶液在相同温度搅拌3小时。在室温添加水(0.5mL)。将混合物在室温搅拌1小时。使用反相HPLC(Phenomenex Luna AXIA 5u c18 30×100mm，10分钟运行，溶剂A：10％MeOH:90％H2O:0.1％TFA，溶剂B：90％MeOH、10％H2O、0.1％TFA)纯化，浓缩并冻干，得到二氢磷酸((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯(4mg,9.38μmol)，其为白色固体。LC/MSM+1＝410。HPLC保留时间＝3.96分钟(条件C)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4+CDCl3)δ7.10-6.83(m,3H),4.06-3.77(m,2H),3.20-3.06(m,1H),2.85-2.74(m,2H),2.48(dd,J＝12.9,6.9Hz,1H),2.40-2.28(m,1H),2.19-2.08(m,1H),2.05-1.90(m,4H),1.80-1.62(m,2H),1.48-1.22(m,12H),0.95-0.86(m,3H)。
实施例10的替代制备
替代制备10A：((1R,3S)-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-1-(羟基甲基)环戊基)氨基甲酸叔丁酯
向((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲醇(实施例2,270mg,0.819mmol)在无水二氯甲烷(6mL)中的搅拌溶液中添加一缩二碳酸二叔丁酯(536mg,2.458mmol)。将所得溶液在室温搅拌3小时。浓缩混合物。快速色谱纯化(24g硅胶柱，10％至60％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)，得到((1R,3S)-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-1-(羟基甲基)环戊基)氨基甲酸叔丁酯(337mg,0.784mmol,96％产率)，其为白色固体。LC/MS M+1＝430。
替代制备10B：((1R,3S)-1-(((双(2-(三甲基硅烷基)乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)氨基甲酸叔丁酯
在0℃在氮气下向((1R,3S)-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-1-(羟基甲基)环戊基)氨基甲酸叔丁酯(制备10A,336mg,0.782mmol)在无水二氯甲烷(7mL)中的搅拌溶液中逐份添加双(2-(三甲基硅烷基)乙基)二异丙基亚磷酰胺(858mg,2.346mmol)。接下来，然后添加1,2,4-1H-***(162mg,2.346mmol)。将反应混合物在40℃搅拌18小时。使溶液冷却至0℃，然后添加过氧化氢(0.781mL,7.82mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1小时，然后添加甲醇(3mL)以使混合物成为均匀溶液。将该溶液在室温搅拌1小时。添加饱和硫代硫酸钠水溶液(5mL)以淬灭反应。在减压下浓缩混合物并用乙酸乙酯(3×4mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机溶液并在减压下浓缩。快速色谱纯化(24g硅胶柱，5％至25％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)得到((1R,3S)-1-(((双(2-(三甲基硅烷基)乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)氨基甲酸叔丁酯(514mg,0.724mmol)，其为液体。
实施例10：
