CN105018617A - 单个基因mRNA甲基化水平检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单个基因mRNA甲基化水平检测方法，包括以下步骤：1)、设计靶基因甲基化区域的荧光定量引物；2)、提取总RNA，用化学断裂法将总RNA片段化为RNA片段；3)、将步骤2)得到的片段化的RNA通过特异性识别m6A的抗体将带有m6A位点的所有mRNA片段沉淀下来，并用琼脂糖磁珠进行收集富集；4)、将步骤3)中抗体富集得到的mRNA片段反转录，用步骤1)的荧光定量PCR引物进行实时荧光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相对表达量，相对表达量的高低就代表了单个基因mRNA甲基化水平高低。

Description

单个基因mRNA甲基化水平检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于单个基因mRNA甲基化水平检测方法及所用引物。
背景技术
RNA甲基化修饰发现于1974年，是一种最常见的转录后水平修饰，大约占全部RNA修饰的三分之二。在真核生物中，最常见的mRNA转录后修饰是发生在碱基A第6位N原子上的甲基化修饰，m6A大约占细胞mRNA全部腺苷含量的0.1％-0.4％，即哺乳动物中平均每一条mRNA含有3-5个6-甲基修饰的腺苷。m6A甲基化位点主要发生在高度保守的RRACH(R＝G,A；H＝A,C,T)序列中，在表观遗传中可能发挥重要的作用，但由于m6A修饰方式并没有破坏碱基之间的配对，故无法通过直接的测序对其进行基因组上的定位，同时由于缺乏有效的检测分析手段，相关的研究一直停滞不前。直到2012年，文献相继报道鉴定出FTO和ALKBH5等是RNA去甲基化的修饰酶类，METTL3、METTL14等是RNA的甲基化酶，这促使RNA甲基化成为一种重要的表观遗传学标记，结合FTO超表达的小鼠被检测到各组织RNA甲基化水平明显升高，且容易发生肥胖，ALKBH5缺失的小鼠生殖器RNA甲基化水平降低，睾丸发育迟缓，***形态异常这些现象，提示mRNA甲基化具有潜在的生物学意义，其分子机制有待进一步研究。不同基因mRNA甲基化水平存在差异，可能影响mRNA剪切、出核转运、稳定性及翻译效率对具体的生物学过程产生作用，因此对单个基因mRNA甲基化水平的测定，可以进一步对其功能进行深入研究。
目前仅有的测定mRNA甲基化的方法是基于特异识别m6A抗体的免疫沉淀的二代测序，但此方法成本高昂且耗时，因此建立价格低廉、简单易操作的单基因甲基化相对水平检测方法非常重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测单基因甲基化水平的方法。发明人通过设计mRNA甲基化特异引物，提取组织RNA并进行片段化，利用甲基化的免疫沉淀及荧光定量PCR等检测手段建立单基因甲基化水平检测平台，为探索mRNA甲基化水平与其生物学功能奠定基础。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种单个基因mRNA甲基化水平检测方法中所用的引物；
靶基因为C/EBPα基因，
引物为：
C/EBPα-P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
C/EBPα-P2 R tcggagcggtgagtttgc。
本发明还同时提供了单个基因mRNA甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
1)、设计靶基因甲基化区域的荧光定量引物：根据NCBI上提供的靶基因mRNA全长序列，在涵盖CDS区结束段及3’UTR区甲基化高度保守的RRACH(R＝G,A；H＝A,C,T)序列区域设计荧光定量PCR引物(为多对荧光定量PCR引物)；
2)、提取总RNA，用化学断裂法将总RNA片段化为RNA片段(100～500nt之间)；
备注说明：可利用RNA变性凝胶电泳检测RNA片段化成功且未降解；RNA变性电泳检测属于常规技术；
3)、将步骤2)得到的片段化的RNA通过特异性识别m6A的抗体将带有m6A位点的所有mRNA片段沉淀下来；并用琼脂糖磁珠进行收集富集；
备注说明：
