CN105018440A

CN105018440A - 一种转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用

Info

Publication number: CN105018440A
Application number: CN201410169882.4A
Authority: CN
Inventors: 罗煜; 丁时澄; 瞿旭东
Original assignee: NANJING ABIOCHEM BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Yikelai (Taizhou) Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2034-04-24
Also published as: CN105018440B

Abstract

本发明提供了一种新的转氨酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶及其制备方法，以及该转氨酶在对羰基化合物不对称转氨制备活性手性胺中的应用。本发明的转氨酶来源于分支杆菌(Mycobacterium？vanbaalenii)PYR-1，应用于(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的制备。与其他制备方法相比，本方法催化制备的产物浓度高，对映选择性强，反应条件温和，操作简便，易于放大等优势，因此在西他列汀磷酸盐的生产中具有很好的工业应用前景。

Description

一种转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种转氨酶，含有该酶编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该转氨酶作为催化剂在不对称合成西他列汀中间体中的应用。

背景技术

糖尿病是由于胰岛素分泌改变，导致胰岛素缺乏及作用减弱，或者胰岛素活性降低，或者在两者共同影响下，出现的代谢性疾病，以高血糖为特征，并同时伴有蛋白质、糖及脂肪的代谢紊乱。糖尿病及其并发症对人类健康的危害程度居心血管疾病、肿瘤之后的第三位，成为危害人类健康的重要疾病。国际糖尿病联合会预计，到2030年，患病总人数将超过4.35亿人。而我国已成为世界糖尿病患病率增长速度最快的国家之一，目前约有4000万糖尿病患者，人数仅次于印度，居世界第二位。在糖尿病的四种类型中，II型糖尿病占90％以上，多见于30岁以上的中老年人，病因主要是由于机体对胰岛素不敏感。在临床上治疗II型糖尿病的药物中，磺酰脲类胰岛素分泌促进剂、双胍类胰岛素敏感性增强剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂、非磺酰脲类胰岛素分泌促进剂等虽然降糖作用较为理想，但均有一定的副作用影响患者坚持用药，达不到较好的血糖控制效果。西他列汀磷酸盐(Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批准上市的第一个二肽基酶-IV(DPP-4)抑制剂，用于治疗II型糖尿病，其单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反应少。它主要通过抑制DPP-4对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)的降解以达到治疗的目的，轻度增加GLP-1含量并减弱GLP-1代谢物的拮抗作用，所以在有效发挥降糖作用的同时不会引起因GLP-1含量过高而引起的恶心呕吐等副作用；同时，GIP促进胰岛素分泌具有血糖依赖性，故能大大降低口服降糖药导致的低血糖副作用的发生率。西他列汀磷酸盐由默克公司开发，于2006年8月及10月分别被墨西哥***及美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，目前已经在全世界60多个国家批准使用，2012年销售额已达40.86亿美元，同比增长23％。因此，西他列汀磷酸盐是属于国际最新且附加值极高的“重磅炸弹”。

西他列汀合成中的关键步骤是手性氨基中间体的构建。美国专利US6699871公开了一种西他列汀的合成方法，采用手性源来诱导出手性的α-氨基酸，而后通过重氮化反应产生β-氨基酸来构建所需的手性中心。该路线所需的原料成本相对较高，反应较为麻烦，且产业化过程中工艺过程和产品质量都难以控制。

国际专利WO2004087650公开了默克公司关于西他列汀的合成路线，利用手性钌催化剂对酮进行不对称氢化构建手性醇，然后将手性醇转化成手性胺。该合成方法中，需要用到钌催化的不对称氢化，催化剂价格昂贵，总收率只有52％，工艺中用到高压氢气，立体选择性也不高。

国际专利WO2005003135公开了默克公司开发的西他列汀的合成方法，以S-苯甘氨酰胺作为手性助剂来诱导催化氢化而合成手性胺。该路线需要两次催化氢化，第一次所用的铂催化剂价格昂贵，第二次脱保护时需要用大量的Pd(OH)₂-C催化剂，成本较高，ee值为96％，需要进一步重结晶。