在0℃向((1R,3S)-1-(((双(2-(三甲基硅烷基)乙氧基)磷酰基)氧基)甲基)-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)氨基甲酸叔丁酯(制备10B,500mg,0.704mmol)在二氯甲烷(6mL)中的搅拌溶液中缓慢添加TFA(6mL)。将混合物在室温搅拌3小时，然后添加90mL庚烷。在减压下浓缩溶液。接下来，将70mL甲醇添加至固体残余物中，随后添加1N aq NaOH(4mL)。然后，在60℃添加HOAc(0.4mL)，以使溶液酸化至pH＝4。将固体-液体混合物在60℃搅拌1小时。分离固体，用甲醇、水、甲醇、乙酸乙酯和甲醇洗涤。冻干得到二氢磷酸((1R,3S)-1-氨基-3-((R)-6-己基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)环戊基)甲酯(257mg,0.619mmol,88％产率)，其为白色固体。LC/MS M+1＝410；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)(+KOH)δ7.00-6.86(m,3H),3.78-3.62(m,2H),3.09-2.97(m,1H),2.84-2.67(m,3H),2.38-2.22(m,2H),2.03-1.74(m,4H),1.73-1.60(m,2H),1.50(t,J＝12.3Hz,1H),1.44-1.27(m,11H),0.95-0.86(m,3H)。
比较化合物(Comparative Compound)11
(1R,3R)-1-氨基-3-(6-(戊基氧基)萘-2-基)环戊基)甲醇
比较化合物11披露于WO 2008/079382的实施例Q.1中。
中间体11A：(5R,7R)-7-(6-(戊基氧基)萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮
将1-戊醇(6.13mL,56.4mmol)、对甲苯磺酸一水合物(4.60mg,0.024mmol)与三甲氧基甲烷(0.353mL,3.22mmol)的混合物在100℃搅拌3小时，同时使缓慢空气流流经混合物以除去甲醇和一些戊醇。将所获得残余液体与(5R,7R)-7-(6-氧代-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(中间体7,230mg,0.806mmol)混合，并在100℃在氮气下搅拌2.5小时。使溶液冷却至室温，然后相继添加碳载钯(172mg,0.081mmol)和乙酸乙酯(4mL)。将混合物在氢气球压力下在室温搅拌过夜。经由膜滤器过滤所得混合物并浓缩滤液。快速色谱纯化(24g硅胶柱，0％至70％乙酸乙酯/己烷)得到180mg材料，其需要额外纯化。超临界流体色谱分离得到主要级分(36mg)，其为固体，通过UV分析经鉴定为(5R,7R)-7-(6-(戊基氧基)萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮。仪器：Thar 350Thar分析型SFC-MS；条件：分析条件：分析型柱：AD-H(0.46×25cm,5μm)；BPR压力：100巴；温度：45℃；流速：3.0mL/min；流动相：CO2/MeOH(70/30)；检测器波长：UV 200-400nm。制备条件：制备型柱：AD-H(3×25cm,5μm)；BPR压力：100巴；温度：35℃；流速：120mL/min；流动相：CO2/MeOH(70/30)；检测器波长：220nm；分离程序：叠层式注射(Stack injection)；注射：2.5mL，其中循环时间为480秒(sec)。(分析型SFC保留时间＝11.68分钟，纯度>99.5％)HPLC保留时间＝1.11分钟(条件G)；LC/MS M+1＝354。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(s,1H),7.30(s,1H),7.21-7.04(m,2H),6.48(br.s.,1H),4.50-4.28(m,2H),4.07(t,J＝6.6Hz,2H),3.49-3.31(m,1H),2.46(dd,J＝13.3,7.6Hz,1H),2.39-2.24(m,1H),2.24-2.12(m,1H),2.12-2.00(m,1H),2.00-1.90(m,1H),1.90-1.76(m,3H),1.58-1.30(m,4H),0.96(t,J＝7.0Hz,3H)。
比较化合物11：
