CN105019032A - 检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片和检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测***病毒和水泡性口炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片以及检测方法。

背景技术

***(Foot-and-mouth disease,FMD)、水泡性口炎(Vesicular stomatitis,VS)分别是由***病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)引起的哺乳动物的急性、高度接触性传染病，其中，***病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)有3种分型，具体是***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型。***病毒和水泡性口炎病毒都可以感染猪，发病率极高，并能够形成大范围的流行，能引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病。这两种疾病均以猪舌、唇、口腔黏膜、***和蹄冠等处上皮发生水疱为主要症状，因此在临床症状上无法对这两种疾病进行区分，必须通过病原学进行鉴别诊断。

目前，对这两种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长，也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别两种病毒的方法。因此，有必要建立能同时进行两种疫病快速检测的方法，同时对***病毒进行分型检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片和试剂盒。

基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗体、抗原等)固着于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。

本发明检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片，它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1～4所示任意一个或者任意多个基因片段，用于分别检测***病毒O型、***病毒A 型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒。

其中，它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。

本发明检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的试剂盒，它包括前述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10和/或SEQ ID NO：11～12所示引物对，用于扩增***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒。

其中，所述引物对中，上游引物与下游引物的摩尔比为1:1。

其中，所述SEQ ID NO：5、7、9、11所示上游引物标记有荧光染料。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒的基因芯片的用途。

其中，所述基因芯片还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。

本发明还提供了SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10和/或SEQ ID NO：11～12所示引物对以及SEQ ID NO：1～4所示任意一个或者任意多个基因片段所示基因片段在制备检测***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂，SEQ ID NO：1～4所示基因片段为检测探针。

本发明基因芯片和试剂盒可以同时检测***病毒和水泡性口炎病毒，而且能对***病毒进行分型检测，特异性强，灵敏度高耗时短，检测快速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情况临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1芯片矩阵设计

图2水化温度优化

图3封闭液配比优化。1:0.5％BH4Na,25％Ethanol；2:0.25％BH4Na,25％Ethanol；3:0％BH4Na,25％Ethanol；4:0.5％BH4Na,15％Ethanol；5:0.25％BH4Na,15％Ethanol；:0％BH4Na,15％Ethanol；7:0.5％BH4Na,0％Ethanol；8:0.25％BH4Na,0％Ethanol；9:0％BH4Na,0％Ethanol.

图4探针筛选矩阵设计

图5***O型探针筛选

图6***Asia I型探针筛选

图7***A型探针筛选

图8水泡性口炎探针筛选

图9***O型芯片灵敏度。A:10-3；B:10-4；C:10-5；D:10-6.

图10***A型芯片灵敏度。A:10-5；B:10-6；C:10-7；D:10-8.

图11***Asia I型芯片灵敏度。A:10-4；B:10-5；C:10-6；D:10-7.

图12水泡性口炎芯片灵敏度。A:10-5；B:10-6；C:10-7；D:10-8.

图13***O型引物的特异性实验。1：FMDV-O；2:FMDV-A；3:FMDV-Asia I；4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10:Negative control

图14***A型引物的特异性实验。1:FMDV-A；2:FMDV-O；3:FMDV-Asia I；4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10:Negative control

图15***Asia I型引物的特异性实验。:FMDV-Asia I；2:FMDV-O；3:FMDV-A；4:VSV；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10:Negative control

图16水泡性口炎引物的特异性实验。1:VSV；2:FMDV-O；3:FMDV-A；4:FMDV-Asia I；5:SVDV；6:PPV；7:PRRSV；8:CSFV；9:JEV；10:Negative control

图17***O型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司醛基基片；B:北京博奥生物有限公司醛基基片

图18***A型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司醛基基片；B:北京博奥生物有限公司醛基基片

图19***Asia I型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司醛基基片；B:北京博奥生物有限公司醛基基片

图20水泡性口炎不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司醛基基片；B:北京博奥生物有限公司醛基基片

具体实施方式

一、实验材料和仪器

1.1材料试剂： 

1.2主要仪器

1.3实验试剂的配制

引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100μM的引物贮存液，使用时按照1：4(引物贮存液：灭菌超纯水)的体积比将其稀释成20μM的引物使用液；

10g/L琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖凝胶，加入100mL1×TAE电泳缓冲液中，微波炉加热3min，溶解完全后加入10mg/mL的EB 5μL，震荡混匀，倒入胶槽内，待凝固后点样；

营养肉汤培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加入相应比例的去离子水，121℃灭菌20min，备用；

营养琼脂培养基：按照产品说明书，称取所需质量的培养基干粉于三角锥瓶内，加入相应比例的去离子水，121℃灭菌20min，备用。

20×SSC：称取NaCl，175.2g，柠檬酸三钠·2H2O，100.5g，溶解于少量mini-Q超纯水中，用5M HCl调pH至7.0，最后用Mini-Q双蒸水定容到1L；