国际专利WO2007050485公开了默克公司关于西他列汀的合成方法，采用了手性铑催化剂对烯胺的不对称氢化来合成手性胺，产率达到84％，ee值94％，但该方法需要用昂贵的铑手性催化剂，去除与回收也较为困难。

美国专利US8293507公开了Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的生物催化剂代替上述工艺中的铑催化剂，转氨化产物ee值达到99％，底物投料100g/L。但是由于底物水溶性差，需要添加高达50％的DMSO助溶，使得产品的后处理损失较大，DMSO的溶剂残余较高，回收困难，成本较高。

中国专利CN102838511公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体的生产方法，采用格式试剂对手性环氧氯丙烷进行亲核取代，而后用氰化物进行取代水解合成β-羟基酸，该方法总收率仅40％，而且由于采用剧毒氰化物，应用受限。

中国专利CN102485718公开了浙江海翔药业关于西他列汀合成的路线，通过采用甲硫氨酸作为手性源进行合成，但是产率仅14％，即使以2,4,5-三氟溴苯计也仅55％。

中国专利CN103014081公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯转化为R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。

发明内容

针对已报道的不对称合成西他列汀及其中间体的反应中产率偏低、立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题，本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性与溶剂耐受性好的转氨酶进行酶催化合成R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，进而进一步合成西他列汀的酶-化学合成方法。还提供了该转氨酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该转氨酶在催化羰基底物不对称转氨合成西他列汀中间体中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种分离的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No：2、4、6、8或10所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有转氨酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质，特别是下文中所提到的那些氨基酸取代。

SEQ ID No：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1，具有转氨酶的功能，是一种新的转氨酶。

SEQ ID No：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从分支杆菌PYR-1中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。

两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得到，优选采用NCBI Blastp和Blastn软件根据默认参数计算得到。

SEQ ID No：2所示的转氨酶和节杆菌来源的ATA117之间的氨基酸序列同一性为52％。本发明中氨基酸序列如SEQ ID No：2所示的转氨酶与已知转氨酶的氨基酸序列的同一性低于70％，具有显著差异性。

蛋白质(b)是在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转氨酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质。其中，所述的“几个”是指2个至小于100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有转氨酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有转氨酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ IDNo：2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行4、10、15、20个氨基酸残基的突变得到SEQ ID No：4、6、8、10所示氨基酸序列的蛋白质，也属于蛋白质(b)；或将SEQ ID No：2、4、6、8、10进行组合，或进行1-20个氨基酸残基的突变，也可获得上述蛋白质(b)，但仍然保持转氨酶活性。

在筛选获得SEQ ID No：2所示野生型转氨酶的基础上，发明人还对野生型酶进行了改造，将活性中心一些位点的氨基酸残基突变为其他的氨基酸残基，以进一步强化该酶的催化性能。所述的活性中心定义为底物结合位点附近大约的球形空间。

优选地，(b)蛋白质是在(a)的氨基酸序列的第56、68、69、72、76、96、129、131、143、157、206、216、222、230、243、276、289、291、295、304位氨基酸残基中的一位或多位经过取代且具有转氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一个特定的实施方案中，SEQ ID No：2所述的氨基酸序列的第72位的亮氨酸取代为半胱氨酸，第76位的缬氨酸取代为丙氨酸，第129位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，以及第291位的丙氨酸取代为甘氨酸所得的SEQ ID No：4所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物具有一定的活性。

在一个特定的实施方案中，SEQ ID No：2所述的氨基酸序列的第69位的组氨酸取代为亮氨酸，第72位的亮氨酸取代为半胱氨酸，第76位的缬氨酸取代为丙氨酸，第129位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第143位的甘氨酸取代为异亮氨酸，第206位的丝氨酸取代为缬氨酸，第216位的苏氨酸取代为异亮氨酸，第230位的脯氨酸取代为丙氨酸，第289位的苏氨酸取代为丙氨酸，以及第291位的丙氨酸取代为甘氨酸所得的SEQ ID No：6所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物的活性有了很大的提高。