向(5R,7R)-7-(6-(戊基氧基)萘-2-基)-3-氧杂-1-氮杂螺[4.4]壬-2-酮(36mg,0.102mmol)在二噁烷(2mL)和水(0.8mL)中的溶液中添加LiOH(36.6mg,1.528mmol)。将溶液加热至90℃且搅拌15小时。使反应混合物冷却至室温，倾入乙酸乙酯中并用水洗涤。然后，在反相HPLC[柱：Luna Axia 30*100mm；梯度时间：10分钟；流速＝40ml/min；溶剂A＝10％MeOH-90％水-0.1％TFA；溶剂B＝90％MeOH-10％水-0.1％TFA；开始B％＝20；最后B％＝100]上纯化粗物质。收集含产物的级分并在高真空下干燥，得到((1R,3R)-1-氨基-3-(6-(戊基氧基)萘-2-基)环戊基)甲醇TFA(31mg)，其为固体。HPLC保留时间＝0.90分钟(条件G)；LC/MS M+1＝328。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.75-7.66(m,2H),7.66-7.59(m,1H),7.40-7.33(m,1H),7.17(d,J＝2.6Hz,1H),7.14-7.08(m,1H),4.07(t,J＝6.5Hz,2H),3.74-3.60(m,2H),3.59-3.41(m,1H),2.39-2.22(m,3H),2.04-1.80(m,5H),1.55-1.34(m,4H),1.01-0.89(m,3H)。
生物学测定
小鼠全血磷酸化(WBP)测定：
式(III)化合物需要经醇的磷酸化实施生物活化以得到式(II)的活性磷酸酯化合物。根据Brinkmann,V.et al.,(J.Biological Chem.2002,277,21453-21457)，携带碳中心的胺的立体异构构型可影响该磷酸化发生的相对程度。
通过在来自小鼠的全血中温育醇化合物来评估实施例1-2和化合物3-8的磷酸化的相对程度。在4小时后测量磷酸化化合物的出现以确定磷酸酯形成的相对程度。通过眶后取血(retro-orbital bleeding)自BALB/C小鼠获得新鲜全血，并收集至含EDTA的管中。将经EDTA处理的全血在96孔格式中等分至1.4mL聚丙烯管中(100μL/样品)并掺加有测试化合物(1mM的DMSO溶液)，以使最终浓度为10μM(n＝2/化合物)。将管密封并进行涡旋，然后转移至定轨振荡器(orbital shaker)中以在37℃和225RPM温育4小时。在温育结束时，将样品点样至未经处理的Ahlstrom 226样本收集纸上(25μL/点，n＝2)，使其风干过夜。将干血点(DBS)卡在环境温度储存在添加有干燥剂密封塑料袋中。当准备用于分析时，以n＝1取6mm冲孔(相当于12.5μl湿血液)并置于浅的96孔滤板中。接下来，添加105μL含有内标物的75％乙腈和25％水的混合物，轻轻涡旋30分钟，然后进行离心。使上清液与蛋白团粒(pellet)分离并注射5μl。通过在三重四极杆仪器上实施LC/MS/MS使用DBS校准曲线定量分析母体(醇)和活性磷酸酯化合物。确定磷酸化化合物对母体(醇)化合物的面积比。磷酸化化合物对母体(醇)化合物的比值越大表明由母体(醇)化合物形成的磷酸酯化合物越多。表2显示实施例1-2和化合物3-8在4小时的结果(两次实验的平均值)。对于实施例1-2和化合物6，4小时时所形成磷酸酯化合物对母体(醇)化合物的面积比为至少0.59。相比之下，化合物3-5和7-8所形成磷酸酯化合物对母体(醇)化合物的面积比为0.17或更小。在本研究中，发现实施例1-2和化合物6历经磷酸化的程度大于化合物3-5和7-8。
表2
小鼠全血磷酸化-磷酸化的程度
实施例或化合物编号 4小时时小鼠全血磷酸酯面积比
1 1.60
2 0.59
3 0.07
4 0.14
5 0.03
6 0.60
7 0.02
8 0.17
小鼠体内磷酸酯的形成
口服给药BALB/c小鼠实施例1、实施例2、化合物3和化合物4(10mg/kg，呈在媒介物聚乙二醇300“PEG300”中溶液或悬浮液的形式)。在24小时时抽取血液，点样至干血点(DBS)卡上，并如针对WBP测定所述进行分析。分析参考物质(母体醇和磷酸酯)以优化LC-MS/MS分析且使得数据能够以浓度形式报告。制备含有母体醇和磷酸酯化合物二者的DBS标准曲线并以与研究样品相同的方式进行分析，且通过优化LC-MS/MS进行分析，以定量所形成磷酸酯化合物的量。表3中的结果代表每一治疗组内所有动物(n＝3)的平均结果。磷酸酯化合物浓度值越大表明自母体(醇)化合物形成的磷酸酯化合物越多。在本研究中，发现实施例1-2历经磷酸酯形成的程度大于化合物3-4。此活体内研究的结果与在上述小鼠全血磷酸化研究中获得的结果一致。
