CN105008052B - 数字微流体***中液滴大小的操纵 - Google Patents

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Abstract

一种液滴操纵仪器(20)包括：至少一个电极阵列(21)，其用于通过电湿润来引起液滴(19)移动；基板(22)，其支承至少一个电极阵列(21)；以及,控制单元(23)，其包括与至少一个电压控件(29)连接的至少一个电极选择器(34)。至少一个电极选择器(34)被实现为单独地选择至少一个电极阵列(21)的每个电极(35)并且向选定电极(35)提供由电压控件(29)控制的电压。控制单元(23)还包括中央处理单元(36)，该中央处理单元(36)用于控制电极选择器(34)和电压控件(29)以单独地选择至少一个电极(35)并且向至少一个选定电极(35)提供单独电压脉冲，该单独电压脉冲选自包括驱动电压、接地电压和停止电压的组群。控制单元(23)能够通过通过基本上同时选择所述电极阵列(21)的两个或更多个随后的驱动电极(35')组而限定覆盖一个电极阵列(21)的多于一个电极(35')的较大体积的液体部分(19')的受引导的移动的路径，并且向这些选定驱动电极(35')中每一个提供沿着所述路径的驱动电压脉冲。控制单元(23)被实现为向与脉冲式驱动电极(35')相邻或相同的两个或更多个电极(35)的组基本上同时提供接地或停止电压脉冲。

Description

数字微流体***中液滴大小的操纵
相关专利申请
本申请为2013年3月4日提交并且在2013年7月11日公开为US 2013/0175169 Al的US 13/784,168对应申请，US 13/784,168以全文引用的方式并入到本文中。US 13/784,168是公开为US 2011/0290647 Al的专利申请US 13/139,647的部分连续申请，专利申请US13/139,647为在2009年12月16日提交的国际申请PCT/EP09/67240的美国国家阶段，国际申请PCT/EP09/67240要求保护美国临时申请61/138,294和瑞士专利申请号CH 01979/08的优先权，美国临时申请61/138,294和瑞士专利申请号CH 01979/08都提交于2008年12月17日；所有这些申请的全部公开以明确引用的方式并入到本文中。
技术领域
本发明涉及在数字微流体***中对液滴大小的操纵。本技术领域大体而言控制和操纵小体积，通常微米或纳米级形式的液体。在通道***中的小液体体积移动是本身已知的，例如受到固定装置中的微泵或者旋转实验室器具中的向心力控制。然而，在数字微流体***中，限定的电压被施加到电极阵列的电极，使得单独液滴通过电湿润而被定址。对于电湿润方法的一般概述，请参看Washizu,IEEE Transactions on Industry Applications,第34卷，号4,1998,和Pollack等人，Lab chip,2002,第2卷,96-101。简言之，电湿润指使用微电极阵列(优选地被包括疏水性表面的电介质层覆盖)来移动液滴的方法。通过向电极阵列的选定电极施加限定的电压，引起在定址电极上方的疏水性表面上存在液滴的表面张力变化。这导致在定址电极上液滴接触角的显著变化，因此液滴的侧向移动。对于这种电湿润程序，已知布置这些电极的两种主要方式：使用具有电极阵列的单个表面来引起液滴移动或者添加第二表面，第二表面与类似电极阵列相对并且设置至少一个接地电极。电湿润技术的主要优点在于仅需要少量液体，例如，单个液滴。因此能在显著更短的时间执行液体处理。而且，液体移动的控制可完全在电子控制之下，导致样品的自动化处理。
背景技术
使用具有电极阵列的单个表面(电极的单平面布置)进行电湿润的液滴操纵装置从美国专利号5,486,337已知。所有电极放置于载体基板的表面上，下放到基板内，或者被不可湿润的表面覆盖。电压源连接到电极。通过向随后的电极施加电压来使小滴移动，因此根据向电极的电压施加顺序来引导液滴在电极上方的移动号。公开了通过静电移液管来进行液滴分配，静电移液管包括邻近管状可湿润主要电极的不可湿润的管，管状可湿润主要电极向样品液体源暴露。环形不可湿润的次要电极沿着不可湿润的管与主要电极在轴向间隔开，通过毛细管作用，样品液体进入到环形不可湿润的次要电极内。沿着不可湿润的管在主要电极与次要电极之间依序施加电压。因此，样品液体的一部分被主要电极静电充电并且然后由连续次要电极以带电液滴形式吸引。
还从US 6,911,132 B2已知具有用于操纵液滴的单侧电极设计的设备，所有导电元件容纳于第一表面上，在第一表面上操纵液滴。额外表面可以平行于第一表面设置以容纳待操纵的液滴。设备允许液滴操纵，诸如将两个液滴合并和混合在一起，将液滴分成两个或更多个液滴，通过从流动形成单独控制的液滴而对连续液体流动进行取样，并且对液滴进行迭代二元或数字混合以获得所希望的混合比例。使用至少三个对准的驱动电极来执行合并，三个对准的驱动电极最初被切断，第一电极和第三电极各在覆盖它的表面顶部上承载液滴。连续地，所有三个电极被启用，从而将两个液滴在第二(中央)电极上朝向彼此抽吸直到它们形成联合两个液滴的单个弯液面。然后，使两个外电极返回到接地状态并且合并的液滴在仍启用的中央电极上浓缩。为了再次拆分合并的液滴，在启用所有三个电极之前，使所有三个电极接地，从而在侧向向外抽吸合并的液滴并且使之在三个电极上传播。因此，收缩弯液面形成于中央电极上并且并且通过启用两个外电极，合并液滴最终分成位于第一电极和第三电极上的两个基本上相等的液滴。还由Washizu 1998公开了合并液滴。液滴的合并和拆分也由Pollack等人在2002公开。
使用带有至少一个接地电极的相对表面的电极阵列对液滴移动进行微米级控制的电湿润装置从US 6,565,727(电极的双平面布置)已知。这种装置的每个表面可以包括多个电极。电极阵列的驱动电极优选地由位于每个单个电极边缘处的突出部布置成彼此相互交错关系(也参看US 6,911,132 B2)。两个相对阵列形成间隙。导向至间隙的电极阵列的表面优选地被电绝缘疏水层覆盖。液滴定位于间隙中并且通过向定位于该间隙的相对位点上的多个电极连续地施加多个电场而在单极填料流体内移动。由控制衬垫的疏水性表面限定的较大面积的滴量计经由小延伸部连接到驱动电极的路径或驱动道，第一个是截止电极并且第二个是控制电极。湿润电位首先施加到截止电极，覆盖控制衬垫的表面的液体因此在截止电极和驱动电极上传播。因此，从截止电极移除湿润电位，使得截止电极再次成为疏水性的。液体的部分移动回到接触衬垫，并且被非极性填充流体替换。因此，隔离的液滴被分开并且形成于控制电极上。
在处理生物样品的情形下操纵液滴的这种电湿润装置的使用从美国专利申请号2007/0217956 Al已知。在这里建议例如通过热循环在印刷电路板上扩增核酸。通过在参考电极与一个或多个驱动电极之间施加电势而在电极阵列上运输小滴。样品放置于印刷电路板上的储集器内，并且小滴在印刷电路板上分配号。
带有聚合物薄膜用于操纵聚合物薄膜上的液滴中的样品的容器从WO 2010/069977 Al已知。聚合物薄膜放置于液滴操纵仪器上，液滴操纵仪器包括电极阵列并且保持离容器底侧一定距离，因此形成间隙，在间隙中发生对液滴中样品的操纵。通过施加到随后驱动电极的驱动电压脉冲来执行液滴与覆盖若干电极的液体部分的分离，将分离的液滴远离液体部分引导。
从WO 2010/040227 Al已知一种混合数字和通道微流体装置，其呈整合结构的形式，其中，液滴可以由数字微流体阵列运输并且转移到微流体通道。还公开了通过使两个单独液滴在两个分离驱动道上移动并且然后使这些电极路径联合来合并两个单独液滴。
在WO 2011/002957 A2中公开了一种通过使用放置于电极阵列上的电介质层来分配液滴的电极配置，电极阵列具有不同介电常数的部分。其中关于数字微流体***中的液滴操纵，应当指出的是，在某些电极处的介电常数(k)越高，执行液滴操作所需的电湿润电压越低，并且相反，在某些电极处的介电常数(k)越低，执行液滴操作所需的电湿润电压就越高。根据这个基本原理，“较高”电压施加到储集器电极和分配电极以利用样品液体湿润两个电极。在储集器电极与分配电极之间的区域中将电压减小到“较低”值将分离在分配电极上的液体的一部分。因为介电常数与所选材料的厚度成反比，改变电介质层区域的厚度可以用来限定具有不同介电常数的部分。还公开了组合相等厚度的低k和高k电介质区段。此外，也公开了需要“较高”电压的结构障碍和与低k和高k电介质区域的组合。