特异性识别m6A的抗体，即为：Affinity purified anti-m6A rabbit polyclonal antibody(Synaptic Systems,cat.no.202 003)；
洗脱提纯后检测mRNA浓度，Dot Blot方法检测到含m6A的mRNA片段特异性富集(如图3)。
4)、将步骤3)中抗体富集得到的mRNA片段反转录，用步骤1)的荧光定量PCR引物进行实时荧光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相对表达量，相对表达量的高低就代表了单个基因mRNA甲基化水平高低。
作为本发明的单个基因mRNA甲基化水平检测方法的改进：
靶基因为C/EBPα基因，
引物序列如下：
C/EBPα-P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
C/EBPα-P2 R tcggagcggtgagtttgc。
作为本发明的单个基因mRNA甲基化水平检测方法的进一步改进：
步骤2)的化学断裂法中，
RNA片段化体系为：
RNA(1μg/μl)180μl，
片段化缓冲液(10X)20μl；
孵育温度和时间为以下任意一种：
70℃、3min，70℃、5min(较佳)，95℃、3min(较佳)和95℃、5min。
本发明的方法是一种单个基因mRNA甲基化相对水平检测技术，该方法的独特之处在于从生物组织RNA样品中，通过m6A免疫沉淀和荧光定量PCR技术，可以测定单个基因甲基化相对水平。
本发明用带有m6A位点的基因片段mRNA表达量来计算靶基因mRNA甲基化水平。由于目前并不存在直接测定基因甲基化水平的方法，因此本方法可实现单个基因甲基化相对水平检测。
本发明采用甲基化特异性引物进行荧光定量PCR，得到靶基因mRNA甲基化水平表达量，通过与Input比较，计算得到靶基因的甲基化相对水平。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1：不同水浴温度和时间条件下的RNA片段化效果；
图2：凝胶电泳证实C/EBPα引物的有效性；
图3：m6A特异性抗体进行各组mRNA片段化富集(Dot blot检测)；
图4：样品1和样品2的C/EBPα基因mRNA甲基化相对水平；
样品1:21日龄猪的肝脏组织，样品2:180日龄猪的肝脏组织。
具体实施方式
实施例1、
1.总RNA提取：
分别取两组猪肝样品各50～100mg进行以下操作：液氮中研磨后，加1ml Trizol裂解液混匀，加入0.2ml氯仿剧烈振荡15秒，室温下孵育10min后，4℃、15000g离心15min，吸取上层水相(约500μl)转移到新管中，加入500μl异丙醇，颠倒混匀；4℃，15,000g离心10min，弃上清；加入1ml 75％(体积％)乙醇洗涤，4℃,15,000g离心10min，弃上清，待管底RNA沉淀变成无色透明时，加入80μl的DEPC水吹打混匀。
2.RNA片段化：
1)按以下反应体系将步骤1所得的RNA与片段化缓冲液混合，
RNA片段化体系
为获得最佳温度和孵育时间，分别设置70℃*3min，70℃*5min，95℃*3min和95℃*5min四种条件。
该片段化缓冲液(10X)为：800μL RNase-free水，100μL 1M Tris-HCl缓冲液(pH＝7.0)，100μL 1M ZnCl2溶液。
2)反应结束后立即加入20μl浓度为0.5M的EDTA溶液，在冰上迅速冷却以终止反应，剧烈振荡15秒；依次加入550μl预冷的无水乙醇，77μl浓度为3M的醋酸钠溶液，15μl(质量浓度为2％)的糖原溶液。1000g离心1min后于-80℃冰箱沉淀过夜(12小时)。
3)沉淀过夜的RNA于4℃、15000g离心25min后收集沉淀，弃上清，加入1ml 75％(体积％)乙醇洗涤，4℃，15,000g离心10min，弃掉上清，待管底的RNA沉淀变无色透明时，加入50μl的DEPC水，并吹打混匀。
4)变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA片段化效果：电泳条件为恒压60V，电泳30min～1h。以步骤1中提取的总RNA作为对照，结果表明：在70℃*5min和95℃*3min条件下，RNA片段化效果较好，断裂的RNA片段大小在100～500nt之间(图1)，可以用于后续实验。