表3
小鼠活体内磷酸酯的形成
实施例或化合物编号 剂量(mg/kg) 24小时时的磷酸酯(nM)
1 10 475
2 10 202
3 10 14
4 10 46
S1P1结合测定：
由表达人类S1P1的CHO细胞制备膜。将细胞沉淀物(1×109个细胞/沉淀物)悬浮于含有20mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(pH 7.5))、50mM NaCl、2mM EDTA(乙二胺四乙酸)和蛋白酶抑制剂混合剂(Roche)的缓冲液中，并使用Polytron均质机在冰上进行破碎。以20,000rpm(48,000g)对均质物进行离心，弃去上清液。在确定蛋白浓度后，将膜沉淀物再悬浮于含有50mM HEPES(pH 7.5)、100mM NaCl、1mM MgCl2、2mM EDTA的缓冲液中，并以多个等份在-80℃储存。
将膜(2μg/孔)和在测定缓冲液(50mM HEPES(pH7.4)、5mM MgCl2、1mM CaCl2、0.5％无脂肪酸BSA(牛血清白蛋白)、1mM NaF)中稀释且最终浓度为0.03nM的33P-S1P配体(1mCi/ml，Perkin Elmer或American RadiolabeledChemicals)添加至化合物板(384Falcon v形底板)(0.5μl/孔，11点，3倍稀释)中。将结合在室温实施45分钟，将膜收集至384孔Millipore FB滤板上进行终止，并通过测量放射活性。以对放射配体特异结合的抑制百分比绘制测试化合物在某一浓度范围内的竞争数据。将IC50定义为使特异结合降低50％所需竞争性配体的浓度。实施例10的IC50经确定为0.01nM。
受体[35S]GTPγS结合测定：
将化合物装载于384Falcon v形底板中(0.5μl/孔，11点，3倍稀释)。将由S1P1/CHO细胞或EDG3-Ga15-bla HEK293T细胞(EDG3等效于S1P3)制备的膜添加至具有的化合物板中(40μl/孔，最终蛋白为3μg/孔)。将[35S]GTP(1250 Ci/mmol，Perkin Elmer)在分析缓冲液(20mM HEPESpH7.5、10mM MgCl2、150mM NaCl、1mM EGTA(乙二醇四乙酸)、1mM DTT(二硫苏糖醇)、10μM GDP、0.1％无脂肪酸BSA和10μg/ml皂苷)中稀释成0.4nM。将40μl[35S]GTP溶液添加至化合物板中，其中最终浓度为0.2nM。使反应在室温保持45分钟。在温育结束时，经由Vprep液体处理器将化合物板中的所有混合物转移至Millipore 384孔FB滤板中。通过使用歧管Embla板(manifold Embla plat)洗涤器用水将滤板洗涤4次，并在60℃干燥45分钟。将MicroScint 20闪烁液(30μl)添加至每一孔中以在Packard上计数。将EC50定义为对应于针对每个所测试个别化合物获得的50％Ymax(最大反应)的激动剂浓度。在利用由S1P1/CHO细胞制备的膜的测定中，实施例10的EC50经确定为0.9nM。在利用由EDG3-Ga15-bla HEK293T细胞制备的膜的测定中，实施例10的EC50经确定>62,500nM。
GTPγS S1P1EC50值的值越小表明化合物在GTPγS S1P1结合测定中的活性越大。GTPγS S1P3EC50值的值越大表明在GTPγS S1P3结合测中的活性越小。实施例10是实施例2的活性磷酸酯，其作为S1P1的激动剂具有活性且对S1P3是选择性的。因此，本发明化合物(包括实施例1-2和9-10)可用于治疗、预防或治愈各种与S1P1受体相关的病况，同时减少因S1P3活性引起的副作用或使其减至最少。本发明化合物的令人惊奇的选择性表明其可用于治疗、预防或治愈自身免疫性和炎性疾病(例如多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病、狼疮或牛皮癣)，同时减少因S1P3活性引起的可能副反应或使其减至最少。本发明化合物的其他可能用途包括使移植器官的排斥减至最少或使其减少，同时减少因S1P3活性引起的副主要或使其减至最少。
