CN105018367A

CN105018367A - 一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌

Info

Publication number: CN105018367A
Application number: CN201410168402.2A
Authority: CN
Inventors: 陈杰; 田黎
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology; Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology; Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: CN105018367B

Abstract

本发明公开一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，为从海洋生境获得海洋芽孢杆菌CT2628菌株(Bacillus？sp.)，经人工诱变育种和培养条件优化，其适宜的人工培养发酵的条件为：以其保藏编号为：CGMCC？No.8921的CT2628菌株，其适宜的发酵培养液的配方为：牛肉膏1-3g，蛋白胨2-3g，酵母粉1-3g，葡萄糖1-3g，NaCl，20-25g，KCl0.3-0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9-2.5g，FePO₄0.01-0.02g，水1000ml，pH7.0-8.0上述为培养液。优点：具有诱导植物抗病、抗盐、抗寒的海洋生境芽孢杆菌及在农业上应用。

Description

一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌

技术领域

本发明属于海洋微生物应用领域，具体的说是由海洋生境获得的芽孢杆菌CT2628菌株(Bacillus sp.)通过人工诱变育种及培养发酵，活菌制剂对栽培植物具有防病、诱导抗寒抗盐的作用。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年3月17日，保藏编号CGMCC No.8921的CT2628菌株。

背景技术

当前，环境保护和食品安全问题得到从中央到地方政府的普遍关注，减少化学农药的使用无论对保护环境，还是对食品的源头农产品的安全，都具有重要的实际意义，生物农药以其毒性低，与环境相容性好的特点，在世界范围受到重视，活菌制剂是生物农药的一大种类，这些有益菌通过定殖在植物体或寄生在害虫体内，发挥抑菌和杀虫等作用。芽孢杆菌是其中最著名的益生菌，作为各种酶的产生菌广泛应用于工业生产；作为饲料添加剂和医药，可抑制常见肠道病原菌，提高动物抗病能力，降低抗生素用量；其无毒、成本低、杀虫、抑菌能力强的特点，也为国内外研发生物农药所关注，是世界产量最大的生物农药，新资源、新用途的发现更是国内外农药领域争夺的对象。

我国是土壤盐渍化严重的国家之一，盐渍化土壤总面积达3460万公顷，相当于耕地的1/3，鉴于人多地少的特点，这些盐渍化土壤仍被人们所利用栽种耐盐作物，同时，早春和晚秋的倒春寒每年也造成农作物巨大损失。目前国内外开发微生物农药由于生防菌都来源于陆地，在含盐量较高的土壤中难以存活、定殖，在盐渍地土传病害的防治效果较差；陆地生防菌由于生境原因，较低的环境温度限制了其发挥作用。近几年受到国内外关注的新资源一海洋微生物，由于其原始生境的低温高盐特性，使其更易在盐渍土壤和低温环境发挥作用，在新农药开发领域显现其生境优势。

发明内容

本发明的目的是提供一株诱导植物抗病、抗盐、抗寒的海洋芽孢杆菌及可能在农业生产的应用，发明充分利用了海洋微生物这一特殊生境的天然资源，野生菌株已通过人工诱变育种，生物学特性和农药活性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有污染，所用原料廉价，生产成本低，开发前景好，容易实现产业化。

本发明的目的是由以下技术方案实现的，为从海洋生境获得海洋芽孢杆菌CT2628菌株(Bacillus sp.)，经人工诱变育种和培养条件优化，其适宜的人工培养发酵的条件为：

1)以其保藏编号为：CGMCC No.8921的CT2628菌株，菌株经培养基优化测试，其适宜的发酵培养液的配方为：牛肉膏1-3g，蛋白胨2-3g，酵母粉1-3g，葡萄糖1-3g，NaCl，20-25g，KCl0.3-0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9-2.5g，FePO₄0.01-0.02g，水1000ml，pH7.0-8.0，上述为培养液，加琼脂16-19g为固体培养基；