在一个特定的实施方案中，SEQ ID No：2所述的氨基酸序列的第56位的谷氨酸取代为丝氨酸，第69位的组氨酸取代为亮氨酸，第72位的亮氨酸取代为半胱氨酸，第76位的缬氨酸取代为丙氨酸，第129位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第143位的甘氨酸取代为异亮氨酸，第206位的丝氨酸取代为缬氨酸，第216位的苏氨酸取代为异亮氨酸，第230位的脯氨酸取代为丙氨酸，第243位的丙氨酸取代为精氨酸，第276位的丝氨酸取代为脯氨酸，第289位的苏氨酸取代为丙氨酸，第291位的丙氨酸取代为甘氨酸，第295位的苏氨酸取代为色氨酸，以及第304位的脯氨酸取代为苏氨酸所得的SEQ ID No：8所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物具有很高的活性，热稳定性也有了很大的提高。

在一个特定的实施方案中，SEQ ID No：2所述的氨基酸序列的第56位的谷氨酸取代为丝氨酸，第68位的甘氨酸取代为酪氨酸，第69位的组氨酸取代为亮氨酸，第72位的亮氨酸取代为半胱氨酸，第76位的缬氨酸取代为丙氨酸，第96位的天冬氨酸取代为丙氨酸，第129位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第131位的天冬酰胺取代为苏氨酸，第143位的甘氨酸取代为异亮氨酸，第157位的酪氨酸取代为苏氨酸，第206位的丝氨酸取代为缬氨酸，第216位的苏氨酸取代为异亮氨酸，第222位的丙氨酸取代为半胱氨酸，第230位的脯氨酸取代为丙氨酸，第243位的丙氨酸取代为精氨酸，第276位的丝氨酸取代为脯氨酸，第289位的苏氨酸取代为丙氨酸，第291位的丙氨酸取代为甘氨酸，第295位的苏氨酸取代为色氨酸，以及第304位的脯氨酸取代为苏氨酸所得的SEQ ID No：10所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物具有很高的活性，热稳定性以及溶剂稳定性都有了很大的提高。

本发明的第二方面提供了一种分离的核酸，其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由SEQ ID No：1、3、5、7或9所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的核酸：

(a)由SEQ ID No：2、4、6、8或10所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有转氨酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质。

SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于分支杆菌PYR-1，其可以从分支杆菌PYR-1基因组中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。

本发明中，SEQ ID No：1、3、5、7、9所示的基因命名为MvAT，全长1014bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1011个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No：2、4、6、8、10所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No：2、4、6、8、10的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQ ID No：1、3、5、7、9。本发明的转氨酶基因的核酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No：2、4、6、8、10所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或***来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQ ID No：1、3、5、7、9的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来获得。

SEQ ID No：1、3、5、7、9的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、***或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQ ID No：1、3、5、7、9的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQID No：1、3、5、7、9所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据例如《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(Current Protocolsin Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗膜后，就可以通过与DNA或RNA分子杂交的探针上的标记来识别该DNA或RNA分子。

本发明的第三方面提供了一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的转氨酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET21a。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21a或其突变体分别用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的转氨酶基因的重组表达质粒pET21a-MvAT表达质粒。

本发明的第四方面提供了一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的转氨酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET21a-MvAT转化至E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coliBL21(DE3)/pET21a-MvAT。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热激法等，较佳地选择热激法进行转化即可，热激条件较佳地是：45℃，热击90秒。

本发明的第五方面提供了一种重组转氨酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组转氨酶。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的转氨酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的转氨酶即可。培养转化体的其他具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵生产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coliBL21(DE3)/pET21a-MvAT)接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L(更佳地是0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃(更佳地是35℃)，即可高效表达本发明所述重组转氨酶。

本发明中催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺的催化剂，可以是上述产生的重组转氨酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体细胞得到的提取物，通过对提取物中的转氨酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或通过固定化转化体细胞及其提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品。