S1P1受体内化测定：
将表达经GFP标记的S1P1受体的CHO-K1细胞以4×103个细胞/孔平铺于384孔聚-D-赖氨酸涂覆的组织培养板中的50μl分析培养基(F12，具有L-谷氨酰胺、10％经木炭/葡聚糖处理的FBS、1×青霉素-链霉素、1M HEPES)中。将细胞板在37℃/5％CO2温育过夜。将测试化合物以11点、3倍连续稀释由化合物来源板引入细胞板中，然后将测定板在37℃/5％CO2温育45分钟。在室温用6％甲醛固定细胞并用在PBS(不含Ca2+/Mg2+)中的15μg/ml赫希斯特染料(Hoechst dye)染色15分钟。用PBS(不含Ca2+/Mg2+)将细胞板洗涤4次，添加50μl/PBS，然后将板密封。通过Cellomics ArrayScan VTI高内涵成像器(high content imager)获取影像。在阵列扫描(Array Scan)上使用隔室分析生物应用(Compartmental Analysis BioApplication)实施相对于内部对照化合物确定EC50的数据分析。将EC50定义为激动剂浓度对应于针对每个所测试个别化合物获得的Ymax(最大反应)的50％，并使用4个参数的逻辑方程(logistic equation)拟合数据进行定量。实施例9的EC50在该测定中经确定为361nM。
啮齿动物中的血液淋巴细胞减少(BLR)测定：
将单独媒介物(聚乙二醇300，“PEG300”)或2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]-1,3-丙二醇盐酸盐(CAS：162359-56-0)在媒介物中的溶液以经调节反映测试物品的游离量的0.1mg/kg、0.5mg/kg和3.0mg/kg的剂量口服给予路易鼠(Lewis rat)。结果提供在表4a中，并且在3.0mg/kg给药后24小时淋巴细胞减少的水平最大。淋巴细胞减少百分比是剂量相关的，但关系并非线性的，其中剂量的非比例增加是引发淋巴细胞计数的依序进一步减少所需的。例如，在证实改变13％(减少69％至减少82％)的该研究中，需要使剂量增加5倍(0.1mg/kg至0.5mg/kg)。另外，在该研究中为证实改变另一7％(减少82％至减少89％)，需要使剂量增加6倍(0.5mg/kg至3.0mg/kg)。用单独媒介物(聚乙二醇300，“PEG300”)或实施例1、实施例2、化合物6、化合物8或比较化合物11口服给予BALB/c小鼠。在利用盐形式的情况下，化合物是以经调节反映测试物品的游离量以在媒介物中的溶液或悬浮液形式给予。在24小时时抽取血液，并在120血液学分析器(Siemens HealthcareDiagnostics)上确定血液淋巴细胞计数。在测量时间以与媒介物治疗组相比的循环淋巴细胞百分比的减少测量结果。所述结果代表每个治疗组内所有动物(n＝2-4)的平均结果。上文所述小鼠中血液淋巴细胞减少测定(BLR)的结果显示于表4b中。
表4a
2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]-1,3丙二醇盐酸盐
表4b
肺毒性测定
使用由动物获得的支气管肺泡灌洗(BAL)流体中蛋白含量的分析来衡量肺副作用。BAL流体中蛋白含量增加表明具有不期望的肺效应，例如肺水肿。以30mg/kg的剂量向小鼠口服给药实施例1、实施例2、化合物6、化合物8和化合物11。在给药后24小时，以腹膜内过量给予巴比妥酸盐(barbiturate)对小鼠实施无痛处死。将动物置于仰卧位，制备皮肤切口且随后实施钝剥离以使气管暴露。切开气管并将4-6mm导管***气管中。将磷酸盐缓冲盐水(PBS；1mL/小鼠)输注至肺中，然后抽出。在1800化学分析器(Siemens Healthcare Diagnostics)上确定经回收BAL流体中的BAL蛋白浓度。支气管肺泡灌洗(BAL)测定的结果显示于表5中。所述结果代表每个治疗组内所有动物(n＝2-4)的平均结果。
表5