10×PBS：按mol数/1L含1370mM NaCl，270mM KCl，101mM Na2HPO4，18mM KH2PO4；按g数/1L含NaCl，80g，KCl，2g，Na2HPO4·12H2O，35.8g，KH2PO4，2.7g，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加蒸馏水定容至1L；

10％SDS：称取SDS 100g，溶于900mL Mini-Q水中。

杂交后洗液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2％，若10％SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液。

杂交后洗液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。

实施例1本发明检测方法

1、材料和仪器 

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法 

2.1PCR引物、检测探针的设计与合成

2.1.1引物设计： 

根据NCBI公布的FMDV-O型序列，FMDV-A型序列，FMDV-Asia 1型序列，VSV序列，在充 分比较同源性的基础上，选取保守区用软件Primer Primer 5.0软件设计引物并进行BLAST序列比对初步验证引物特异性。本研究所用引物详见表1，每对引物的上游引的5’端均连接有一个Cy3荧光基团。所有引物由生工生物工程(上海)公司合成。

表1引物序列与目的扩增产物大小

2.1.2探针设计： 

根据2.1.1所设计引物扩增区段，使用Primer Primer 5.0设计软件设计FMDV-O型，FMDV-A型，FMDV-Asia 1型，VSV的特异性探针，每种目的片段设计多条探针，以备筛选。芯片探针序列及修饰方法：每条探针的5’端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。前者的作用是使探针在固相支持物——玻璃片上充分伸展开，后者的作用是与醛基修饰的玻璃片进行缩合反应，以固定在玻片上。使用一段随机序列作为位置质控(Position control,PC)，其5’端连接有一个氨基，3’端连接一个Cy3荧光基团；使用一段随机序列作为杂交质控(Hybrid control,HC)其5’端连接有一个Cy3荧光基团，并使用它的互补序列作为杂交质控探针(Hybrid control-probe,HC-p)其5’端同样通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。检测探针序列具体如表2，质控序列如表3。

表2检测探针序列

表3质控序列

PC(Position Control位置质控)、HC(Hybrid control杂交质控)、HC-p(HC-p本身不发光，只有当HC与HC-p结合后该位点才会发光)(HC-p(Hybrid control-probe杂交质控探针)

2.2标准质粒的构建

病毒基因组RNA的提取及反转录

按照宝生物(大连)有限公司的病毒RNA/DNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA模板。

病毒目的基因的克隆、测序分析

①以反转录的病毒cDNA为模板，分别使用特异性引物进行PCR扩增。

PCR体系

②根据胶回收试剂盒说明书，胶回收FMDV-O/A/Asia I、VSV扩增的PCR产物，40μL Elution Buffer溶解。

③根据pMD 19-T载体连接试剂盒说明书，按照如下体系把胶回收的DNA片段连接于pMD 19-T载体上。

连接体系： 

④将连接产物转化入dH5α感受态细胞中，1)冰上融化感受态细胞；2)加入连接后的质粒，冰上放置40min，42℃水浴90s，置于冰上，备用；3)加800μL无Amp的营养肉汤培养基，37℃摇床震荡培养40min～60min；4)培养液在5000rpm离心3min，弃上清800μL，混匀，取50μL涂含Amp(50μg/mL)的营养琼脂平板，37℃恒温箱倒置培养过夜。

⑤次日，挑取转化的dH5α-pMD19T-FMDV-O&FMDV-A&FMDV-Asia I&VSV单菌落，接入含Amp(50μg/mL)的营养肉汤培养基的试管中，37℃，170rpm震荡培养过夜。

⑥次日，取3mL经上述培养的菌液提取质粒，操作步骤见质粒提取试剂盒说明书。提取质粒DNA用80μL Elution Buffer洗脱，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：100V，25min，上样3μL。

⑦提取质粒利用如前所述的体系、条件进行鉴定，模板体积为1μL，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：100V，25min，上样3μL。

⑧将阳性质粒交由宝生物工程(大连)有限公司测序，并对测序结果进行比对分析。

2.3芯片制备

使用北京博奥点样缓冲液配制点样体系。分别将6μl位置质控(PC，50μM)、杂交质控(HC，50μM)、阴性质控(NC，ddH2O)、检测探针(50μM)与等量2×点样缓冲液混合，按设计方案加入386孔板内。