本发明的第六方面提供了一种本发明所述的蛋白质在催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成手性胺中的应用。

上述应用中，所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的蛋白质优选本发明所述的转氨酶或者重组转氨酶。所述的前手性羰基化合物较佳地为3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯类化合物，即是式I所示的化合物：

其中，

R为烷基或苄基。

较佳地，

R为碳链长度为1～8的烷基或苄基。

更佳地，

R为-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH₃、-C(CH₃)₃或-CH₂C₆H₅。

最佳地，R为-CH₃，即式I是3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

本发明所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述步骤：在pH7.0～10.0的乙醇水溶液中，在异丙胺和磷酸吡哆醛(PLP)的存在下，在本发明所述的转氨酶或重组转氨酶的催化下，前手性羰基化合物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。

其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为1～800mmol/L。本发明的转氨酶用量为催化有效量，较佳地为0.1～50g/L。异丙胺的用量较佳地为1～60g/L。额外加入的PLP的用量较佳地为0～1.0mmol/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在7.0～10.0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的乙醇浓度较佳地为5％～50％。所述的不对称转氨反应较佳地是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称转氨反应的温度较佳地为20～55℃。所述的不对称转氨反应的时间较佳地以反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间为准。不对称转氨反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性胺产物。

本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加PLP辅酶。如果用静息细胞做催化剂则不需要加PLP辅酶，只需利用细胞内所含有的PLP辅酶即可。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：针对已报道的不对称合成西他列汀及其中间体的反应中产率偏低、立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题，提供了提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性与溶剂耐受性好的新的转氨酶进行酶催化合成R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的方法。在催化浓度高达0.8mol/L(200g/L)底物时，产物的光学纯度仍高达99％以上。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，产物光学纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1分枝杆菌PYR-1转氨酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2分枝杆菌PYR-1转氨酶重组表达转化体的菌落PCR图。M为分子量标准，A泳道为E.coli DH5α/pET21a–MvAT，B泳道为E.coli BL21(DE3)/pET21a–MvAT。

图3重组表达的分枝杆菌PYR-1转氨酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

M为分子量标准，A泳道为诱导前，B泳道为诱导后。

图4转氨酶突变体文库1的琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量标准，A泳道为定点突变得到的PCR片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。B泳道为突变片段使用基因克隆引物再次PCR的产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图5转氨酶突变体文库2的琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量标准，A泳道为定点突变得到的PCR片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。B泳道为突变片段使用基因克隆引物再次PCR的产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中的材料来源为：

分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的基因组DNA由美国阿拉巴马州立大学的口腔医学院的Hui Wu博士提供。

表达质粒pET21a，E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCRMasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

实施例1分支杆菌PYR-1转氨酶基因的克隆

根据Genbank收录的预测为分支杆菌PYR-1转氨酶的基因序列(NCBI登录号：YP_955297.1)为依据，设计PCR引物如表1中基因克隆上游与下游引物。其中，上游引物下划线部分为NdeⅠ酶切位点，下游引物下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。

以分支杆菌PYR-1基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：10×KOD-Plus PCR buffer2μL，25mM MgSO₄1.2μL，2mM dNTP2μL，KOD-PlusPCR高保真酶0.3μL，DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH₂O13μL，以表1中基因克隆上游引物与基因克隆下游引物(SEQ ID No：11和12)各0.5μL(10mmol/L)进行PCR扩增。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收900～1200bp区间的目标条带(见图1)，获得一条完整的分支杆菌PYR-1转氨酶全长基因序列，经DNA测序，全长1014bp，命名为MvAT，其核苷酸序列与编码的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No：1和2所示。

表1PCR引物表

实施例2重组表达载体的构建

将实施例1中所得的转氨酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和EcoRI酶切后的质粒pET21a，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET21a-MvAT。