表5显示与仅给予媒介物相比测试化合物在24小时时的相对BAL蛋白含量。相对BAL蛋白相对于对照的值大于1表明与仅给予媒介物相比在肺毒性方面有所增加。在本研究中，如表5中所报告，给予实施例1和2得到的相对BAL蛋白含量为0.99和0.96，表明肺毒性未增加。给予化合物8得到的相对BAL蛋白含量为1.03，表明肺毒性略微增加或未增加。相比之下，给予化合物6和化合物11得到的相对BAL蛋白含量为1.94和1.33，表明肺毒性有所增加。
已将本发明化合物(例如实施例1和2)与a)化合物6和8以及b)WO2008/079382中披露的比较化合物11进行比较，且已发现本发明化合物是尤其有利的。本发明化合物的惊人的优点在于在减少血液淋巴细胞并使肺副作用(例如肺水肿)减至最少方面的活性的组合。如表4b和5中所示，在所报告测试中，本发明的实施例1和2在减少血液淋巴细胞而不增加BAL蛋白(肺副作用的量度)的效能方面显示出惊人的优点。例如，如与化合物6、8和11相比，在表4b和5中报告的所示例本发明化合物使血液淋巴细胞减少88％和90％，且分别得到的相对BAL蛋白含量为0.99和0.96，表明肺副作用未增加。相比之下，在类似测试中，化合物6和比较化合物11使血液淋巴细胞减少78％和52％，且分别得到的相对BAL蛋白含量为1.96和1.33，表明肺副作用的风险有所增加。化合物8使血液淋巴细胞减少59％且得到的相对BAL蛋白含量为1.03，表明肺副作用未增加或略微增加。
表6
来自表4b和5的小鼠血液淋巴细胞的减少和小鼠BAL蛋白含量
本发明化合物作为S1P1受体的激动剂具有活性，使得循环血液淋巴细胞有所减少，并因此可用于治疗、预防或治愈各种与S1P1受体相关的病况，同时减少肺副作用(例如肺水肿)或使其减至最少。本发明化合物的惊人的选择性表明其可用于治疗、预防或治愈自身免疫性和炎性疾病(例如多发性硬化、类风湿性关节炎、炎性肠病、狼疮或牛皮癣)，同时减少可能的肺副作用或使其减至最少。本发明化合物的其他可能用途包括使移植器官的排斥减至最少或使其减少，同时减少可能的肺副作用或使其减至最少。
大鼠佐剂诱导型关节炎测定(AA)
大鼠佐剂诱导型关节炎模型是人类类风湿性关节炎的动物模型。
用100μl在弗氏不完全佐剂(incomplete Freund’s adjuvant)(sigma)中的10mg/ml新磨碎的乳酪分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)(DifcoLaboratories)在尾巴底部处对雄性路易鼠(150-175g；Harlan，n＝8治疗组)实施免疫。自免疫当天开始，每天给予动物一次测试物品(呈在媒介物中的溶液或悬浮液的形式)或单独媒介物(聚乙二醇300，“PEG300”)。在水置换器官充满度测量器(Ugo Basile，Italy)测量其后爪的体积。在疾病发作前(第7天至第10天)对基线爪实施测量。然后一周3次实施爪测量直至在第20天至第21天研究结束为止。涉及动物的所有程序皆经实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care Use Committee)审查和批准。
在上文所述大鼠佐剂诱导型测定中测试本发明的实施例2，结果显示于表7中。在所报告测试中，本发明化合物(例如实施例2)显示可抑制疾病进展，如在路易鼠中使用预防性口服给药方案通过爪肿胀减轻进行测量。
表7
小鼠T细胞转移诱导型结肠炎分析
小鼠T细胞转移诱导型结肠炎分析是人类结肠炎的动物模型。
通过继承性转移来自BALB/c小鼠的FACS分选的CD4+CD45RB高T细胞(3×105/小鼠，腹膜内)在CB-17SCID小鼠中诱导结肠炎。基于体重、软便或腹泻和直肠脱垂，在初始3周一周一次监测疾病活动，并在后续各周每周监测3次。自T细胞转移之日开始，每隔一天(q.o.d.)口服给予动物测试物品或媒介物。在T细胞重构后6周(wk)将小鼠处死，并基于H&E染色的结肠组织的组织学检查分析肠发炎。涉及动物的所有程序均经实验动物管理和使用委员会审查和批准。
在上文所述小鼠T细胞转移诱导型结肠炎模型中测试实施例2，结果显示于表8中。在所报告测试中，本发明化合物(例如实施例2)显示可抑制疾病进展，如在小鼠T细胞转移诱导型结肠炎分析中通过体重损失降低或体重增加以及发炎和损害减少进行测量。
表8
自发性红斑狼疮测定的MRL/lpr小鼠模型
自发性红斑狼疮测定的MRL/lpr小鼠模型时自发性红斑狼疮的动物模型。