发明目的和概要
本发明的第一目的在于提出一种替代装置，其允许简化对微型化形式液滴的操纵。根据第一方面，通过本文所描述和公开的液滴操纵仪器实现了根据第一方面的这个目的。
本发明的第二目的在于提出一种装置，其允许以简单、自动并且快速的方式完全整合处置生物样品，处置始于提供用于分析样品生物材料的样品到装置内并且结束于实现了最终分析的处理。根据第二方面，通过本文所描述和所公开的生物样品处理***来实现根据第二方面的这个目的。
本发明的第三目的在于提出使用数字微流体样品处理***来处理生物样品的替代方法。使用如本文所描述和公开的生物样品处理***来处理生物样品的方法实现了根据第三方面的这个目的。
从附属权利要求得到根据本发明的额外优选特点。本发明的优点包括：
·该***提供一种多部件装置，被调整用于全自动处理生物样品直到分析。
·这种完全整合的***能直接接纳大体积样品(例如，呈液体形式或者在诸如口腔拭子的固体表面上)并且利用纳米级体积进行处理；所有这些都无需使用者互动。
·一次性与非一次性部件之间的区别允许以标准化并且具有成本效益的方式来进行自动化处理。
·本发明的特点在于能从较大开始体积来操纵较小等份试剂。这允许较大、任意流体量引入到盒(由使用者或仪器)而无需高精度。这还允许装置由较大范围的使用者使用，包括不能添加精确体积的使用者，和/或使得更加廉价。
附图简介
将根据示例性实施例和示意图更详细地解释本发明。然而，这些解释说明将不限制本发明的范围。而且，在附图中示出的相对尺寸可以显著不同，因为这些元件未必按照比例绘制。在附图中示出了：
图1是根据本发明的第一方面的生物样品处理***的示意截面和部分布局；
图2是根据本发明的生物样品处理***的容器和薄膜的顶视图，其中：
图2A示出了用于定位朝向容器的外边沿布置的生物样品的至少一个井状结构；以及
图2B示出了用来定位要布置于容器中央的生物样品的至少一个井状结构；
图3是优选电极阵列的不同实施例的顶视图，其中：
图3A每个电极实现为矩形形式；
图3B每个电极实现为六边形形式；
图3C每个电极实现为圆形形式；以及
图3D每个电极实现为三角形形式。
图4是根据第一优选实施例并且类似于图3A具有矩形电极的阵列的网格状电极阵列的顶视图，其中：
图4A：较大体积的液体部分覆盖相同电极阵列的大约18个脉冲式驱动电极；
图4B：具有与先前脉冲式驱动电极相同的一组两个电极被提供接地电压脉冲；
图4C：具有与先前脉冲式驱动电极相同的一组三个电极被提供接地电压脉冲；
图5是根据第二优选实施例并且类似于图3A的具有矩形电极的阵列的网格状电极阵列的顶视图，其中：
图5A：较大体积的液体部分覆盖相同电极阵列的大约6个脉冲式驱动电极；
图5B相同电极阵列的额外驱动电极被启用使得液体部分现覆盖大约7个驱动电极；
图5C：与图5B启用额外驱动电极的方向相反，启用另一驱动电极并且与先前脉冲式驱动电极相同的一组两个电极被提供接地电压脉冲；
图6是根据第三优选实施例并且与图3A的阵列相似的网格状电极阵列的顶视图，其具有矩形电极和与该阵列相邻的电极路径，其中：
图6A：较大体积的液体部分覆盖电极阵列的大约10个脉冲式驱动电极；
图6B：电极路径的前两个相邻驱动电极被启用，并且禁用先前启用的12个电极；
图6C：启用电极路径的第三驱动电极，禁用前两个相邻驱动电极，并且启用电极阵列的一组9个电极，其余液体部分现覆盖电极阵列的大约9个电极；
图6D：启用电极路径的第四驱动电极，禁用第二驱动电极和第三驱动电极，并且启用电极路径的第一驱动电极以及电极阵列的相邻9个电极，禁用电极阵列的三个电极；
图6E：启用电极路径的第五驱动电极，禁用第四驱动电极，并且启用电极路径的前三个驱动电极，禁用电极阵列的所有电极；
图6F：启用电极路径的第五驱动电极并且禁用第四驱动电极，启用电极路径的第三驱动电极以及该阵列的6个电极，禁用电极路径的前两个驱动电极以及该阵列的6个电极，其余液体部分现覆盖电极阵列的大约8个电极。
具体实施方式
图1示出了根据本发明的第一方面的示例性生物样品处理***1的示意截面和部分布局图。为了允许以自动化并且具有成本效益的方式来处理生物样品，这个***1包括可以以简单的步骤组装成一个单元(***1)的不同的单独部件。这个部件可以例如是容器2，容器2由生物样品处理***1包括。容器2实现了处理较大体积的液体18。在本发明的情形下，较大体积的液体被理解为涉及多达5ml至多达10ml的液体体积，取决于待处置的样品。例如，在使用口腔拭子的情况下，较大体积的井状结构优选地被设计成保持多达2ml的体积；如果保持例如全血，井状结构优选地保持至多5ml。容器2具有顶侧2和底侧4。在其底侧4，容器2包括突起5。这些突起5可以实现为在底侧4向下延伸的容器2的部分。替代地，这些突起5可以单独地附连到容器2的底侧4上，例如通过胶合、焊接或其它适当手段以将这些突起5稳定地附连到容器2的底侧4上。容器2包括至少一个井状结构6。这至少一个井状结构6在其顶侧7敞开。因此，生物样品9、反应试剂10或者二者可以定位于这个井状结构6内。在其底侧8，至少一个井状结构6具有至少一个开口11。这个开口由容器2的通道12与容器底侧4的容器2孔口13连接。在液体18或液滴19放置于至少一个井状结构6内(具有或不具有反应试剂，和/或具有或不具有生物样品9的至少部分)的情况下，其可以通过通道12从井状结构6转移出来。通道12的直径优选地被选择为使得毛细管力防止液体从孔口13泄漏出来并且液体因此保留在至少一个井状结构6内侧，而无需阀或通道12的任何其它闭合件。通道12的直径优选地在100μm到1mm。
而且，生物样品处理***1包括平坦聚合物薄膜14。这个平坦聚合物薄膜14也可以被称作“塑料表皮”，如由Yang等人(2008)在San Diego,CA的MicroTAS meeting会议上“Exchangeable,pre-loaded“Skin Depot”for digital microfluidics”提出。这个平坦聚合物薄膜14优选地具有下表面15和疏水性上表面16。作为用于薄聚合物薄膜的材料，可以使用食品包装纸和可拉伸的蜡薄膜。当在第一步骤中通过将容器2定位于薄膜14上而将单个部件组装到生物样品处理***1上时，容器2的突起5抵接薄膜14的疏水性上表面16。由此，突起5保持平坦聚合物薄膜6在离容器2的底侧4一定距离“d”处。这个距离“d”由容器2的突起5的高度设置并且当容器2定位于平坦聚合物薄膜14上时限定至少一个间隙17。在薄膜14的上疏水性表面16与容器的底侧4之间的间隙17大小适于容纳液滴。优选地，这个间隙17小于2mm。最优选地，间隙17小于1mm。
生物样品9优选地容纳于井状结构6中。其可以与液体18诸如缓冲溶液混合，具有或不具有裂解试剂。生物样品9可以从至少一个井状结构6(同时仍保持液滴19)通过容器2的通道12移位到平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上。因此将带有生物样品9的液滴19放置于薄膜14与容器2之间的间隙17内。
可以通过施加压力、离心力或者电湿润对抗防止液体从井状结构6、6'泄漏出来的毛细管力来执行移位，无需使用阀。然而，也可以使用其它手段，其适合于将液体8或液滴19从井状结构6移位到平坦薄膜14的疏水性上表面16上。这些移位手段也可以用于将储存在容器2的井状结构6'的反应试剂10转移到薄膜的上表面上。当将液体从井状结构6,6'移位到上聚合物薄膜表面16上时，来自间隙的过量空气可以例如经由空的井状结构排出6'。
为了操纵优选地从容器2的至少一个井状结构6移位到薄膜14的上表面16上的液滴19，生物样品处理***1还包括液滴操纵仪器20。这个仪器20包括：至少一个电极阵列21；基板22，其支承至少一个电极阵列21；以及，控制单元23。液滴操纵仪器20被实现为使得容器2和薄膜14能可逆地附连到仪器20上。由此，薄膜14的下表面15抵接电极阵列21。当以此方式组装时，生物样品处理***1允许液滴19从容器2的至少一个井状结构16移位到平坦聚合物薄膜14的上表面16上并且因此在至少一个电极阵列21上方。电极阵列21被实现为引起液滴19移动。因此，仪器20被实现为通过电湿润来控制所述液滴19在平坦聚合物薄膜14的上表面16上受引导的移动并且在那里处理生物样品9。
