CN105021829A - 一种定量检测b型钠尿肽的试剂盒及b型钠尿肽的检测方法 - Google Patents

一种定量检测b型钠尿肽的试剂盒及b型钠尿肽的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，其包括免疫磁珠和双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒；本发明还涉及一种B型钠尿肽的检测方法，其利用本发明的试剂盒进行检测。本发明试剂盒进行检测准确度高、特异性强、自动化程度高，本发明试剂盒和检测方法特别很适于快速筛查B型钠尿肽，具有广泛的应用前景。

Description

一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒及B型钠尿肽的检测方法
技术领域
本发明属于免疫分析检测领域，具体涉及一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，还涉及利用该试剂盒的B型钠尿肽的检测方法。
背景技术
B型钠尿肽（B type natriuretic peptide,BNP）是心衰的标志物，与充血性心力衰竭有密切关系，其主要来源于心室肌细胞，左心室容量或压力负荷的增加是刺激BNP分泌与释放的主要因素，BNP水平的增高已被视为心功能衰竭程度和慢性心力衰竭患者病死率的一个独立的预后指标。因而BNP成为当前国际上心血管疾病研究的热点之一。
目前，检测BNP主要有放射免疫法（RIA）、高灵敏度的免疫放射法（IRMA）、酶免疫法（EIA）、微粒子酶免疫法（MEIA）、免疫荧光法（FIA）等。RIA法有放射性污染，而IRMA法费时费力，自动化程度不高。目前国内外常用的实验室检测方法是电化学发光法，该方法结果精准，但是不能快速提供检查结果。
目前，关于BNP快速诊断试剂盒的研制处于起步阶段，其中获得抗BNP的抗体或多肽、并采用合适的方法将其应用于检测是制备BNP快速诊断试剂盒的关键技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，能够快速、准确的定量检测BNP，特异性强，灵敏度高。本发明还提供了使用该试剂盒的BNP的检测方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，其包括免疫磁珠和双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒，所述双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒包括抗体B型钠尿肽的单克隆抗体及免疫荧光ELISA缓冲液。
进一步的，所述免疫磁珠为抗B型钠尿肽的多克隆抗体通过链霉亲和素-生物素偶联纳米磁微粒制备。
进一步的，所述多克隆抗体由B型钠尿肽多肽段aar6-18，aar10-22和aar11-26混合免疫兔子得到的抗体混合物。
进一步的，所述免疫磁珠的制备方法为：将B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗B型钠尿肽血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，待用；采用活泼酯的方法，将180nm磁珠与链霉亲和素偶联获得链霉亲和素磁珠，采用生物素化多抗与链霉亲和素磁珠连接制成链霉亲和素免疫磁珠，具体为：洗涤磁珠后，依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和二氯乙烷，置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h；将活化后的磁珠与链霉亲和素偶联，获得的链霉亲和素磁珠，再将其与待用的抗B型钠尿肽血清置于混匀仪上偶联，形成免疫磁珠，4℃冰箱保存备用。
进一步的，双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒的一抗和二抗通过多肽合成的B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫BALB/c雌性6周龄健康小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选得到；一抗亚型是IgG1,亲和力常数在1×1010 L/mol，效价为20.48万，特异性良好；二抗选用选用碱性磷酸酶标记，二抗亚型是IgG2a，亲和力常数在1×1010 L/mol，特异性良好，并且一抗和二抗经相加试验计算相加指数AI=98.6%。
进一步的，所述一抗的包被缓冲液为0.01M PBS，pH7.2，包被浓度为2.5μg/mL。
进一步的，所述二抗与碱性磷酸酶标记摩尔比例为4：1。
进一步的，酶标二抗的浓度为1.65μg/mL，或1.8μg/mL，优选1.8μg/mL。
一种抗B型钠尿肽的检测方法，其选用所述试剂盒。
进一步的，其步骤为：将待测样品加入免疫磁珠中，洗脱得到上清液；取上清液加入包被有一抗的酶标板孔内，45℃温育30min；洗板，加入酶标二抗，45℃温育20min；洗板，加入荧光底物，45℃温育10min；荧光检测仪检测、读数并计算待测样品的B型钠尿肽含量。
本发明的有益效果在于，将纳米免疫磁珠分离技术与化学发光检测技术相结合，通过纳米磁珠偶联多抗，形成免疫磁珠进而来富集捕获样品中B型钠尿肽，再将捕获的B型钠尿肽进行基于双抗体夹心原理的免疫荧光ELISA，本发明试剂盒进行检测准确度高、特异性强、自动化程度高，而且为高通量检测，96个血样只需90min即可检出，其灵敏度可达9pg/mL。本发明选用三段抗原混合免疫兔子得到抗体，其多抗的免疫位点多样，提高了捕获的特异性和效率；本发明合成的ELISA一抗和酶标二抗相加指数AI=95.8%，两株抗体所结合抗原的不同构象表位且距离很远，特别适合于本发明双抗体夹心ELISA过程，能够大大提高检测的灵敏度。
因此，本发明试剂盒和检测方法特别很适于快速筛查B型钠尿肽，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1 为检测BNP不同浓度与OD值的关系示意图；
图2 为双抗夹心免疫荧光ELISA标准曲线示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1  定量检测B型钠尿肽的试剂盒
一、免疫磁珠的制备及捕获B型钠尿肽检测
1、纳米免疫磁珠的制备