使用Personal Arrayer^TM16微阵列芯片点样***进行点样。打开电源，并在电脑上打开晶芯Personal Arrayer 16操作软件，待其自检完毕后进入设置界面。首先装载点样针，随后进行位置校正。清洗位置、抽干位置、超声位置、第一片玻片位置、点样板A24孔位置均需要进行校正。对超声清洗槽注入 超纯水至标定位置，放入386孔板，放入待点醛基基片和用于预点样的玻片，控制点样仪内环境湿度为50％-60％(仪器自动控制)。在操作软件中设置点样参数，在玻片设置中OX:11.3，OY:11.3，起始玻片1，点样玻片数和预点样玻片数按实际放入数量设置；在点阵设置中针阵点距X向和Y向均为400μm，针阵点数均为6，样品重复点数为3，阵间间隔X向为1mm，Y向为11.1mm，阵数X向为1，Y向为4，阵列重复选择是，预点样点数为20，预点样间距为500μm；在样品设置中按实际386孔板布局设置，在样品设置的高级选项中，点样停留时间为0.02s，Z轴抬针高度为2mm，Z轴落针深度为2mm，取样时Z轴深度修正为0mm，取样停留时间为1.5s，最多点样点数为40；在清洗设置中清洗、超声、抽干均为1s，重复12轮以上。按芯片点阵设计要求，每个点样体系样品重复3个点(位置质控重复6个点)，点样顺序为PC、HC、样品1(FMDV-O)、样品2(FMDV-A)、样品3(FMDV-Asia I)、样品4(VSV)、NC、PC，形成6×6的点阵，每张芯片点4个点阵，每个点阵可以检测一份样品，如图1。

芯片探针点完后，在点样仪内静置10-30min，然后把点好探针的芯片置于暗湿盒内，37℃水化过夜或放置12h以上，使探针与基片充分结合。水化后进行基因芯片的封闭，封闭需避光进行：将芯片放入清洗液(0.2％SDS)中100rpm缓慢摇动5min，取出放入超纯水中提拉20次，放入封闭液中100rpm缓慢摇动5min，取出放入超纯水中提拉20次，最后800rpm离心10min甩干，使用博奥Luxscan-10K/A芯片扫描仪扫描观察。Luxscan-10K/A芯片扫描仪参数设置：通道：绿光通道；荧光染料：Cy3；Power：95；PMT：600；分辨率：10。

2.3.1水化温度的优化

按前述方法点样完成后，将芯片置于暗湿盒中，分别于56℃烘箱、37℃培养箱、室温(18～24℃)、4℃冰箱中水化过夜，使用清洗液和超纯水清洗(不使用封闭液处理)后进行扫描，观察结果。

结果如图2所示，37℃与室温的环境温度条件下水化的芯片没有明显区别，且两者均效果较好，位置质控的荧光点亮度非常高；而在4℃的环境温度条件下，探针的水化效率明显不高，与醛基基片结合不稳固，在没有进行封闭处理仅仅使用清洗液和超纯水清洗的情况下，位置质控荧光点的亮度偏低，与背景荧光值较为接近，在56℃的环境温度下水化的芯片部分出现了如2A所示的现象，推测是由于刚放入高温高湿的环境中时，较低温度的芯片表面凝结了小水珠，这些小水珠融合了点样点后发生了滑动，造成了点阵的混乱。因此，水化温度控制在18-37℃之间比较好。

2.3.2封闭液配比的优化

按前述实验方法水化完成后分别进行封闭，封闭液的配制方法如下表。

表4封闭液配比优化

结果如图3和表5所示：

表5不同封闭液配比的荧光信号扫描结果

当封闭液中BH₄Na浓度一定，乙醇(Ethanol)的浓度在0％-25％之间变化对洗脱效果并无明显影响(Median值变化不大)；而当乙醇(Ethanol)浓度一定，BH₄Na的浓度在0％-0.5％之间对洗脱效果影响巨大(Median值变化巨大)，可以看到BH₄Na浓度为0.5％时质量质控探针已被几乎完全洗脱，荧光级别与背景相近(Median值接近背景值)。而BH₄Na浓度为0.25％，乙醇浓度为0％时与BH₄Na浓度为0％时的所有点阵荧光信号已超过扫描仪的阈值(Median值恒定为65535)，说明该BH₄Na浓度下的洗脱效果比较低直至无洗脱效果。基于反应原理，其封闭效果应与乙醇和BH₄Na的浓度呈正相关，因此应该在可接受的范围内取这两者的最高值。在本次试验中，可接受的结果(Median值≥1000，SNRm≥2.0)中乙醇和BH₄Na的最高浓度为0.25％BH₄Na，25％乙醇。

可以看出，封闭液中BH₄Na的浓度为0.25％BH4Na、乙醇浓度为25％时，效果较佳。

2.4探针的筛选 

按2.3方法进行基因芯片的点样，探针的布局如图4示，FMDV-O的三条探针为1-3，FMDV-Asia I的五条探针为1-5，FMDV-A的三条探针为1-3，VSV的三条探针为4-6；按2.3所优化的水化和封闭条件进行封闭。封闭完后的芯片使用围栏粘贴工具贴上围栏待用。