可以由生物样品处理***1处理的典型生物样品9是核酸或蛋白质。优选地，核酸用于处理。这些核酸包括单链或双链的DNA(脱氧核糖核酸，例如基因组DNA、cDNA、mtDNA)、RNA(核糖核酸，例如mRNA)，以及其衍生物(例如，人工标记的核酸)。这些生物样品9可以容纳于组织样品中诸如口黏膜细胞或毛囊。同样，生物样品9可以容纳于液体中，诸如体液样品中，诸如血液、尿液、唾液等。相关生物样品9可以由根据本发明的生物样品处理***1进行处理，与其来源无关。特别相关的是例如取自患者(在常规诊断程序中)或者取自犯罪现场(在法医学中)的样品。然而，为了成功处理这些样品，应基于包括生物样品9的材料采取所需反应试剂10的选择。也能将已经纯化的生物样品9加载到容器2的至少一个井状结构6内。在此情况下，纯化步骤并非在生物样品处理***1内处理期间必需的。
优选地，容器2的至少一个井状结构6的大小适于容纳固体基板24，固体基板24承载生物样品9。这个固体基板24可以是组织样品。然而，也可能这种固体基板24是拭子、压舌板、针、注射器、纸张诸如FTA纸张或织物材料诸如布料或适合于承载和/或收集生物样品9的其它基板或者例如包括样品9的组织。最优选地，固体基板24是拭子头，并且因此，容器2的至少一个井状结构6的大小适于容纳拭子头。在图1中示出了容纳拭子头的井状结构6的示例性实施例。用于拭子头的这种井状结构6的典型大小具有约10mm的直径和约40mm的高度。这种拭子头可以例如由棉或聚酯制成，如本领域中通常已知的那样。这些固体样品24可以承载组织样品或者呈液体形式的生物样品9(诸如体液)。
在当前的图1中，容器2被示出包括大小适于容纳拭子头的一个井状结构6和大小不同于样品井状结构6的其它井状结构6'。在另一变型中，如在图2A和图2B中所示，容器2包括至少一个样品井状结构6和六个用于储存反应试剂的更小的井状结构6'。这些井状结构6'优选地大小适于储存反应试剂10和其它所需的液体诸如缓冲剂。用于储存反应试剂10的这种井状结构6'的典型大小具有约5mm的直径和约40mm的高度。然而，可以根据待解决的潜在问题给出的要求来单独地采取容器2的每个井状结构6,6'的大小。同样，可以根据液滴操纵仪器20的设计、生产方法等采取在容器2内的井状结构6,6'的位置。优选地，井状结构6,6'定位于容器2的外部区域中，以提供在容器下方用于移动液滴19和用于处理液滴19内的样品9的中央区域。为了进行处理，反应试剂10滴可以转移到平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上并且在那里与液滴19混合。
具有承载生物样品9的固体基板24的至少一个井状结构6也可以包括反应试剂10。优选地，这种反应试剂10适于从包含它的材料释放生物样品9。裂解试剂将特别适合于这些目的。其可以包括反应缓冲剂和用于酶促打开保持生物样品9的细胞包络的器件。反应试剂10可以呈液体形式定位于井状结构6内。然而，取决于具体应用和可用性，反应试剂可以替代地定位于井状结构6内，例如以冻干形式。这种反应试剂10的形式在购买具有预加载的反应试剂10的容器的情况下是优选的。然而，本领域技术人员的常识认为仅当冻干过程对于试剂10的功能没有影响或具有很小影响时冻干形式的反应试剂是优选的。
在一优选实施例中，生物样品处理***1的容器2包括至少一个井状结构6，井状结构6被实现为储存反应试剂10。在容器2已经包括用于定位生物样品9的一个井状结构6的情况下，这个实施例是特别优选的。因此，在这种情形下，容器包括至少两个井状结构6，一个井状结构6用于定位生物样品9并且一个井状结构6'用于储存反应试剂。储存的试剂10包括选自下列的试剂：用于执行细胞裂解的试剂、用于执行核酸纯化的试剂、用于执行核酸扩增的试剂和用于执行核酸测序的试剂。
在细胞裂解期间，通过打开细胞膜而破坏了细胞完整性。可以例如使用酶促活性或者化学裂解来执行这个步骤。然而，破坏细胞完整性的其它程序可能是合适的。示例性地，由ZyGemTMCorporation(Waikato Inno-vation Park,Ruakura Road,Hamilton,NewZealand)制造的热稳定蛋白酶EA1应在这里提到为用于执行细胞裂解的合适酶。替代地，使用蛋白酶K或者化学裂解来执行细胞裂解，这两种程序都是本领域中已知的。匹配所用酶的缓冲剂可以由本领域技术人员进行选择，而无需做出特殊努力并且被也认为是基于本领域的公知常识。由于执行细胞理解的程序是本领域技术人员熟知的，其将不在这里展开详细描述。
DNA纯化过程也是本领域技术人员熟知的并且将不在这里解释单个程序步骤。在样品混合物包括可能扰乱随后反应的元素的情况下，纯化步骤是优选的。在本申请的情形下，优选地在细胞裂解之后或者在核酸扩增过程诸如聚合酶链式反应或通过合成测序之后需要纯化步骤。优选地，将纯化DNA。通常，用于执行核酸纯化的试剂包括最终改性的珠或粒子，其能直接或间接结合DNA。在DNA结合之后，可以洗掉样品混合物的不当内含物，并且在所希望的液体中溶解DNA。这种珠可以是本领域中熟知的标准磁珠。有利的珠包括从Promega Corporation(2800Woods Hollow Road,Madison,WI 53711USA)提供的DNA IQTM或者从Invitrogen Ltd(European Headquarters:3 Fountain Drive,Inchinnan BusinessPark,Paisley PA4 9RF,UK)提供的磁珠。也可以修改合适珠或粒子。这种修改可以简化并且规定纯化，以及介导特殊标记的DNA的结合。DNA标记可以在扩增程序期间实现。用于聚合酶链式反应的引物的典型标签是生物素；然而，在本发明的情形下，可以使用其它合适标签。合并到应用中的标记引物可以在随后的纯化过程中使用例如链霉亲和素涂布的珠来捕获。然而，可以使用适合纯化扩增的DNA的其它***。例如，在这个第二纯化步骤中也可以使用磁珠。
聚合酶链式反应(PCR)通常用于核酸扩增并且也是本领域中熟知的。简言之，PCR包括三个基本温度特定步骤的循环重复：在优选地98℃分离DNA的双链的核酸变性步骤和允许预选的引物(寡核苷酸)结合到单链上的相应序列的退火步骤，其中这个温度步骤取决于引物序列，并且延长步骤涉及聚合酶，聚合酶在酶特定温度将结合的引物延伸到核酸链。聚合酶优选地是热稳定的，使得其并不受到变性温度影响。本领域中熟知的这种热稳定聚合酶是栖热水生菌的聚合酶(Taq-聚合酶)。然而，也可以使用可购买到的其它热稳定聚合酶。优选模板是基因组DNA或cDNA。使用PCR，可以扩增模板的预选、特定区域，给出关于DNA来源的更多信息。待由PCR分析的优选区域包括线粒体DNA(mtDNA)、典型短串联重复序列(STR)或已知用于例如与具体疾病相关的独特单核苷酸多态性(SNP)。
特异扩增的DNA的测序是用来进一步表征选定的DNA的熟知工具。主要测序原理是本领域中熟知的，通过扩增测序和通过杂交测序。通过扩增测序涉及使用标记的停止-引物的PCR相关的过程，标记的停止-引物随机地终止伸长过程。然后所得到的终端标记的片段用于确定模板的序列。通过杂交测序(SBH)涉及将标记的引物链接到基质。选择引物使得在其序列中部分地重叠。在将目标DNA杂交到所述引物之后，可以通过分析目标所结合的测序引物来确定序列。当通过与生物样品处理***1的杂交步骤来施加测序时，在开始样品处理之前，标记的引物优选地链接到聚合物薄膜14的疏水性上表面16上。最优选地，标记的引物在将***释放到交易之前链接标记的引物。
在这种情况下，上文所提出的两种或更多种，优选地所有方法应使用根据本发明的生物样品处理***1来执行，需要容器2包括多于两个井状结构6,6'。优选地，容器2包括用于定位生物样品9的至少一个井状结构6和用于储存所需反应试剂10的另外的井状结构6'，以及用于一种方法的每种反应试剂10的一个专用井状结构6'。优选地，用于定位生物样品9的井状结构6实现为额外地储存反应试剂10和细胞裂解所需的缓冲剂。因此在保持生物样品9的井状结构6中直接执行细胞裂解。