（1）抗体的制备与纯化：以B型钠尿肽多肽段aar6-18，aar10-22和aar11-26混合免疫免疫6周龄健康BALB/c雌性小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗B型钠尿肽的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化；同样的免疫抗原免疫新西兰大白兔，所得抗B型钠尿肽血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，所得多克隆抗体保存于-80度待用。
（2）纳米磁珠与抗体的偶联：采用活泼酯的方法，将链霉亲和素与180nm磁珠偶联获得链霉亲和素磁珠，采用生物素化抗体与链霉亲和素磁珠连接制成链霉亲和素免疫磁珠。取10mg磁珠依次用无水乙醇，依次用1mol/L NaOH，1mol/L HCl各洗涤1次，用PB缓冲液(0.02mol/L，pH4.0)洗5次，MES缓冲液(0.05mol/L，pH6.0)重悬。依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHSS） 0.4mg，二氯乙烷（EDC）0.35mg，置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h。将每mg活化磁珠与200μg链霉亲和素偶联；获得的链霉亲和素磁珠，按每mg磁珠加入80 mg生物素化多克隆抗体置于混匀仪上37℃偶联30min。磁力架回收磁珠，PB洗涤3次，10mLPBS(含0.05g/100mL NaN3，0.5g/100mL BSA，pH7.4)重悬免疫磁珠并于4℃冰箱保存备用。
二、免疫荧光ELISA试剂盒的制备
1、以多肽合成的B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫BALB/c雌性6周龄健康小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选单克隆抗体细胞株，进而将抗B型钠尿肽的特异性抗体细胞株增殖培养，注射到小鼠体内制备腹水，所得腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法进行抗体纯化所得单克隆抗体保存于-80度待用；
2、单克隆抗体的筛选：筛选得到5株单克隆细胞株，经ELISA相加试验检测得出单克隆抗体2C10与8A3为配对抗体，其相加指数AI=95.8%，两株抗体所结合抗原的不同构象表位且距离很远，适合于下一步双抗夹心ELISA试剂盒的制备；一抗选用2C10，酶标二抗选用碱性磷酸酶标记的8A3，所述2C10和8A3其中单抗2C10经检测效价为20.48万，亚型是IgG1,亲和力常数在1×1010 L/mol，特异性良好；单抗8A3效价为40.96万，亚型是IgG2a,亲和力常数在1×1010 L/mol，特异性良好，并且单抗2C10与8A3经相加试验计算相加指数AI=98.6%。
3、抗B型钠尿肽单克隆抗体包被于96孔聚乙烯微孔板内：经方阵滴定实验，包被抗B型钠尿肽单克隆抗体2C10的包被缓冲液为0.01M PBS pH7.2，其包被浓度为2.5μg/mL，放置37℃温箱包被3h，真空抽干备用。
4、碱性磷酸酶标记抗B型钠尿肽另一配对单克隆抗体：运用戊二醛法进行碱性磷酸酶标记单抗8A3，单抗8A3与碱性磷酸酶标记摩尔比例为4:1；
得到的酶标抗体浓度为1.65μg/mL，经方阵实验得到最佳酶标二抗浓度为1.8μg/mL，其稀释液为20%小牛血清，80% 0.01M PB；荧光底物为4-甲基伞酮磷酸盐。
实验例1  免疫磁珠的捕获率测定
对实施例1的免疫磁珠做捕获率测定：
取含有20 pg/mL BNP血样于离心管中，取 60 mg/g 多克隆抗体/磁珠偶联比制备的免疫磁珠0.1 mg于上述离心管，另设对照组。室温下在Dynal-MIX1旋转混合仪上反应 30 min( 10 r/min) 后取下，将离心管***磁力架分离 2 min，吸出上清液。加1 mL PB（-0.02% 吐温 20）洗 涤 2 遍，分离后吸出洗涤液，最后用 1 mL PB重悬磁珠，将上清液、洗涤液、磁珠重悬液及对照组的BNP进行检测。按公式计算其捕获效率( CE) :
CE（%）=（C1-C2-C3）/C1  *100%
C1为对照组BNP总数，C2为上清液BNP总数，C3为洗涤液BNP总数
当免疫磁珠添加量达到0.1mg时，捕获效率大于99%。同时为了保证有效分离，确定在检测中免疫磁珠加入量为0.1mg。
实验例2  模拟血样灵敏度的检测及标准曲线的绘制
将模拟污染BNP血样初始浓度为4608 pg/mL，按2n(n=0，1,2……)倍比稀释（4608 pg/mL，2304 pg/mL，1152 pg/mL，576 pg/mL，288 pg/mL、 144 pg/mL、 72 pg/mL、 36 pg/mL、 18 pg/mL、 9 pg/mL、 4.5 pg/mL、2.25 pg/mL、 1 pg/mL）以及0 pg/mL，进行BNP的测定，各取 1 mL 加到离心管中，各管均加入 0.1mg 自制免疫磁珠，在Dynal-MIX1旋转混合仪上反应 30 min( 10 r/min) 后取下，将离心管***磁力架分离 2 min，PB洗涤2遍，吸出上清液100μL，加样于包被过的96孔酶标板内，45℃温育30min；洗板3遍，加入酶标二抗，45℃温育 20min；洗板3遍，加入荧光底物，45℃  温育 10min；荧光检测仪检测、读数；样品中B型钠尿肽含量与数值成正比，并计算出所测物质的含量，绘制出BNP不同浓度与OD值的关系（如图1）以及标准曲线（如图2）。如图1所示，经过免疫磁珠分离富集反应，及双抗夹心免疫荧光ELISA检测，其检测最低浓度为9 pg/mL，表明本试剂盒检测BNP的灵敏度为9 pg/mL。
实施例2  B型钠尿肽的检测方法
使用实施例1的试剂盒进行B型钠尿肽的检测，步骤如下：
1、取血样1 mL 添加到0.1mg免疫磁珠，在旋转混合仪上室温反应 30 min，结束后放入磁场分离 2 min，取上清100μL为检测样。
2、将提取100μL上清检测样加入包被过的96孔酶标板内，45℃温育30min；洗板3遍，加入酶标二抗，45℃温育 20min；洗板3遍，加入荧光底物，45℃温育 10min；荧光检测仪检测、读数；样品中B型钠尿肽含量与数值成正比，并计算出所测物质的含量。
实验例3  血样检测
在河北省省级4家医院随机抽取279血样进行本试剂盒的检测BNP，同时这279血样进行4家三甲医院医院通常的检测手段进行比对，其方法及特点见表1，结果如表2所示。
表1 实验例3的检测方法及特点
表2  实验例3的检测结果