实施例3重组表达转化体的制备

将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，转化条件45℃，热击90秒，在含有氨苄青霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(见图2中的A泳道)。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体E.coli BL21(DE3)/pET21a–MvAT，菌落PCR验证阳性克隆(见图2中的B泳道)。

实施例4重组转氨酶的表达

将实施例3所得的重组E.coli BL21(DE3)，接种至含氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，35℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH8.5的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组转氨酶的粗酶液。用Bradford法测定蛋白浓度。粗酶液与沉淀一起经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图3)，重组蛋白以部分可溶的形式存在。将粗酶液用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。

实施例5重组转氨酶催化羰基底物的不对称转氨

在50ml磷酸钠-异丙胺缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中加入实施例4制备的MvAT的粗酶液至最终蛋白浓度为10g/L，加入终浓度为10mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，加入2.5ml乙醇，在20℃用注射器针头***底部进行氮气吹扫反应。反应至48小时后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和转氨产物的ee值。未发现有转氨产物生成。

转化率测定方法为：反应液用乙腈稀释100倍，离心后取20μL在Agilent1200HPLC上分析转化率，分析柱为Agilent Eclipse XAD-C18反相硅胶柱，流动相为水：乙腈＝40:60，另补加10mmol/L甲酸铵，流速为每分钟1mL，检测波长为210nm和260nm，转氨产物的保留时间为4.6min，底物的保留时间为7.4min。

转氨产物的ee值测定方法为：在Agilent1200HPLC上检测产物的光学纯度e.e值，采用Daicel Chiralpak AD-H手性色谱柱(4.6×150mm)进行分析，流动相为乙醇:正庚烷:二乙胺:水＝60:40:0.1:0.1，流速为每分钟1mL，柱温为35℃，保留时间分别为：底物5.6min，(S)-产物：7.9min；(R)-产物：9.7min。检测波长为210nm和260nm。

实施例6转氨酶突变文库1的构建

以实施例3中所构建质粒pET21a-MvAT为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：10×KOD-Plus PCR buffer2μL，25mM MgSO₄1.2μL，2mM dNTP2μL，KOD-Plus PCR高保真酶0.3μL，DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH₂O13μL，分别以表1中基因克隆上游引物(SEQ ID No：11)与L72+V76下游引物(SEQ ID No：14)、L72+V76上游引物(SEQ ID No：13)与F129下游引物(SEQ ID No：16)、F129上游引物(SEQ ID No：15)与A291下游引物(SEQID No：18)、A291上游引物(SEQ ID No：17)与基因克隆下游引物(SEQ ID No：12)各0.5μL(10mmol/L)进行PCR扩增。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收250、150、500、180左右目标条带(见图4中的A泳道)。以这些PCR产物为模板，按实施例1进行PCR扩增并回收1100bp左右的PCR产物(见图4中的B泳道)，按实施例2构建质粒后，按实施例3转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞即得转氨酶突变文库1(L72FSCVAG/V76CSAG/F129LMV/A291AG)。

实施例7转氨酶突变文库的筛选

从突变文库选取突变菌落，接种至微量滴定板的200μL2×YT培养基(含有100μg/m L的氨苄青霉素)中，37℃培养24小时。取100μL上述培养物接种至含500μL表达培养基(2×YT，100μg/ml氨苄青霉素，1mM IPTG)的深孔板中，25℃培养24小时。3500rpm进行离心15分钟，加入400μL裂解缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH7.5，含1mg/mL溶菌酶)使其重悬浮，反复冻融使细胞破碎。4000rpm离心15分钟，每个孔中取200μL上清到新的微量滴定板。加入反应液(200mM磷酸钠，200mM异丙胺，20mM3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，2mM磷酸吡哆醛，10％～80％(v/v)乙醇，pH7.5～8.5)，20℃～50℃摇床振荡24小时后按实施例5测定转化率。

实施例8筛选突变文库1获得转氨酶突变体1

对实施例6构建的突变文库1按实施例7进行筛选，筛选条件：10％乙醇、pH7.5、20℃，得到一株突变株转化率达11％(突变体1)。对该突变体进行测序，其为L72C/V76A/F129V/A291G突变体，核苷酸序列与氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No：3和4所示。