如果执行上文提到的所有方法，那么容器2包括至少四个井状结构6、6'：用于定位生物样品9和储存用于细胞裂解的反应试剂10的一个井状结构6；用于储存DNA纯化的反应试剂10的一个井状结构6'；用于储存PCR的反应试剂的一个井状结构6'；以及，储存用于测序的反应试剂10的一个井状结构6'。最优选地，容器2包括用于处理生物样品9的至少10个井状结构6,6'：
-至少一个井状结构6用于定位生物样品9，储存反应试剂10和缓冲剂和用于执行细胞裂解；
-至少三个井状结构6'被实现为用于PCR前纯化(每一个用于磁珠、洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂)，
-至少两个井状结构6'用于扩增(一个用于储存酶和缓冲剂，一个用于储存引物，每个待扩增的基因位点一个引物井状结构)，
-至少两个井状结构6'用于PCR后清洁(一个用于储存链霉亲和素涂布珠并且一个用于储存洗涤缓冲剂)，
-至少两个井状结构6'用于储存反应试剂10和用于通过杂交测序的缓冲剂(一个用于储存包括参考探针的缓冲剂并且一个储存包括相关探针的缓冲剂)。
一般而言，井状结构6,6'的数量取决于所用反应***的类型(所需试剂、处理步骤)和所需分析的数量(待分析的序列/基因位点数量，即，STR、SNP、mtDNA)并且可以由本领域技术人员基于本领域中的公知常识来采用。如果用于扩增的引物应储存在容器25中，优选地，容器2包括用于扩增程序的每个待分析基因位点一个引物。因此，在应分析16个基因位点的情况下，容器优选地包括16个用于扩增的引物井状结构6'。在另一优选变型中，扩增步骤所需的引物可以以干燥形式提供于平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上，使得为了储存引物，在容器2中在此处将不需要单独的井状结构6'。在此情况下，使用保持在井状结构6'中的缓冲剂，引物可以再次悬浮于薄膜14上。为了通过杂交步骤进行测序，可同样地采用储存反应试剂10和缓冲剂所需的井状结构6'的数量。
在特别优选的实施例中，生物样品处理***1用于对相关生物样品9执行提取、纯化、扩增和分析。因此，根据第一方面，本发明提供完全整合的***，完全整合的***直接接受大体积样品(呈液体形式或者在诸如口腔拭子的固体表面上)并且利用纳米体积进行处理直到完成分析。
在图2A和图2B中，以顶视图示出了根据本发明的容器2，具有用于定位生物样品9的一个井状结构69和用于储存反应试剂10的六个另外的井状结构6'。
当在用于定位生物样品9的井状结构6内直接执行细胞裂解时，从细胞背景释放生物样品9，并且优选地释放到液体18内，液体18因此是从细胞裂解得到的反应溶液。当定位于容器2的井状结构6内时生物样品9并不包含于一个或多个细胞中的情况下(如果不需要裂解)，可以根据以下程序步骤来选择液体，并且经由井状结构6的顶侧7添加到井状结构6内。在每种情况下，生物样品9应至少部分地包含于用来根据本发明的第一方面使用生物样品处理***1进行进一步处理的液体中。包含生物样品9的至少部分的液体18或液滴然后从井状结构6通过容器2通道12移位到平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上以进行进一步处理。
优选地，通过施加压力、离心力或者通过电湿润，执行移位，无需使用阀或其它可移动手段。所有这些优选移位手段克服防止液体从井状结构6,6'漏出的毛细管力作用。然而，还可以使用其它手段来将液体18或液滴19从井状结构6移位到平坦薄膜14的疏水性上表面16上。
关于进一步处理，容器2和平坦聚合物薄膜14可逆地附连到液滴操纵仪器20上，其中薄膜14的下表面15抵靠电极阵列21。因此，液滴19从电极阵列21上方的井状结构6移位。在这种布置中，液滴19可以以受引导的方式由液体操纵仪器20通过电湿润移位。控制移动以实现对包含于所述液滴19中的生物样品9的选定处理并且在电极阵列的优选位点执行这种处理。
在生物样品处理***1的变型中，液滴19在不混溶液体***32内在间隙17中移动。当对包含于至少一个液滴19中的生物样品9执行PCR时，这种变型是优选实施例。在PCR需要这种液滴19向不同温度暴露时，包括在大约90℃的变性步骤，可以通过使用这种不混溶的***液体32来防止或至少显著地减轻液体蒸发。不与液滴19混溶的优选***液体例如选自硅油、十六烷和苯。
为了将容器2以形式配合附连到液滴操纵仪器20上，容器2和仪器20优选地各包括至少一个定位元件25。这种定位元件优选地选自：
-在容器2的侧向区域28中的至少一个凹槽和从仪器20延伸的至少一个***部使得当容器2和薄膜14附连到仪器20上时凹槽和***部被布置成形式配合到彼此。
-在容器2的底侧4上的至少一个凹槽和从机器20延伸的至少一个***部使得当带有薄膜14的容器2附连到仪器20上时，凹槽和***部被布置成彼此配合；
-在容器2的底侧4上的至少一个凹槽和从仪器20延伸的至少一个***部使得当带有薄膜14的容器2附连到仪器20上时，凹槽和***部被布置成彼此形式配合，其中从仪器20延伸的至少一个***部是珀尔贴元件以向容器2局部地提供预选温度；以及
-具有不规则多面体形状的容器2和具有相对应凹槽的液体操纵仪器，使得当容器2附连到仪器20时，二者以形式配合的贴合方式对准。
在图1(其中凹槽在容器2的底侧4上)、图2A(其中两个三角形凹槽在容器的侧区域中)和图2B(其中两个半圆形凹槽在容器2的侧向区域)中展示了实现为容器2的至少一个凹槽和从仪器20延伸的至少一个***部的定位元件25。当使用珀尔贴元件来加热用于定位生物样品9的井状结构6时，这种珀尔贴元件可以实现为从仪器20延伸的***部，可以选择其位置使得例如具体地向井状结构6提供限定温度(无论其是否在中央)。然而，也可以使用以限定配置将容器2定位于液滴操纵仪器20上的其它手段，这些是本领域技术人员熟知的并且将不在此处更详细地描述。
虽然容器2定位于液滴操纵仪器20上，在平坦聚合物薄膜14上的液滴19可以仅接触薄膜14的疏水性上表面或者可以接触薄膜14的疏水性上表面16和容器2的底侧4。这种液滴19的接触表面可能受到间隙19的大小设定(因此，突起5的大小设定)或者液滴19大小设定影响。
优选地通过注射模制来制造容器2。以此方式，可以降低生产成本，尽管可实现高制造品质，并且容器2可以用作低成本的一次性用品。这种单次使用的容器2适合于销售以用于各种应用并且可以配备具体反应试剂组10。容器2优选地由电绝缘材料26，导电材料27或者由导电材料26和电绝缘材料27的组合制成。当由两种不同材料制成时，优选两步骤注射过程。在图1、图2A和图2B中，容器2芯由电绝缘材料26制成，其中在井状结构6、6'周围的区域由导电材料27制成。由导电材料27制成的周围区域由绝缘材料26彼此分开。由导电材料27制成的这些周围区域可以在容器2的底侧4形成喷嘴47，喷嘴47略微伸入到间隙17内(参看图1)。由这种喷嘴提供的优点在于能不同地产生液滴19并且将液滴19递送到间隙内，而不使液滴19接触容器2的底侧的表面。而且，这种喷嘴能允许液滴19定向递送到间隙17内。而且，由导电材料27制成的周围区域的部分形成容器2的外侧28的部分。这种变型可以具有以下优点：容器2的每个导电区域27可以单独地电接触。这允许由电压控件29来定址导电区域并且向导电区域提供单独电压。因此，从每个井状结构6、6'，可以使用电湿润原理使一个或多个液滴移位到平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上。重要的是，每个井状结构可以单独地进行移位，使得反应试剂10或含有生物样品9的液体可以在在薄膜14上需要它们时单独地移位。
在图2A中，用于定位生物样品9的至少一个井状结构6朝向容器2的外侧28布置。至少一个井状结构6额外地被导电材料27包围。在此变型中，导电周围27延伸以形成容器2芯的主要部分。以此方式，容器2的底侧4的大部分也由导电材料27制成。这允许通过将容器2的底侧4的导电部分用作接地电极进行电湿润来处理液滴19，液滴19定位于薄膜14的疏水性上表面16上并且接触容器2的底侧4。因此，在此变型中，可以进一步稳定液滴19的受引导的移动。