Claims (10)

1.一种定量检测B型钠尿肽的试剂盒，其特征在于，其包括免疫磁珠和双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠为抗B型钠尿肽的多克隆抗体通过链霉亲和素-生物素偶联纳米磁微粒制备。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体由B型钠尿肽多肽段aar6-18，aar10-22和aar11-26混合免疫兔子得到的抗体混合物。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法为：将B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫新西兰大白兔，所得抗B型钠尿肽血清经硫酸铵沉淀法进行纯化，待用；洗涤磁珠后，依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和二氯乙烷，置于混匀仪上保持磁珠悬浮状态，37℃活化2h；将活化后的磁珠与链霉亲和素偶联，获得的链霉亲和素磁珠，再将其与待用的抗B型钠尿肽血清置于混匀仪上偶联，形成免疫磁珠。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，双抗体夹心荧光免疫ELISA试剂盒的一抗和二抗为通过多肽合成的B型钠尿肽偶联KLH作为抗原免疫BALB/c雌性6周龄健康小鼠，按常规的杂交瘤技术和极限稀释法制备和筛选得到。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一抗的包被缓冲液为0.01mol/L PBS，pH7.2，包被浓度为2.5μg/mL。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗与碱性磷酸酶的摩尔比为4：1。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶标记的酶标二抗的浓度为1.65μg/mL或1.8μg/mL。
9.一种抗B型钠尿肽的检测方法，其特征在于，其选用权利要求1-8任一项所述试剂盒。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，其步骤为：将待测样品加入免疫磁珠中，洗脱得到上清液；取上清液加入包被有一抗的酶标板孔内，45℃温育30min；洗板，加入酶标二抗，45℃温育20min；洗板，加入荧光底物，45℃温育10min；荧光检测仪检测、读数并计算待测样品中的B型钠尿肽含量。
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