2)菌株在上述固体培养基置23℃-28℃温箱培养3-5天，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入步骤1中的培养液培养3天为种子液，再将种子液按1：10接入40-50L上述培养液中，23℃-28℃，转速150rpm，振荡培养3-5天获得发酵物，根据需要可用相同方法扩大到目标培养量。

所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：菌株特性为菌落浊黄色，表面大多有褶，有时光滑，后期在蛋白胨培养基上产生深蓝色素；菌体杆状，革兰氏染色阳性0.6-1.9μm×2.9-5.9μm，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成链状，水解淀粉，明胶、接触酶、VP试验均为阳性，能利用葡萄糖、木糖、***糖产酸，酪氨酸水解阴性，不分解木质素，还原硝酸盐，利用柠檬酸盐。

所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在：经过海洋生境芽孢杆菌CT2628菌株处理，在低温0℃-2℃条件下番茄电解质外渗率和丙二醛含量分别降低了98.66％和63.12％，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了62.47％，62.16％，205.13％，342.11％，在盐害NaCl0.5-0.6％胁迫下，丙二醛降低了72.38％，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了80.47％，89.33％，117.44％，230.53％，CT2628菌株诱导植物抗寒及抗盐效果显著。

所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：CT2628菌株采用常规的对峙培养法和抑菌率统计法筛选获得，靶标菌为在农业生产危害严重的9种植物病原真菌：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae、茄链孢菌Alternaria solani、镰孢霉菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum作为靶标菌进行抑菌测试，对峙培养法抑菌圈26-35mm，抑菌率统计法抑菌率78.00-88.20％，均属于强抑菌活性。

所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋芽孢杆菌菌株在普通耕作土及海滨盐渍土的栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子均可以正常定殖，浸根栽种4-6天后在植物根、茎、叶的最高定植数分别可达6.00×10³、8.30×10³、4.65×10³，定殖群体数可维持15-20天。

所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋生境芽孢杆菌菌株对黄瓜、番茄、辣椒的白粉、早疫、疫霉、灰霉4种病害，预防效果可达77.1％-89.0％，治疗效果59.0％-62.4％，防与治的效果均高于传统的化学农药多菌灵。

本发明的有益效果：具有诱导植物抗病、抗盐、抗寒的海洋生境芽孢杆菌及在农业生产的应用，充分利用了海洋微生物这一特殊生境的天然资源，野生菌株已通过人工诱变育种，生物学特性和农药活性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有污染，所用原料廉价，生产成本低，开发前景好，容易实现产业化。

具体实施方式

本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，本发明的具体技术步骤如下：

实施例1：CT-2628菌株的人工培养及发酵

以保藏编号为：CGMCC No.8921的CT-2628菌株，经培养基优化测试，牛肉膏1-3g，蛋白胨2-3g，酵母粉1-3g，葡萄糖1-3g，NaCl，20-30g，KCl0.3-0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9-2.5g，FePO₄0.01-0.02g，水1000ml，pH7.0-8.0上述为培养液，加琼脂16-19g为固体培养基；

在上述固体培养基上培养，并用常规方法测试其理化特征，菌株特性如下：菌株特性为菌落浊黄色，表面大多有褶，有时光滑，后期在蛋白胨培养基上产生深蓝色素；菌体杆状，革兰氏染色阳性0.6-1.9μm×2.9-5.9μm，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成链状，水解淀粉，明胶、接触酶、VP试验均为阳性，能利用葡萄糖、木糖、***糖产酸，酪氨酸水解阴性，不分解木质素，还原硝酸盐，利用柠檬酸盐。

菌株在上述固体培养基置23℃-28℃温箱培养3-5天，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入步骤1中的培养液培养3天为种子液，再将种子液按1：10接入40-50L上述培养液中，23℃-28℃，转速150rpm，振荡培养3-5天获得发酵物，根据需要可用相同方法扩大到目标培养量；

实施例2：CT-2628菌株对多种植物病原真菌的离体抑菌活性：

发酵液采用常规的对峙培养法、抑菌率统计法，靶标菌为在农业生产危害严重的9种植物病原真菌：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae、茄链孢菌Alternaria solani、镰孢霉菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum进行抑菌测试结果显示如下：