当容器2本身经历加热步骤时，例如，以促进用于定位生物样品和/或反应试剂的至少一个井状结构6内的细胞裂解时，优选地，容器2的部分由热隔离材料制成或者热绝缘间隙设置于较高温度区周围。
在优选实施例中，容器2包括用于标识的器件30，用于标识的器件30选自条码和RFID(射频标识)标记或其它集成芯片。由于这种标识器件30是本领域技术人员熟知的，它们将不在此处进行更详细描述。当生物样品处理***1的容器2以自动化方式使用，同时储存关于例如容器2的井状结构6中定位的生物样品的信息时，标识器件30是特别优选的。此外，能甚至在较大实验室***中跟踪特定样品。
虽然包括生物样品9的固体基板24定位于容器的至少一个井状结构6内，这个井状结构6优选地包括用于防止固体基板24阻挡所述井状结构6的开口8的固位器件31。固位器件31选自过滤器、熔块(参看图1)和浮雕结构(参看图2B)。然而，本领域中熟知的其它固位结构31也可以用于这些目的。
图2A和图2B各示出了具有分析区33的容器2。当平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16的某些区域将由光学器件38接近时，具有分析区33的容器2是优选的。在最简单的实施例中，切口部段限定分析区33，优选地在容器2的外侧28中。在切口下方的薄膜14的疏水性上表面16的相应区域以此方式能由光学器件38接近。这种光学器件可以是例如人眼或光学装置。图2A和图2B示例性地示出了相对于分析区33，光学器件的优选位置。最优选地，分析区33定位于疏水性上表面16的区域上方，其被实现为使用测序来处理生物样品9，当执行通过杂交方法进行的测序方法时，是特别优选的。优选地，光学装置38选自标准显微镜、照相机***、光引导***诸如光纤、扫描仪和其调适或组合。例如，在很简单的实施例中，摄像机，简单的CCD或PMT(光电倍增管)与光源诸如LED一起使用，光源用作薄膜14上的荧光标签的激发源。如果使用光引导***，激励和/或测量装置可以位于容器2旁侧。因此，可以对相同聚合物薄膜16和电极阵列21执行自动样品处理和分析。
如图2A和图2B所示，当具有分析区33时，容器2优选地包括支承边沿45。当与分析区33邻接时，这个支承边沿45沿着容器2的外侧28延伸。因此，这个支承边沿45也可以在其底侧上包括一个或多个突起5，底侧附连到平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上。当定位于薄膜14上时，这个支承边沿45支承具有切口的容器2。
以特别使用者友好的方式，具有至少一个分析区33的许多容器2被布置成使得每个分析区33易于由一个光学装置38接近。一种可能方式将容器2围绕旋转光学装置38基本上圆形排列。替代地，容器2可以以适当载体的竖直或水平行储存，并且光学装置38或具有容器2行的载体手动或自动转移到其中分析区33由光学装置33接近的位置。
容器2和平坦聚合物薄膜14二者可以作为单独部件向使用者提供，单独部件将保持到即将开始处理生物样品9时才组装。然而，在替代实施例中，这两个部件可以提供为盒40。在此情况下，盒包括容器2和平坦聚合物薄膜14，容器2和平坦聚合物薄膜14通过胶合或焊接或其它适当手段附连到彼此，以使这两个部件稳定地附连。
优选地，容器2或盒40包括用于保护井状结构6、6'和其内含物避免外部影响的覆盖物43。这种覆盖物43可以密封地附连到容器2的顶侧7上。附连可以是可逆的。在优选变型中，覆盖物43是薄膜，薄膜可选地由可刺穿材料制成。以此方式，可以预先加载容器2的井状结构6、6'。通过将薄膜覆盖物43施加到容器2上而允许安全储存。仅在开始样品处理时，将薄膜覆盖物43刺开并且使用者可以接近容器2的井状结构6、6'。此外，容器2或盒40也可以被覆盖物43覆盖。
在第二方面，本发明涉及一种液滴操纵仪器20。在优选实施例中，这个液滴操纵仪器20被实现为用于根据本发明的第一方面的生物样品处理***1中。然而，液滴操纵仪器20可以独立于生物样品处理***1使用。
根据本发明的第二方面的液滴操纵仪器20包括用于通过电湿润来引起液滴移动的至少一个电极阵列21。液滴操纵仪器20还包括用于支承电极阵列21的基板22和控制单元23。控制单元23包括与至少一个电压控件29连接的至少一个电极选择器34。电极选择器34被实现为单独地选择电极阵列21的每个电极35。而且，电极选择器34被实现为向选定电极35提供电压，电压受到电压控件29控制。至少电极选择器34和电压控件29受到中央处理单元36控制，中央处理单元36由控制单元23包括。中央处理单元36被实现为控制电极选择器34和电压控件29以单独地选择至少一个电极35并且向选定电极35提供单独电压脉冲。优选地，单独电压脉冲选自接地电压和驱动电压。通过选择和提供单独电压脉冲，选定电极35被限定为驱动电极35'或接地电极35”。
电极阵列21的电极35可以具有各种形状。一般而言，适合于形成电极35的阵列的这些电极35的形状是优选的。图3A至图3D示出了优选电极形状的某些示例。可以从图3A看出，电极35可以具有矩形形状。此处，电极35具有正方形形状，然而，其它矩形形状也是合适的。在图3B中，电极35被示出具有六边形状，在图3C中具有圆形状，并且在图3D中具有三角形形状。然而，其它形状也是合适的，只要电极35能形成阵列并且可以由电极接触线接近。
优选地，中央处理单元36包括可启用的软件37。这个软件27允许中央处理单元36控制电极选择器34和电压控件29以单独地选择至少一个电极35并且向选定电极35提供单独电压脉冲。
控制单元23优选地包括电源44。这个电源44向至少中央处理单元36和电压控件29提供电力。取决于其它元件诸如电极选择器34的实施例，电源44可以额外地向其它元件提供电力。
控制单元23能通过选择随后驱动电极35'序列而限定液滴19的受引导移动的路径。由此，在控制单元23的控制之下，这些选定驱动电极35'中至少一个随后沿着所述路径被提供驱动电压脉冲。而且，控制单元23被实现为基本上同时向邻近脉冲式驱动电极35'并且不同于该路径的选定驱动电极35'的至少一个电极35”提供接地电压脉冲。
用于液滴的受引导移动的这种路径各在图3A至图3D中示出。指示了随后的选定驱动电极35'。实际驱动电极35'被示出为该电极35，液滴19位于该电极35上。以箭头示出了液滴19的规划的受引导的移动方向。在该方向上，沿着该路径的随后电极35'将被提供驱动电压脉冲。
优选地，液滴19的大小或直径略微超过电极35的直径。最优选地，为了通过电湿润进行受引导移动，液滴不仅触及实际驱动电极35'，而且也略微同时触及将变成下一实际驱动电极35'的随后电极35'。然而，相对于液滴大小调整电极大小在本领域技术人员的知识内并且将不在这里重复。然而，电极的实际大小和设计以及液滴19的所希望的大小必须与彼此并且与电湿润的惯例相符。
根据第二发明方面，邻近待移动的液滴19存在至少一个接地电极35”向其移动提供稳定效果。图3A至图3D指示了可以被提供接地电压脉冲的那些电极35”。那些接地电极35”优选地邻近脉冲式驱动电极35'并且与该路径的选定驱动电极35'不同或相同。提供接地电压脉冲优选地与提供驱动电压脉冲基本上同时执行。替代地，提供接地电压脉冲与提供驱动电压脉冲基本上同时进行。
根据液滴操纵仪器20的优选变型，控制单元20被实现为向邻近脉冲式驱动电极35'并且不同于该路径的选定驱动电极35'的至少两个电极35”提供接地电压脉冲。优选地，这至少两个选定接地电极35”是在该路径的相同侧上的随后电极35。
如图3A至图3B所示，接地电极35”可以选自沿着该路径、邻近该路径并且邻近液滴19的电极35。优选地，选定接地电极35”在该路径的相同侧上。当三个或更多个电极35”组基本上同时被提供接地电压电位时，至少两个第一电极35”优选地选自该路径的一侧。然而，该组的其余电极35”可以选择成使得该路径的侧部与该组的前两个接地电位相对35”。然而，即使当一组接地电极35”从该路径的两侧选择，它们与脉冲式驱动电极35'基本上同时或同时被提供接地电压脉冲。如果一组电极35”被同时提供接地电压脉冲，其它电极35”可以邻近该路径并且在液滴19前方，邻近该路径并且在液滴19后方或者这两种情况。