利用如2.2所示体系、条件进行病毒阳性质粒的PCR扩增，并按照下表所示配制样品杂交体系。

将该体系置于PCR仪中，在95℃条件下变性5min，立即取出置于冰上，冰浴5min。打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约500～1000μl超纯水。将芯片正面朝上(围栏面朝上，标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μl变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。盖紧杂交盒盖。安装上铝合金封条，置42℃水浴锅中避光杂交3h。

杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液I中，42℃震荡清洗4分钟，再用42℃预热好的洗液II，42℃震荡清洗4分钟，最后用42℃预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片800rpm离心10min以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。

结果如图5～图8以及表6所示：

表6探针筛选荧光信号

可以看出，针对***O型、Asia I型和水泡性口炎，多条探针的亮度不同，说明它们与目的片段结合的能力均不相同，观察能发现荧光点亮度差异较大。而***A型则均只有一条探针点有亮度，说明只有一条探针是可以有效结合的。

由此，本发明有效的探针如下表所示：

表7探针筛选结果

实验结果说明，本发明人结合多年的经验，找到可以有效检测***O型病毒、***A型病毒、***Asia I型病毒、水泡性口炎病毒的探针，而其他探针则检测效果不佳。

2.5PCR制备检测样品 

每种病毒分别按照如下体系和条件扩增：

引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100μM的引物贮存液，使用时按照1：9(引物贮存液：灭菌超纯水)的体积比将其稀释成10μM的引物使用液。

PCR体系和条件： 

成分	单个反应
		2×Premix rTaq	12.5μL
Primer-Sense(20μM)	1μL
		Primer-Antisense(20μM)	1μL
灭菌水	9.5μL
		DNA模版	1μL

PCR体系条件： 

般在PCR扩增中使用30个循环已可以达到较高产物浓度，在临床检测中，可以适当提高循环数至40到50个，以最大化地提高PCR产物浓度。

2.6寡核苷酸检测芯片杂交

PCR体系和条件： 

3、芯片的性能检测

3.1灵敏度研究 

PCR体系：

按表前表所示体系及程序进行PCR，将所构建的五种阳性质粒分别进行十倍梯度稀释用作模板，范围从10^-0～10^-9。PCR结束后使用PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并取肉眼可见与不可见分界处向左向右各两个梯度的PCR产物按2.3方法进行芯片杂交与扫描，五种阳性质粒的浓度如下表。质粒浓度：

实验结果如图9～12以及表7所示：

表7芯片灵敏度荧光信号值

阳性判断标准为Median值≥500，SNRm≥1.5.

可以看出，本芯片检测方法的检测限为：FMDV-O 0.00001180μg/mL，FMDV-A 0.00000184μg/mL，FMDV-Asia I 0.000129μg/mL，VSV 0.00000267μg/mL，灵敏度高。

3.2特异性研究 

PCR体系：

按前表所示体系及程序进行PCR，模版分别为下表所示细菌、病毒中提取的基因组cDNA。

实验结果如图13～16以所示：本实验引物均分别只对目标病毒的cDNA有较好的扩增效果，对其 他病毒的cDNA未有扩增，说明其特异性好。

3.3重复性研究 

在芯片点样制备方法与杂交条件相同的条件下，试验中分别对两个生产厂家、三批芯片进行了点样、杂交。

如图17～20所示，使用了两个厂家(北京博奥生物有限公司醛基基片、上海百傲科技有限公司醛基基片)的醛基基片进行了实验，目标探针均有较强杂交信号，因此能说明芯片的重复性良好。

3.4稳定性研究 

制备芯片在抽真空、低温的条件下，至少能保存四个月，位置质控、阳性质控、样品杂交信号无衰减，证明该芯片稳定性较好。

综上，本发明基因芯片和试剂盒可以有效检测***病毒、水泡性口炎病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims (8)

1.一种检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1～4所示任意一个或者任意多个基因片段，用于检测***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。

3.一种检测***病毒和/或水泡性口炎病毒的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1或2所述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10和/或SEQ ID NO：11～12所示引物对，用于扩增***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中，上游引物与下游引物的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO：5、7、9、11所示上游引物标记有荧光染料。

6.SEQ ID NO：1～4所示任意一个或者任意多个基因片段在制备检测***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒的基因芯片的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括质控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13～14所示。

8.SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10和/或SEQ IDNO：11～12所示引物对以及SEQ ID NO：1～4所示任意一个或者任意多个基因片段所示基因片段在制备检测***病毒O型、***病毒A型、***病毒Asia I型和/或水泡性口炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂，SEQ ID NO：1～4所示基因片段为检测探针。