3.引物设计：
以猪的C/EBPα基因为例，根据在NCBI上提供的该基因mRNA全长序列，在CDS区末尾及3’UTR区的甲基化特异性序列(RRACH)上下游设计多对荧光定量PCR引物，由上海生工生物有限公司合成，引物序列如下：
C/EBPα-P2 F gacacggtgcgtctaagatgag
C/EBPα-P2 R tcggagcggtgagtttgc
用于筛选的扩增体系和扩增程序如下：
引物采用10ul的PCR扩增体系，即：5ul 2xTaq PCR MasterMix(含染料)，0.5μlC/EBPα-P2F，0.5μl C/EBPα-P2R，1μl猪肝cDNA，3μl ddH2O，PCR扩增反应条件，分三段：94℃ 1min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，共30cycle；72℃ 10min。使反应后的样品迅速冷却，点入1％琼脂糖电泳胶，60V约25分钟后凝胶扫描拍照，如图2所示。
4.免疫沉淀
1)、免疫沉淀之前，预留出步骤2中得到的片段化的RNA10μg作为免疫沉淀对照组(Input)。
2)、洗涤免疫磁珠(CaptivA PriMab蛋白A，CPA)：取200μl CPA磁珠于1ml的IP缓冲液(1×)中，洗涤两次。洗涤方法为4℃摇匀2h，5000g离心1min，弃上清；再加入1ml 0.5mg/mlBSA后于4℃摇匀2h，5000g离心1min，弃上清；最后加入1ml的IP缓冲液(1×)，4℃储存备用。
IP缓冲液(5×)：0.5mL 1M Tris-HCl(pH＝7.4)，1.5mL 5M NaCl，0.5ml(10％ vol/vol)的Igepal CA-630(Sigma-Aldrich,cat.no.I8896)，DEPC水定容到10mL。
备注说明：使用前将IP缓冲液(5×)加入4体积倍的DEPC水稀释，得IP缓冲液(1×)。
3)、RNA与抗体共孵育：按以下反应体系进行操作(试验组所用抗体为m6A特异性抗体(Anti-N6-methyladenosine)购自Synaptic Systems；阴性对照组抗体为Polyclonal rabbitantibody(PRA)，购自Santa Cruz)，混合后摇床上4℃摇匀过夜；
免疫沉淀反应体系
备注说明：RNA酶抑制剂为RNasin Plus RNase inhibitor(Promega,cat.no.N2611)，RVC为Ribonucleoside vanadyl complexes(RVC；200Mm；Sigma-Aldrich,cat.no.R3380)。
4)、磁珠与RNA-抗体共孵育：加入100μl洗涤过的磁珠(上述步骤2)所得)，4℃摇匀2h，离心收集磁珠，用1ml RNase-free的IP缓冲液(1×)洗涤磁珠三次，每次摇匀5min，1000g离心1min富集磁珠。
5)、洗脱：将上述步骤4)中富集的磁珠，加入300μl洗脱缓冲液及4.2μl蛋白酶k(20mg/ml，Sigma)。50℃水浴1.5h，5000g离心1min，将上清转移至新管，操作中不得触动磁珠。加入300μl体积比为25:24:1的酚：氯仿：异戊醇，700μl的无水乙醇和5μl质量浓度为2％的糖原，在-80℃冰箱中沉淀过夜，15,000g离心15min收集RNA沉淀，75％乙醇洗涤两遍，在吸水纸上晾干，溶解在20μl的DEPC水中。
备注：洗脱缓冲液：1M Tris-HCl(pH＝7.4)500μl、0.5M EDTA(pH＝8.0)200μl、0.05g的SDS，用DEPC水定容至100ml。
5、m6A Blot
1)分别取步骤1中提取的总RNA、步骤2中经95℃*3min片段化的RNA、步骤4中经m6A抗体沉淀洗脱回收的RNA及PRA抗体沉淀洗脱回收的RNA各200ng，稀释至4μl体积，95℃加热3min变性，迅速置于冰上冷却，各取2μl点样于硝酸纤维素膜上。
2)用UV紫外交联仪(1500*100J/cm2)将mRNA固定到膜上，用1×TBST缓冲液摇床上洗膜5min。
3)以5％(质量％)的脱脂奶粉的TBST溶液作为封闭液，用上述封闭液封闭1-1.5h。然后将膜放于m6A抗体(2.5μg溶于5ml的封闭液)中室温孵育1h，再在TBST缓冲液中洗膜3次*5min；