在液滴操纵仪器20的一变型中，一组2个或更多个电极35可以基本上同时被提供驱动电压脉冲。在此情况下，可以使较大体积的液滴19'移动。然而，在此变型中，优选地一组2个或更多个电极35基本上同时或同时被提供接地电压脉冲以充分支承具有较大体积的液滴19'。
在液滴操纵仪器20的优选变型中，控制单元被实现为向至少一个选定电极提供停止电压脉冲以生成停止电极35'。优选地，提供的停止电压脉冲不同于驱动电压脉冲和接地电压脉冲。
用于将选定电极35限定为驱动电极的电压脉冲优选地在20V与100V之间。用于将选定电极35限定为停止电极的电压脉冲优选地在-50V与+50V之间。如在图3A至图3D中所示，选定停止电极35"'邻近该路径，不同于该路径的选定驱动电极35'并且不同于邻近该路径的至少一个选定接地电极35”。而且，停止电极35"'选自邻近该路径的这些电极35，其中路径提供液滴19移动的方向变化。停止电极35"'支持液滴沿着路径移动的方向变化。
图3A至图3D示出了沿着该路径的停止电极35"'的示例性可能位置。优选地，沿着该路径在方向变化的位置的至少一个电极35"'被提供停止电压脉冲。然而，可以选择在该区域中的多于一个电极35"'被提供停止电压脉冲，如图3D所示。此处，在方向变化点，两个或更多个电极被选作停止电极35"'以支持液滴移动。
图3B和图3C示出了电极阵列21的示例性虚拟网络。虚拟网格的每个网格点39由电极阵列21的每个电极35的几何中心确定。图3B示出了根据六边形的六边形网格和电极阵列21的每个电极35的致密包装。图3C示出了基于电极35的正交布置的正交网格，这个时间基本上示出了圆形形状。优选地，用于限定该路径的随后电极，随后选定接地电极35”和/或随后选定停止电极35"'由该虚拟网格的两个网格点39之间最靠近的距离限定。以此方式，可以确保连续液滴移动。因为更高的自由度，电极阵列21的六边形布置优选于正交布置。
图1示意性地示出了相对于基板22，电极35的位置。优选地，电极阵列21的电极35相对于基板22定位，使得电极35的上表面与基板22的上表面基本上齐平。替代地，电极阵列的电极35定位于基板22内并且被基板封闭(参看图1中左侧)。优选地将电极35尽可能靠近液滴19定位以便能减小电湿润所需的电压。因此，电极35与基板22的上表面齐平并且特别优选很薄的聚合物薄膜。作为用于薄聚合物薄膜的材料，可以使用食品包装纸和可拉伸的蜡薄膜。
在优选实施例中，根据本发明的液滴操纵仪器20被实现为容纳用于较大体积处理的容器2并且同时容纳具有疏水性上表面16的平坦聚合物薄膜14。在用于较大体积处理的容器2和包括疏水性上表面16的平坦聚合物薄膜14附连到液滴操纵仪器20上的情况下，形成适合于定位于容器2内的样品9的生物样品处理的***。这种***优选地对应于根据本发明的第一方面的生物样品处理***1。
在另一变型中，根据本发明的液滴操纵仪器20被实现为容纳盒40。所述盒包括容器2和平坦聚合物薄膜14，如在本文中在先前所描述那样。盒40的容器2和薄膜14通过胶合或焊接或者通过稳定地连接容器2与薄膜14的其它适当手段而彼此附连。在这种盒40附连到液滴操纵仪器20的这个变型上的情况下，可以形成根据本发明的第一方面的生物样品处理***1。
在一变型中，液滴操纵仪器20包括至少两个或更多个电极阵列21。优选地，电极阵列21基本上水平地布置于液滴操纵***20内。在此变型中，仪器20被实现为容纳至少两个或更多个容器2以及两个或更多个平坦聚合物薄膜14，或者容纳至少两个或更多个盒40。优选地，容器2和薄膜14或者盒40可以基本上定位于电极阵列上方。然而，当电极阵列并未基本上水平对准但基本上竖直时，也能将这些部件基本上定位于旁侧或侧向。
在一特别优选实施例中，根据本发明的第一方面的生物样品处理***1包括根据本发明的第二方面并且如在上文中详细讨论的液滴操纵仪器20。液滴操纵仪器20的实施例以及生物样品处理***1的实施例可以根据要解决的问题通过选择上文所讨论的各种特点而选择。如果没有另外说明，在本申请中给出的各种特点可以全部彼此组合。
在图1中，示出了包括液滴操纵仪器20的生物样品处理***1。液滴操纵仪器20包括接收元件46以安全地接纳容器2和薄膜14。
在图示实施例中，由接收元件46包括液滴操纵仪器20的定位元件25。
图3A示出了根据生物样品处理***1的这个特别优选实施例的电极阵列21。这个图示出了图1的不同部段的放大顶视图，被指示为虚线的矩形。用于相对于电极阵列21的限定路径定位生物样品9的至少一个井状结构6的位置由图3A中的虚圆形线指示。在至少一个井状结构6底部处的开口11、通道12的通路或者容器2的底侧4的孔口13分别被指示为虚线内圆。液体18或液滴19从井状结构6通过平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上的通道12，即在液滴操纵仪器20的电极阵列21上方转移。液体部分19'在图示电极阵列21的中心示出。这个液体部分19'覆盖至少一个选定驱动电极35'与电极路径隔离。优选地，液体部分至少部分地覆盖随后的电极35'与路径分开。根据图3A，液体部分19'额外地覆盖电极35”，选择电极35”以被提供接地电压脉冲。通过向沿着该路径初始驱动电极35'随后的电极35'提供驱动电压脉冲来分离液滴19与液体部分19'。然后沿着该路径在第一方向上引导液滴19，并且在方向变化之后，在第二方向上引导液滴19。在方向变化位置，生成停止电极35"'以稳定方向变化。
在例如容器的井状结构6中执行裂解步骤并且使液体部分19、19'移位之后，优选地包括井状结构6的生物样品6的至少部分，可以对平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16执行进一步处理。为了用DNA纯化步骤处理液滴19，特别优选地使用磁珠。在此情况下，生物样品处理***1的液滴操纵仪器20优选地包括至少一个磁体41。这个磁体41在平坦聚合物薄膜14的上疏水性侧部16上的间隙17中处理期间控制磁珠。合适磁体可以是电磁体或永磁体。磁体41优选地布置于仪器基板22的该侧部上，仪器的基板22的侧部并未被电极阵列21覆盖。磁体41替代地优选地布置于仪器20的基板22不与平坦聚合物薄膜14抵接的侧部上。
为了利用诸如PCR的热相关处理步骤来处理优选地包括生物样品9的液滴19，生物样品处理***1的液滴操纵仪器20优选地包括至少一个加热元件42。这个加热元件42优选地布置在与平坦聚合物薄膜14抵接的基板侧部14相对的仪器20的基板22的该侧部上。至少一个加热元件42被实现为在平坦聚合物薄膜14的上疏水性表面16上提供具有预先限定的温度的至少一个温度区。如果液滴操纵装置20包括一个加热元件42，可以通过将包括生物样品9的液滴19保持在单个温度区内而执行PCR，同时相应地改变在单个区内的温度。如果使用两个加热元件42，可以通过使包括生物样品9的液滴19在两个区之间移动来进行PCR，其中根据循环步骤所需的温度来采用每个区的温度。当通过PCR来处理包括生物样品9的液滴19时，生物样品处理***1在一特别优选变型中包括至少三个加热元件42以在平坦聚合物薄膜14的上疏水性表面16上提供至少三个不同温度区。图1示出了生物样品处理***1，其具有在支承基板22下方并且与平坦聚合物薄膜14抵接的侧部相对的三个加热元件42。每个温度区具有预先限定的温度以允许对平坦聚合物薄膜14的上疏水性表面16执行PCR。最优选地，一个温度区包括用于使双链核酸变性的温度，一个温度区包括允许预选引物退火的温度，并且一个温度区包括允许聚合酶将退火引物伸长到全链的温度。此外，生物样品处理***1可以包括第四加热元件42，第四加热元件42提供大约4℃的温度。利用在支承基板22下方的至少三个加热元件42具有以下优点：选定温度可以保持在整个反应时间恒定并且液滴可以从一个温度区域移动到另一温度区域。这种移动允许在液滴19内的快速温度变化，其比在保持液滴19就位的同时改变加热器元件42的温度更快。
在生物样品处理***1的另一变型中，低蒸气压力液体层连接平坦聚合物薄膜14的下表面15与至少一个电极阵列21的上表面以减少在它们之间的空气泡形成。优选地，低蒸气压力液体是硅油；然而，也可以使用使用其它低蒸气压力液体。