在第0天开始利用实施例2(呈在媒介物中的溶液形式)或单独媒介物(聚乙二醇300)一周两次口服给予雄性MRL/lpr小鼠(14周龄；JacksonLaboratories；n＝12-13)并持续11周。在第0天和在整个研究中测量尿蛋白水平(通过尿蛋白检查剂(Albustix)测量)。表9表明各治疗组中证实在25周龄时蛋白尿水平较高(大于100mg/dL)的小鼠的百分比。其他组的小鼠独立地或与每周两次给予实施例2组合接受日口服剂量的***(Dex)。在第0天和在整个研究中测量尿蛋白水平(通过尿蛋白检查剂测量)。表9表明各治疗组中证实在24周龄时蛋白尿水平较高(大于100mg/dL)的小鼠的百分比。涉及动物的所有程序均经实验动物管理和使用委员会审查和批准。
在上文所述自发性红斑狼疮测定的MRL/lpr小鼠模型中测试实施例2，结果显示于表9中。在所报告测试中，本发明化合物(例如实施例2)显示可抑制疾病进展，如通过蛋白尿水平大于100mg/dL的小鼠的百分比降低进行测量。
表9
25周龄时的蛋白尿
组 蛋白尿>100mg/dL的小鼠％
媒介物 54
实施例2(0.05mg/kg；每周2次) 25
实施例2(0.4mg/kg；每周2次) 17
实施例2(2mg/kg；每周2次) 10
在上文所述自发性红斑狼疮测定的MRL/lpr小鼠模型中独立地或组合测试实施例2和***(Dex)，结果显示于表10中。在所报告测试中，本发明化合物(例如实施例2)和***均显示可抑制疾病进展，如通过蛋白尿水平大于100mg/mL的小鼠的百分比降低进行测量。在该测试中，给予实施例2与***的组合的小鼠的蛋白尿水平均不大于100mg/mL。
表10
24周龄时的蛋白尿
单晶X射线衍射法
在Bruker-AXS APEX2CCD***上使用Cu Kα辐射收集单晶数据。利用APEX2软件程序组将所测得强度数据进行索引和处理。在有所指示时，在数据收集期间将晶体在牛津冷却***(Oxford cryo system)的冷流中冷却。通过直接方法对结构进行解析并基于实测反射使用SHELXTL程序进行精修。经由全矩阵最小二乘法来精修衍生原子参数(坐标和温度因子)。在精修中最小化的函数为Σw(|Fo|-|Fc|)2。R定义为Σ||Fo|-|Fc||/Σ|Fo|，而Rw＝[Σw(|Fo|-|Fc|)2/Σw|Fo|2]1/2，其中w是基于实测强度中的误差的适当加权函数。通常，以各向异性方式精修所有非H原子并通过几何方法计算除那些附接至N和O原子以外的所有H原子且使用骑式模型进行精修。
X射线粉末衍射法
使用Bruker GADDS(General Area Detector Diffraction System)手动χ平台测角器(manual chi platform goniometer)获得X射线粉末衍射(PXRD)数据。将粉末样品置于直径为0.7mm的薄壁玻璃毛细管中；在数据收集期间旋转毛细管。使样品与检测器的距离保持为17cm。利用Cu Kα辐射 在2.5<2θ<35°范围内收集数据，样品暴露时间为600秒。

Claims (12)

1.式(I)化合物和/或其盐，
其中R为-OH或-OP(O)(OH)2。
2.权利要求1的化合物或其盐，其中R为-OH。
3.权利要求1的化合物或其盐，其中R为-OP(O)(OH)2。
4.权利要求1的化合物或其盐，其具有以下结构：
5.权利要求1的化合物或其盐，其具有以下结构：
6.权利要求5的化合物或其盐，其中所述化合物或所述盐为结晶固体。
7.权利要求1的化合物或其盐，其具有以下结构：
8.权利要求1的化合物或其盐，其具有以下结构：
9.药物组合物，其包含权利要求2的化合物或其药用盐；以及药用载体。
10.治疗与G蛋白偶联受体S1P1的活性相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物患者给药权利要求1的化合物或其药用盐。
11.治疗自身免疫性疾病或慢性炎性疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物患者给药权利要求1的化合物或其药用盐。
12.权利要求11的方法，其中所述自身免疫性疾病或慢性炎性疾病选自狼疮、多发性硬化、炎性肠病和类风湿性关节炎。
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