4)放入羊抗兔二抗(1μl溶于5ml的封闭液)中室温孵育1.5h，TBST缓冲液洗膜3次*5min，使用ECL化学发光检测试剂孵育，成像仪曝光拍照。
结果如图3所示，经m6A抗体免疫沉淀的RNA(m6A-IP)点的颜色最深，未经免疫沉淀的片段化RNA(Input)与总RNA的点颜色相近，而免疫沉淀的阴性对照(PRA-IP)几乎检测不到m6A特异结合。
6、实时荧光相对定量PCR
将免疫沉淀对照组(Input)和免疫沉淀试验组(m6A-IP)的RNA反转录成cDNA，按常规荧光定量PCR步骤操作。以m6A-IP和Input的靶基因Ct差值作为参照，结果分析采用2- △△Ct的方法，其中△△Ct的计算公式如下：△△Ct＝(Ctm6A-IP-CtInput)X1-(Ctm6A-IP-CtInput)X2
X1和X2表示待比较的任意两个样本，通过上述公式计算出X1相对于X2的靶基因甲基化相对水平。
结果如图4所示，得到两个猪肝样本C/EBPα基因m6A相对水平。
本实例选用21日龄(样品1)和180日龄(样品2)的猪肝组织RNA做为样品进行检测，样品2与样品1的C/EBPα基因的甲基化相对水平是1.16。
验证试验1、以实施例1中的猪肝样品，按照目前mRNA甲基化水平的测定法---二代测序方法进行检测，将正常片段化的RNA样品(MeRIP)和等量经免疫共沉淀后的RNA样品分别进行二代测序，利用生物信息学软件比对两种测序结果在同一参考基因区域内的reads数，分析m6A峰分布在基因组上的位置，并对其进行基因注释，找到C/EBPα基因；对参与比较的两个样品m6A峰区域内reads标准化处理，比较两个样本在C/EBPα基因的m6A峰个数及对应读数，得到样品2与样品1的猪的C/EBPα基因的甲基化相对水平为1.1-1.3，与本发明相符，证明本发明的正确性。
验证试验2、不以本实验引物设计方法设计，而是以常规引物设计方法设计引物序列如下：C/EBPα-F：GGTTTCGGGTCGCTGGATCTCTAG
C/EBPα-R：ACGGCCTGACTCCCTCATCTTAGAC
以实施例1中的猪肝样品，其他步骤均同前，结果显示无法在免疫沉淀后的样品中得到有效扩增，无法得到猪的C/EBPα基因的靶基因甲基化相对水平的结果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.单个基因mRNA甲基化水平检测方法中所用的引物，其特征是：
靶基因为C/EBPα基因，
引物为：
C/EBPα-P2F gacacggtgcgtctaagatgag
C/EBPα-P2R tcggagcggtgagtttgc。
2.单个基因mRNA甲基化水平检测方法，其特征是：包括以下步骤：
1)、设计靶基因甲基化区域的荧光定量引物：根据NCBI上提供的靶基因mRNA全长序列，在涵盖CDS区结束段及3’UTR区甲基化高度保守的RRACH序列区域设计荧光定量PCR引物；
2)、提取总RNA，用化学断裂法将总RNA片段化为RNA片段；
3)、将步骤2)得到的片段化的RNA通过特异性识别m6A的抗体将带有m6A位点的所有mRNA片段沉淀下来，并用琼脂糖磁珠进行收集富集；
4)、将步骤3)中抗体富集得到的mRNA片段反转录，用步骤1)的荧光定量PCR引物进行实时荧光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相对表达量，相对表达量的高低就代表了单个基因mRNA甲基化水平高低。
3.根据权利要求2所述的单个基因mRNA甲基化水平检测方法，其特征是：
靶基因为C/EBPα基因，
引物序列如下：
C/EBPα-P2F gacacggtgcgtctaagatgag
C/EBPα-P2R tcggagcggtgagtttgc。
4.根据权利要求2或3所述的单个基因mRNA甲基化水平检测方法，其特征是：
所述步骤2)的化学断裂法中，
RNA片段化体系为：
RNA(1μg/μl)180μl，
片段化缓冲液(10X)20μl；
孵育温度和时间为以下任意一种：
70℃、3min，70℃、5min，95℃、3min和95℃、5min。
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