图4示出了根据第一优选实施例并且类似于图3A具有矩形电极35的网格状电极阵列21的顶视图。在这个部分示意图中，示出了特别优选的液滴操纵仪器20，液滴操纵仪器20包括：
(a)用于通过电湿润来引起液滴19移动的至少一个电极阵列21；
(b)支承至少一个电极阵列21的基板22；以及
(c)控制单元23，其包括与至少一个电压控件29连接的至少一个电极选择器34，至少一个电极选择器34被实现为单独地选择至少一个电极阵列21中的每个电极并且向选定电极35提供受电压控件29控制的电压；控制单元23还包括用于控制电极选择器34和电压控件29的中央处理单元36以单独地选择至少一个电极35并且向至少一个选定电极35提供单独电压脉冲，单独电压脉冲选自驱动电压、接地电压和停止电压，因此将选定电极35限定为驱动电极35'、接地电极35”或停止电极35"'。
根据本发明，液滴操纵仪器20的控制单元23：
(d)能通过基本上同时选择所述电极阵列21的一组两个或更多个随后驱动电极35'来限定液滴19和覆盖一个电极阵列21的多于一个电极35'的较大体积的液体部分19'的受引导的移动路径，并且沿着所述路径，向这些选定驱动电极35'中每一个提供驱动电压脉冲；以及
(e)被实现为基本上同时向与脉冲式驱动电极35'相邻或相同的一组两个或更多个电极35提供接地或停止电压脉冲。
图4A示出了覆盖同一电极阵列21的大约18个脉冲式驱动电极35'的较大体积的液体部分19'。优选地，这些18个电极35被启用以收集较大体积的这些液体部分19'，启用的电极35'吸引液体或者至少保持液体在稳定体积。最优选地，这个较大体积的液体部分19'保持在平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上并且在间隙17内，平坦聚合物薄膜14向具有至少一个电极阵列21的基板22暴露(与图1相比较)。在启用的电极35'(以灰色示出)的周围，多个电极35被限定为接地电极35”或停止电极35"'(以白色示出)。所有电极35操作性地连接到控制单元23的电极选择器34(在图4A中仅部分地示出在图4B和图4C中存在但未示出)。
图4B示出了现在被提供接地电压脉冲、与先前的脉冲式驱动电极35'相同的一组两个电极35”。这造成较大体积的液体部分19'往回朝向启用的电极35'抽吸并且引起较大体积的液体部分19'局部分离(参看双箭头)成仍覆盖同一电极阵列21的至少两个脉冲式驱动电极35'的两个较小部分19'。
图4C示出了与先前脉冲式驱动电极35'相同并且现在被提供接地或停止电压脉冲(停止电压脉冲甚至促进了分离效果)的一组三个电极35”。这造成了较大体积的液体部分19'现完全分成(参看向左右的双侧箭头)仍覆盖相同电极阵列21的至少两个脉冲式驱动电极35'的两个较小部分19'。
类似于使用三行电极35的驱动路径(如图4所示)，当使用相同特别优选液滴操纵仪器20时也可以执行较小体积(即，单个液滴19)的分离(参看图5)。
图5示出了根据第二优选实施例并且类似于图3A具有矩形电极的阵列的网格状电极阵列的顶视图。
在图5A中，较大体积的液体部分19'覆盖相同电极阵列21的大约6个脉冲式驱动电极35'。在启用的电极35'(以灰色示出)，多个电极35被限定为接地电极35”或停止电极35"'(以白色示出)。所有电极35操作性地连接到控制单元23的电极选择器34(在图5A中仅部分地示出，并且在图5B和图5C中存在但并未示出)。
为了分离或分配来自较大体积的其余液体部分19'的液滴19，启用相同电极阵列21的额外驱动电极35'使得液体部分19'现覆盖大约7个驱动电极35'(参看图5B，向右的单侧箭头)。然后，与图5B中启用额外驱动电极35'的方向相反，启用相同电极阵列21的额外驱动电极35'使得液体部分19'现在覆盖大约7个驱动电极35'(参看图5B，向右的单侧箭头)。然后，与图5B中启用额外驱动电极35'的方向相反，启用另一驱动电极35'，并且与先前脉冲式驱动电极35'相同的一组两个电极35”被提供接地或停止电压脉冲。这造成液滴19分配并且较大体积的其余液体部分19'在不同方向上移动(参看图5C中双箭头)。向一组两个电极35”提供停止脉冲甚至促进了所希望的分离效果。
当利用相同特别优选的液滴操纵仪器20(参看图6)时，使用三行电极35的驱动路径(例如图4所示)与最接近到达电极阵列21的单个电极行(与图3A相比)的电极路径的组合优选地用于分配较小液体体积，即，单个液滴19。
图6示出了根据第三优选实施例并且类似于图3A具有矩形电极35的阵列的网格状电极阵列21和邻近电极阵列21的电极路径的顶视图。
在图6A中，较大体积的液体部分19'覆盖电极阵列21的大约10个启用电极35'。电极路径的所有电极35未启用(例如，处于接地或处于停止电位)。优选地，这些12个电极35被启用以收集这个较大体积的液体部分19'，启用的电极35'吸引液体或至少保持液体在稳定的体积。最优选地，这个较大体积的液体部分19'保持在平坦聚合物薄膜14的疏水性上表面16上并且在间隙17内，平坦聚合物薄膜14向具有至少一个电极阵列21的基板22暴露(与图1相比)。停用电极阵列21的电极将显著地改变较大体积的液体部分19'的位置和形状。所有电极35操作性地连接到控制单元23的电极选择器34(在图6A中仅部分地示出，在图6B和图6F中存在但并未示出)。
为了从较大体积的其余液体部分19'分离或分配液滴19，启用电极路径的前两个相邻驱动电极35'，并且禁用该阵列21的先前启用的12个电极35(参看图6B)。在此情况下禁用表示向电极阵列21的12个电极35提供接地电压脉冲。电极路径的前两个相邻驱动电极35'与该阵列21的12个电极35的这种组合作用造成较大体积的液体部分19'向左移动并且在电极路径的前两个相邻驱动电极35'上传播(参看向左的单侧箭头)。
连续地(参看图6C)，启用电极路径的第三驱动电极35'，禁用前两个相邻驱动电极35”，并且也启用电极阵列的一组9个电极35'。同时，禁用电极阵列的三个电极35”。在此情况下禁用表示向该路径的前两个相邻驱动电极35”提供接地或停止脉冲。这通过使液滴19移动到该路径的第三电极35并且使残余液体部分19'向后移动到电极阵列21的启用电极35'(参看左右单侧箭头)而造成第一液滴19与较大体积液体部分分离(或分配)。向两个相邻驱动电极35”提供停止脉冲甚至增强了所希望的分离效果。其余液体部分19'现覆盖电极阵列的大约9个电极。
然后(参看图6D)，启用电极路径的第四驱动电极35'，禁用第二驱动电极和第三驱动电极35”。在此情况下禁用表示向该路径的第二驱动电极和第三驱动电极35”提供接地或停止脉冲。这造成第一液滴19向该路径的第四电极35'移动(参看向左的单侧箭头)。同时，电极路径的第一驱动电极35'与电极阵列21的相邻9个电极35'一起启用并且电极阵列的三个电极35”保持禁用。这造成较大体积的液体部分19'向左移动并且在电极路径的第一相邻驱动电极35'上传播(参看向左的单侧箭头)。相对于电极阵列21的三个电极35”禁用迫使较大体积的残余液体部分19'向电极路径附近的电极35'浓缩。
在下文中(参看图6E)，启用电极路径的第五驱动电极并且禁用第四驱动电极。这造成第一液滴19向该路径的第五电极35'移动(参看向左的单侧箭头)。同时，启用电极路径的前三个驱动电极35'，并且禁用电极阵列的所有电极。这造成较大体积的液体部分19'向左移动并且在电极路径的前三个驱动电极35'上传播(参看向左的单侧箭头)。
之后(参看图6F)，电极路径的第五驱动电极和第三驱动电极35'保持启用，而第四驱动电极和前两个驱动电极禁用。这造成第一液滴19保持在第五电极35'上，和第二液滴19在该路径的第三电极35'上分离(参看向左的单侧箭头)。同时，启用该阵列21的6个电极35，这造成其余液体部分19'抽到电极阵列21看，从那里，其现覆盖大约8个电极(参看向右的单侧箭头)。在分配另外的(第三)液滴19之前，在每种情况下已经分离的液滴19至少移动到下一驱动电极35'，并且形成如图6D所描绘的类似情形。