实施例9转氨酶突变文库2的构建

以实施例3中所构建质粒为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：10×KOD-PlusPCR buffer2μL，25mM MgSO₄1.2μL，2mM dNTP2μL，KOD-Plus PCR高保真酶0.3μL，DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH₂O13μL，分别以表1中基因克隆上游引物(SEQ ID No：11)与H69下游引物(SEQ ID No：20)、H69上游引物(SEQ ID No：19)与G143下游引物(SEQ ID No：22)、G143上游引物(SEQ ID No：21)与S206下游引物(SEQ ID No：24)、S206上游引物(SEQ ID No：23)与T216下游引物(SEQ ID No：26)、T216上游引物(SEQID No：25)与P230下游引物(SEQ ID No：28)、P230上游引物(SEQ ID No：27)与基因克隆下游引物(SEQ ID No：12)各0.5μL(10mmol/L)进行PCR扩增。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收200、200、200、50、80、300左右目标条带(见图5中的A泳道)。以这些PCR产物为模板，按实施例1进行PCR扩增并回收1100bp左右的PCR产物(见图5中的B泳道)，按实施例2构建质粒后，按实施例3转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞即得转氨酶突变文库2(H69FLV/G143ATIV/S206ATIV/T216IV/P230LPAV)。

实施例10筛选突变文库2获得转氨酶突变体2

对实施例9构建的突变文库2按实施例7进行筛选，筛选条件：10％乙醇，pH7.5，20℃，得到一株突变株转化率达99％(突变体2)。对该突变体进行测序，其为H69L/L72C/V76A/F129V/G143I/S206V/T216I/P230A/T289A/A291G突变体，核苷酸序列与氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No：5和6所示。

实施例11随机诱变文库的建立

以转氨酶突变体基因为模板，以基因克隆上游引物与基因克隆下游引物为引物，使用随机诱变试剂盒进行PCR突变。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)68℃延伸1min；步骤(2)～(3)重复25次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。按按实施例2构建质粒后，按实施例3转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞即得转氨酶随机诱变突变文库。

实施例12筛选随机诱变文库获得突变体3

以实施例10所得转氨酶突变体2基因为模板，按实施例11构建随机文库，按实施例7进行筛选，筛选条件：10％乙醇，pH7.5，50℃，得到一株突变株转化率达99％(突变体3)。对该突变体进行测序，其为E56S/H69L/L72C/V76A/F129V/G143I/S206V/T216I/P230A/A243R/S276P/T289A/A291G/T295W/P304T突变体，核苷酸序列与氨基酸序列分别如序列表中SEQ IDNo：7和8所示。

实施例13筛选随机诱变文库获得突变体4

以实施例12所得转氨酶突变体3基因为模板，按实施例11构建随机文库，按实施例7进行筛选，筛选条件：50％乙醇，pH8.5，50℃，得到一株突变株转化率达99％(突变体4)。对该突变体进行测序，其为E56S/G68Y/H69L/L72C/V76A/D96A/F129V/N131T/G143I/Y157T/S206V/T216I/A222C/P230A/A243R/S276P/T289A/A291G/T295W/P304T突变体，核苷酸序列与氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No：9和10所示。

实施例14重组转氨酶及其突变体催化羰基底物的不对称转氨

在50ml磷酸钠-异丙胺缓冲液(100mmol/L，pH7.0～8.5)中加入根据实施例4制备的MvAT或其突变体的粗酶液至最终蛋白浓度为10g/L，加入终浓度为10mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，加入2.5～50ml乙醇，在20～50℃用注射器针头***底部进行氮气吹扫反应。反应至48小时后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后按实施例5测定底物转化率和转氨产物的ee值。结果见表2。

表2MvAT及其突变体催化底物不对称转氨反应的结果

MvAT酶

SEQ ID NO

pH

反应温度(％)

乙醇浓度(％)

转化率(％)

ee值(％)