表1CT-2628对植物病原菌抑菌活性

注释：植物病原菌：Po：Pyricularia oryzae； As：A』ternaria salani；

Fo：Fusarium oxysporum： Bc：Botrytis cinerea；

Vd：Verticillium dahliae； Cf：Cladosporium fulvum；

Pc：Phytophthora capsici； Rs：Rhizoctonia solani；

Fg：Fusarium graminearum

测试1，简称T1：对峙培养测试，以抑菌圈大小表示菌株活性，“+”表示抑菌圈为20-25mm“++”表示抑菌圈为26-30mm“+++”表示抑菌圈为30-35mm；

测试2，简称T2：对病原菌的抑制率，抑制率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％

由上表数据可知，CT-2628菌株对9种农业危害严重的病原真菌，具有很好的抑菌效果，在对峙培养法中，除丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum抑菌圈为26-30mm，其它7种都达到30-35mm，抑菌率统计法中，抑菌率78.00-88.20％。即抑菌圈26-35mm，抑菌率78.00-88.20％，均属于强抑菌活性，具有研制新杀菌剂的潜力。

实施例3：在CT-2628菌株在植物活体的定植

所试方法均为植物定植常规测试方法：CT-2628做利福平标记后上述方法培养发酵，番茄苗、黄瓜苗浸入发酵菌液，分别栽入普通耕作土和海滨盐渍土(NaCl含量0.5％)的盆钵，分别在1、3、5、7、10、15天将苗各组织研磨，取样在添加利福的平板培养基上培养观察，并折算成每克检样细菌菌落个数(cfu/g)，结果证明CT-2628菌株无论在普通耕作土还是海滨盐渍土的栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子都可以正常定植，浸根栽种5天后根、茎、叶的最高定植数分别可达6.00×10³、8.30×10³、4.65×10³，处理后15天后，CT-2628在番茄内部仍能维持在一个较好的水平。

表2浸根栽种5天后CT-2628在植物体内定植情况

实施例4：CT-2628菌株对植物活体防治病害作用

常规方法对植物病害做防治和治疗测试，防治先在盆栽植株上喷施菌株CT-2628发酵液，24小时后，喷病原菌孢子悬浮液；治疗相反先接种病原菌，后喷施菌株发酵液，1周后进行病情调查，以喷粉锈宁作为阳性对照，喷清水作为阴性对照，计算防治效果(％)。

上表数据证明，盆栽植物病害的防治，CT-2628对4种栽培植物病害，具有很好的防治效果，其中预防效果最好，防治效率可达77.1％-89.0％，治疗效果稍低59.0％-62.4％，预防与治疗效果均高于传统的化学农药多菌灵。

实施例5：CT-2628菌株对植物诱导抗逆作用

所试方法均为植物植物诱导抗逆常规测试方法：(1)抗寒测试：番茄苗栽入普通耕作土的盆钵，分别置低温(0℃-2℃)培养2天，喷施CT-2628发酵液处理苗与清水(对照CK)进行比较；(2)抗盐测试：番茄苗栽入海滨盐渍土(NaCl含量0.5％-0.6％)的盆钵，培养10天，浇灌CT-2628发酵液处理苗与清水(对照CK)进行比较.分别测试电解质外渗率(REC)，可溶性糖(SS)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，丙二醛(MDA)，脯氨酸(Pro)的含量

表3CT-2628诱导植物抗逆过程番茄防御酶等指标的变化

注：①电解质外渗率(REC)，可溶性糖(SS)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，丙二醛(MDA)，脯氨酸(Pro)，②“-”表示未测，负数表示降低

植物在盐、寒等逆境胁迫条件下受害，脂质过氧化产物(MDA)的含量，对膜损伤程度具有重要的指示作用。电解质外渗率(REC)是细胞质膜是否受到寒害的指标，电导率越高，说明受到的伤害越重。植物细胞的可溶性糖含量与植物的抗寒、抗盐性呈正相关，可溶性糖保护植物原生质体和蛋白质。脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)的积累，通过维持渗透调节，稳定蛋白质，保护细胞膜结构的稳定，因此，这些反应被作为衡量植株抗逆性的重要指标。