特别地，关于图4、图5和图6，明确地指出优选地，电介质层设置于电极阵列21的表面上。优选地，电介质层是液滴操纵仪器20的基板22的部分或者平坦聚合物薄膜14的部分。偏离于图3A所示的实施例，间隙优选地17在其上侧上被具有疏水性表面的电介质层闭合，使得液滴19或液体部分19'移动并且在两个疏水性表面之间的间隙17中操纵。间隙17可以部分地或完全地填充不与液滴19或液体部分19'混溶的流体，流体优选地选自空气、化学惰性气体(如N2)和非水性液体(如硅油或十六烷)。基板22可以选自如印刷电路板(PCB)、聚合物、玻璃或化合材料等材料。优选地，所有电极35布置于相同平面中；然而，也设想到将电极35布置于不同平面中或不同倾斜平面中。
在本申请的上下文中，从较大部分19'“分配”液滴19，将液滴19“分成”更小液滴，并且将较大部分19'“分成”若干部分被称作操纵液滴19或液体部分19'，无论较大液体部分19'是否需要“抽吸”。在本申请的上下文中，使较小液滴19彼此“联合”(例如，用于混合反应相配物)或者与较大液体部分19'联合，并且“组合”较大液体部分19'也被称作操纵液滴19或液体部分19'。在本申请的上下文中，为了迫使较大液体部分19'在所希望的方向(例如，到其中电极部分联合电极阵列21的位点)而控制地减小电机阵列21的大小被称作“抽吸”。在本申请的上下文中，相等大小的电极35的数量或“网格”可以被称作“储集器”或“操纵阵列”。本发明的精神和范围包括属于所附权利要求的界限内并且对于本领域技术人员而言合理的在本专利申请中公开的电极阵列的不同实施例的任何组合。
相似的附图标记指代相似部件，如果它们并未详细地特别地讨论。
附图标记列表：
1生物样品处理*** 2容器
3容器的顶侧 27导电材料
4容器的底侧 28容器的外侧
5容器的突起 29电压控件
6、6'容器的井状结构 30标识器件
7井状结构的顶侧 31固位器件
8井状结构底侧的开口 32***液体
9生物样品 33分析区
10反应试剂 34电极选择器
11井状结构的开口 35电极
12容器的通道 35'驱动电极
13容器的孔口 35”接地电极
14平坦聚合物薄膜 35"'停止电极
15平坦聚合物薄膜的下表面 36中央处理单元
16平坦聚合物薄膜的疏水性上 37软件
表面 38光学器件
17间隙 39网格点
18液体 40盒
19液滴 41磁体
19'较大体积的液体部分 42加热元件
20液滴操纵仪器 43覆盖物
21电极阵列 44电源
22仪器的基板 45支承边沿
23控制单元 46接收元件
24包括生物样品的固体基板 47喷嘴
25定位元件 d在薄膜的上表面与容器的底
26电绝缘材料 侧之间的距离

Claims (12)

1.一种在包括液滴操纵仪器(20)的生物样品处理***(1)中分离液滴(19)与液体部分(19’)的方法，包括：
·至少一个电极阵列(21)，其具有用来通过电湿润而引起覆盖单个电极(35)的液滴(19)和覆盖所述电极阵列(21)的多于一个电极(35)的较大体积的液体部分(19’)中至少一个移动的电极(35)；
·基板(22)，其支承所述至少一个电极阵列(21)；
·控制单元(23)，其能限定所述液滴(19)和液体部分(19’)的受引导的移动路径；
·至少一个电压控件(29)；
·至少一个电极选择器(34)，其与所述至少一个电压控件(29)连接以单独地选择所述至少一个电极阵列(21)的每个电极(35)并且向所述选定电极(35)提供单独电压脉冲，所述单独电压脉冲选自包括驱动电压、接地电压和停止电压的组群；
·中央处理单元(36)，其用于控制所述电极选择器(34)和所述电压控件(29)；
·容器(2)，其具有顶侧(3)和底侧(4)，突起(5)分布于所述底侧(4)上；以及
·平坦聚合物薄膜(14)，其具有下表面(15)和疏水性上表面(16)，所述疏水性上表面(16)由所述突起(5)保持离所述容器(2)的所述底侧(4)一定距离(d)，当所述容器(2)定位于所述平坦聚合物薄膜(14)上以其突起(5)抵靠所述平坦聚合物薄膜(14)时，所述距离(d)限定至少一个间隙(17)，
其中所述方法包括以下步骤：
(a)将所述容器(2)和所述平坦聚合物薄膜(14)可逆地附连到所述液滴操纵仪器(20)上使得所述平坦聚合物薄膜(14)的所述下表面(15)抵靠所述至少一个电极阵列(21)；
(b)在所述间隙(17)中在所述平坦聚合物薄膜(14)的所述疏水性上表面(16)上并且在所述至少一个电极阵列(21)上方提供较大体积的液体部分(19’)；
(c)沿着限定的电极路径向至少一个初始驱动电极(35’)提供驱动电压脉冲，因此使所述较大体积的液体部分(19’)在第一方向上移动；
(d)通过向所述初始驱动电极(35’)中的至少一个提供接地或停止电压脉冲以及通过向所述电极阵列(21)的两个或更多个驱动电极(35’)组提供驱动电压脉冲以便使所述较大体积的液体部分(19’)在与所述第一方向相反的第二方向上移动来分离所述液滴(19)与所述较大体积的液体部分(19’)。
2.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，在步骤(d)，所述初始驱动电极(35’)中的两个被提供接地或停止电压脉冲以分离液滴(19)与所述较大体积的液体部分(19’)。
3.根据权利要求2所述的方法，
其特征在于，在步骤(d)，所述初始驱动电极(35’)中的两个被提供停止电压脉冲以分离液滴(19)与所述较大体积的液体部分(19’)。
4.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述容器(2)和所述平坦聚合物薄膜(14)被设置为盒(40)，所述盒(40)包括所述容器(2)和所述平坦聚合物薄膜(14)，所述容器(2)和所述平坦聚合物薄膜(14)通过胶合或焊接而附连到彼此。
5.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述容器(2)和所述平坦聚合物薄膜(14)被设置为保持到即将开始处理生物样品(9)时才组装的单独部件。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述平坦聚合物薄膜(14)被提供为电绝缘平坦聚合物薄膜。
7.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，电介质层设置于所述电极阵列(21)的表面上。
8.根据权利要求7所述的方法，
其特征在于，所述电介质层是所述液滴操纵仪器(20)的所述基板(22)的部分或者所述平坦聚合物薄膜(14)的部分。
9.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述液滴(19)和所述较大体积的液体部分(19’)在不混溶***液体(32)内在所述间隙(17)内移动。
10.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述容器(2)是用于较大体积处理的容器(2)，并且其包括在顶侧(3)开放以在其中定位生物样品(9)和/或反应试剂(10)的至少一个井状结构(6)；以及
其中，所述至少一个井状结构(6)包括底侧(8)，所述底侧(8)具有至少一个开口(11)，所述容器(2)还包括通道(12)，所述通道(12)连接所述井状结构(6)的所述开口(11)与所述容器(2)的所述底侧(4)上的孔口(13)。
11.根据权利要求10所述的方法，
其特征在于，至少一个液滴(19)从所述至少一个井状结构(6)通过所述容器(2)的所述通道(12)移位到所述平坦聚合物薄膜(14)的所述疏水性上表面(16)上并且在所述至少一个电极阵列(21)上方，并且通过所述液滴操纵仪器(20)控制的电湿润通过在所述平坦聚合物薄膜(14)的所述疏水性上表面(16)上的受引导的移动来处理所述液滴(19)。
12.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，所述容器(2)被提供为低成本的一次性用品并且在通过所述液滴操纵仪器(20)控制的电湿润对所述平坦聚合物薄膜(14)的所述疏水性上表面(16)上的液滴(19)处理之后丢弃。
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