野生型	2	7.5	25	5	<0.1	未测
							突变体1	4	7.5	25	5	16	99
突变体2	6	7.5	25	5	99	99
							突变体2	6	7.5	50	5	7	99
突变体3	8	7.5	50	5	99	99
							突变体3	8	8.5	50	50	13	99
突变体4	10	8.5	50	50	99	99

实施例15转氨酶突变体4催化羰基化合物的不对称转氨

在50ml磷酸钠-异丙胺缓冲液(100mmol/L，pH8.5)中加入根据实施例4制备的转氨酶突变体4的粗酶液至最终蛋白浓度为10g/L，加入终浓度为100mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸酯底物以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，加入50mL乙醇，在50℃用注射器针头***底部进行氮气吹扫反应。反应过程中测定转化率至99％或反应24小时后停止反应。反应结束后用100mL乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后按实施例5测定底物转化率和转氨产物的ee值。结果见表3。

表3转氨酶突变体4催化羰基化合物不对称转氨反应的结果

实施例16转氨酶突变体4催化甲酯底物的不对称转氨

在100mL磷酸钠-异丙胺缓冲液(100mmol/L，pH8.5)中加入根据实施例4制备的转氨酶突变体4的粗酶液至最终蛋白浓度为10g/L，加入终浓度为800mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(19.7g)以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，加入100mL乙醇，在50℃用注射器针头***底部进行氮气吹扫反应。反应过程中测定转化率至99％后停止反应。反应结束后80℃旋转蒸发除去乙醇，过滤除去蛋白质，调pH为11.0，用100mL乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后旋转蒸发除去溶剂，减压蒸馏获得18.1g(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，收率92％，产物的ee值为99％。

实施例17转氨产物的Boc保护

称取12.3克实施例16所得的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(0.05mol)，溶解于50mL水和50mL四氢呋喃的溶液中，加入4g NaOH(0.10mol)，冰浴下加入12.0g(Boc)₂O(0.055mol)，升至室温反应12小时。加入碳酸钠调节pH为12，用50mL二氯甲烷萃取，舍弃有机相，水相用1N盐酸调节pH为2，50mL二氯甲烷萃取合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，甲醇重结晶，得14.8g白色固体，产率89％。

实施例18Boc保护的转氨产物合成Boc保护的西他列汀

称取3.32g实施例17中得到的产物(0.01mol)和2.28g三氟甲基三氮唑并哌嗪盐酸盐(0.01mol)至20mL二氯甲烷中，冰盐浴下加入1.62g1-羟基苯并三氮唑(0.012mol)与2.29g1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰亚胺盐酸盐(0.012mol)，滴加3g三乙胺(0.03mol)，搅拌下室温反应24小时，反应液用20mL水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂得4.72g固体，产率93％。

实施例19Boc保护的西他列汀的脱保护

称取5.07g实施例18中得到的Boc保护的西他列汀(0.01mol)至50mL甲醇中，加入50mL浓盐酸:甲醇＝1:5的溶液，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去甲醇，用Na₂CO₃中和，用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，除溶剂得油状物。加入60mL乙醇与10mL水，加热到80℃，加入1.5g浓磷酸，搅拌2小时降至室温搅拌12小时，析出4.39g固体即西他列汀磷酸盐，产率87％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No：2、4、6、8或10所示氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中(b)的蛋白质是在(a)的氨基酸序列的第56、68、69、72、76、96、129、131、143、157、206、216、222、230、243、276、289、291、295、304位氨基酸残基中的一个或多个位点经过取代且具有转氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其中(b)的蛋白质是在SEQ ID No：2所示氨基酸序列的第56、68、69、72、76、96、129、131、143、157、206、216、222、230、243、276、289、291、295、304位氨基酸残基中的一个或多个位点经过取代且具有转氨酶活性的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述在SEQ ID No：2所示氨基酸序列的第56、68、69、72、76、96、129、131、143、157、206、216、222、230、243、276、289、291、295、304位氨基酸残基的取代分别为第56位的谷氨酸取代为丝氨酸、第68位的甘氨酸取代为酪氨酸、第69位的组氨酸取代为亮氨酸、第72位的亮氨酸取代为半胱氨酸、第76位的缬氨酸取代为丙氨酸、第96位的天冬氨酸取代为丙氨酸、第129位的苯丙氨酸取代为缬氨酸、第131位的天冬酰胺取代为苏氨酸、第143位的甘氨酸取代为异亮氨酸、第157位的酪氨酸取代为苏氨酸、第206位的丝氨酸取代为缬氨酸、第216位的苏氨酸取代为异亮氨酸、第222位的丙氨酸取代为半胱氨酸、第230位的脯氨酸取代为丙氨酸、第243位的丙氨酸取代为精氨酸、第276位的丝氨酸取代为脯氨酸、第289位的苏氨酸取代为丙氨酸、第291位的丙氨酸取代为甘氨酸、第295位的苏氨酸取代为色氨酸、第304位的脯氨酸取代为苏氨酸。