植物在逆境条件下，电解质外渗率(REC)和丙二醛(MDA)越低，可溶性糖(SS)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，脯氨酸(Pro)越高，抗逆能力越强，表3显示在0℃-2℃的低温条件下CT2628菌株诱导植物抗寒的效果显著，番茄电解质外渗率和丙二醛含量分别降低了98.66％和63.12％，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了62.47％，62.16％，205.13％，342.11％。在盐害NaCl0.5-0.6％胁迫下，经CT2628菌株处理，丙二醛降低了72.38％，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了80.47％，89.33％，117.44％，230.53％，这些指标的变化间接证明CT2628菌株诱导植物抗逆效果显著。

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动，都在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1.一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，为从海洋生境获得海洋芽孢杆菌CT2628菌株(Bacillus sp.)，经人工诱变育种和培养条件优化，其适宜的人工培养发酵的条件为：

1)以其保藏编号为：CGMCC No.8921的CT2628菌株，菌株经培养基优化测试，其适宜的发酵培养液的配方为：牛肉膏1-3g，蛋白胨2-3g，酵母粉1-3g，葡萄糖1-3g，NaCl，20-25g，KCl0.3-0.5g，MgCl₂·7H₂O1.9-2.5g，FePO₄0.01-0.02g，水1000ml，pH7.0-8.0上述为培养液，加琼脂16-19g为固体培养基；

2.根据权利要求1所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：菌株特性为菌落浊黄色，表面大多有褶，有时光滑，后期在蛋白胨培养基上产生深蓝色素；菌体杆状，革兰氏染色阳性0.6-1.9μm×2.9-5.9μm，无荚膜，周生鞭毛，芽孢中生，聚集成链状，水解淀粉，明胶、接触酶、VP试验均为阳性，能利用葡萄糖、木糖、***糖产酸，酪氨酸水解阴性，不分解木质素，还原硝酸盐，利用柠檬酸盐。

3.根据权利要求1所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在：经过海洋生境芽孢杆菌CT2628菌株处理，在低温0℃-2℃条件下番茄电解质外渗率和丙二醛含量分别降低了98.66％和63.12％，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了62.47％，62.16％，205.13％，342.11％，在盐害NaCl0.5-0.6％胁迫下，丙二醛降低了72.38％，可溶性糖、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、脯氨酸分别提高了80.47％，89.33％，117.44％，230.53％，CT2628菌株诱导植物抗寒及抗盐效果显著。

4.根据权利要求1所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋芽孢杆菌菌株采用常规的对峙培养法和抑菌率统计法筛选获得，靶标菌为在农业生产危害严重的9种植物病原真菌：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae、茄链孢菌Alternaria solani、镰孢霉菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌Phytophthoracapsici、丝核菌Rhizoctonia solani赤霉菌Fusarium graminearum作为靶标菌进行抑菌测试，对峙培养法抑菌圈26-35mm，抑菌率统计法抑菌率78.00-88.20％，均属于强抑菌活性。

5.根据权利要求1所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋芽孢杆菌菌株在普通耕作土及海滨盐渍土的栽种的黄瓜、番茄、辣椒、甘蓝、甜瓜、茄子均可以正常定殖，浸根栽种4-6天后在植物根、茎、叶的最高定植数分别可达6.00×10³、8.30×10³、4.65×10³，定殖群体数可维持15-20天。

6.根据权利要求1所述的一株诱导植物抗病抗逆的海洋生境芽孢杆菌，其特征在于：海洋芽孢杆菌菌株对黄瓜、番茄、辣椒的白粉、早疫、疫霉、灰霉4种病害，预防效果可达77.1％-89.0％，治疗效果59.0％-62.4％，预防与治疗效果均高于传统的化学农药多菌灵。