5.一种分离的核酸，其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由SEQ ID No：1、3、5、7或9所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的核酸：

(a)由SEQ ID No：2、4、6、8或10所示氨基酸序列组成的蛋白质；

6.一种包含权利要求5所述的核酸的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其是pET21a。

9.一种包含权利要求6-8任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。

10.根据权利要求9的重组表达转化体，其是大肠杆菌。

11.根据权利要求10的重组表达转化体，其是E.coli BL21(DE3)。

12.一种重组转氨酶的制备方法，其包括如下步骤：培养权利要求9-11任一项所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组转氨酶。

13.一种催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺的催化剂，其选自权利要求6-8任一项所述的重组表达转化体的培养物，通过将所述培养物中的培养基离心分离后得到的转化体细胞，或用所述转化体细胞加工的制品；其中，所述加工的制品是由所述转化体细胞得到的提取物，通过对所述提取物中的转氨酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或通过固定化转化体细胞及其提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品。

14.权利要求1-4任一项所述的蛋白质，权利要求12所述的方法得到的重组转氨酶，或权利要求13所述的催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物选自以下化合物：

其中，R为烷基或苄基。

16.根据权利要求15所述的应用，其中R为碳链长度为1～8的烷基或苄基。

17.根据权利要求15所述的应用，其中R为-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH₂CH₃、-C(CH₃)₃或-CH₂C₆H₅。

18.根据权利要求15所述的应用，其中R为-CH₃。

19.根据权利要求15-18任一项所述的应用，其中所述不对称转氨反应在含有异丙胺的pH7.0～10.0的乙醇水溶液中进行，任选地，所述乙醇水溶液中还含有磷酸吡哆醛。

20.根据权利要求19所述的应用，其中，在反应液中所述前手性羰基化合物的浓度为1～800mmol/L，异丙胺的浓度为1～60g/L，磷酸吡哆醛的浓度为0～1.0mmol/L，所述水溶液为共轭酸碱总浓度为0.05～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，乙醇浓度为5％(v/v)～50％(v/v)，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为20～55℃。

21.一种合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的方法，包括使用权利要求1-4任一项所述的蛋白质，权利要求12所述的方法得到的重组转氨酶，或权利要求13所述的催化剂催化3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯进行不对称转氨反应的步骤。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述转氨反应的反应液中含有10～800mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、50～100mmol/L的磷酸钠、50～100mmol/L的异丙胺、0～1mmol/L的磷酸吡哆醛、5％(v/v)～50％(v/v)的乙醇，反应pH为7.5～8.5，反应温度为25～50℃。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述转氨反应由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成的蛋白质催化，反应液中含有800mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、50mmol/L的磷酸钠、50mmol/L的异丙胺、1mmol/L的磷酸吡哆醛、50％(v/v)的乙醇，反应pH为8.5，反应温度为50℃。

24.一种合成西他列汀的方法，包括使用权利要求21-23任一项的方法合成手性氨基中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。