CN105002134A - 制备多潜能干细胞的组合物、方法、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效稳定制备高度免疫缺陷哺乳动物(如小鼠)多潜能干细胞的组合物、使用所述组合物的方法、包含所述组合物的试剂盒及其用途，所述组合物包含：干细胞基础培养基；和维生素C或其衍生物。

Description

制备多潜能干细胞的组合物、方法、试剂盒及其用途

技术领域

本发明提供一种高效稳定制备高度免疫缺陷哺乳动物(如小鼠)多潜能干细胞的组合物、方法、试剂盒及其用途。

背景技术

为了提高对人体造血发生、固有免疫、传染性疾病、癌症和再生医学的理解和认识，干细胞领域一直以来致力于开发人源化小鼠模型(Bente etal.,2005；King et al.,2008；Kumar et al.,2008；Sun et al.,2007；Yajima et al.,2009)。近些年来，在开发人源化小鼠方面取得了许多重要实验进展，其中之一是建立了高度免疫缺陷NOD-scid Il2rg^–/–(NPG)小鼠模型，这种小鼠模型具有严重免疫缺陷(the severe combined immunodeficiency,SCID)以及interleukin-2Rg(Il-2Rg)等位基因缺失等特征(Ito et al.,2002)。NPG小鼠具有的非肥胖型糖尿病免疫缺陷的遗传背景导致树突状细胞功能和巨嗜细胞功能受损以致于固有免疫发生缺陷(Shultz et al.,1995)，同时Prkdc基因编码产生作为在T细胞和B细胞成熟过程中调控V(D)J重组的关键蛋白，在NPG小鼠上也发生了基因突变，导致消除了获得性免疫功能(Blunt et al.,1995)。此外，Il2rg^–/–定点突变完全删除了参与调控免疫功能过程的白介素2受体gamma链(interleukin 2 receptor gamma chain)，使得小鼠体内参与调控异体移植人类细胞的过程的NK细胞极度缺失(Cao et al.,1995)。基于此，这些免疫缺陷优势使得NPG小鼠成为在体内研究人类细胞、组织、器官的极好的受体模型，尤其是在建立为研究人体生物学和应用于临床前研究的提供重要线索的人源化小鼠模型方面更是发挥了重要作用(Devoyet al.,2012；Koo et al.,2009；Sato et al.,2011)。

尽管NPG小鼠是高度免疫缺陷，并且NPG小鼠人源化在体内研究人类疾病被证明是非常有价值的动物模型，但是依旧存在一些明显的缺点阻碍了其未来广泛应用于建立人源化小鼠模型。例如，NPG小鼠的胸腺内缺乏筛选T细胞的合适的MHC分子，以及一些提高人体细胞存活和生长的人特异的生长因子。此外，NPG小鼠呈现低水平的和多变的T细胞依赖抗体反应(Shultz et al.,2007)。以上这些缺点可能会阻碍其进一步应用到建立人源化小鼠模型等领域。

然而，最近一个研究小组报道了在NPG小鼠中获得了人胚胎干细胞来源的功能性胸腺类器官，为研究移植后人T细胞的成熟过程提供了有价值的线索和思路(Sun et al.,2013)。此外，另一种开发更合适的人源化小鼠的策略是向NPG小鼠的基因组中导入编码人类特异的HLA和调控移植后T细胞筛选和存活的生长因子的基因(Shultz et al.,2007)。然而，这种策略的实施依赖于体外从NPG小鼠中建立多潜能干细胞。因此体外建立稳定的NPG小鼠多潜能干细胞系正是一个非常好的研究切入点。

发明内容

本发明提供了一种体外高效稳定建立高度免疫缺陷NPG小鼠多潜能干细胞的方法，该方法通过小分子筛选平台，确立了一种在传统2i/LIF培养条件基础上添加Vitamin C的培养条件，从而使在传统2i/LIF培养条件下不能体外稳定培养的高度免疫缺陷NPG小鼠多潜能干细胞得到稳定长期培养。根据本发明，首先将NPG小鼠囊胚进行分离，并接种于小鼠成纤维饲养层细胞上，在传统2i/LIF培养条件下或2i/LIF+Vitamin C条件下培养5-8天，然后用胰酶或accutase消化成单细胞传代。传代后使用2i/LIF+Vitamin C进行长期培养或传代。这种方法成功建系效率可高达50％(从28枚NPG小鼠囊胚中获得14株多潜能干细胞系)。

这种方法建立的高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞系具有小鼠多潜能干细胞的所有典型特征并且携带NPG小鼠特征性的基因突变。因此，本发明建立了一种体外高效稳定建立高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞的方法，为未来开发全新的更优质的人源化小鼠模型提供了稳定的操作平台。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的组合物，所述组合物包含：干细胞基础培养基；和维生素C或其衍生物，其中

(1)优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选是选自以下品系小鼠组成的组的免疫缺陷小鼠：NOD-scid Il2rg^–/–(NPG)，NOD-scid,B2m^-/-,NOD-scidB2m^-/-,Tg(HLA-A2),NOD-scidTg(HLA-A2),BALB/c-Rag2^-/-Il2rg^-/-,Rag1^-/-,NOD-scid IL2rg^-/-,IL2rg^-/-,NOD-Rag1^-/-Il2rg^-/-，NOD-Rag1^-/-,Prf1^-/-,NOD-Rag1^-/-Prf1^-/-,Tg(SOD1-G93A)1Gur,Dmd^mdx-5Cv,NOD-Rag1^-/-Tg(SOD1-G93A)1Gur,NOD-Rag1^-/-Ins2^Akita,Ins2^Akita,NOD-Rag1^-/-Dmd^mdx-5Cv；

(2)优选所述干细胞基础培养基是传统2i/LIF培养条件下使用的培养基，更优选包含选自以下组成的组的干细胞培养基：D/F12，K-DMEM,KSR,FBS，N2，B27和它们的组合；和/或

(3)优选所述组合物包含选自由以下表示的维生素C或其衍生物：

2.根据以上1所述的组合物，其中所述组合物包含另外的信号通路调控因子或联合另外的信号通路调控因子使用，优选所述信号通路调控因子选自WNT信号通路调控因子、LIF/STAT3通路调控因子、MAPK通路抑制因子、维生素C相关下游信号通路调控因子和它们的组合，优选GSK3-beta抑制剂或MAPK抑制剂，优选所述调控因子是作用于上述信号通路的细胞因子、化学小分子、转录因子或胞外基质。

3.根据以上2所述的组合物，其中所述组合物包含：knock-out DMEM+N2(100x)/B27(50x)，双抗(青霉素/链霉素)，β-巯基乙醇，谷氨酰胺，非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，CHIR99021，PD0325901，LIF和维生素C。

4.一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含根据以上1-3中任一项所述的组合物，任选地还包含另外的干细胞诱导因子，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠。

5.一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的方法，所述方法包括在根据以上1-3中任一项所述的组合物的存在下培养初始哺乳动物细胞，优选所述初始哺乳动物细胞是哺乳动物早期胚胎(囊胚)建立的胚胎干细胞或适合于通过重编程技术获得多潜能干细胞的体细胞，其中对于体细胞而言，在通过重编程技术获得多潜能干细胞的后期使用所述方法，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠；优选所述培养是在有饲养层体系或无饲养层体系下培养。

6.通过根据以上5所述的方法获得的哺乳动物多潜能干细胞，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选NPG小鼠，优选所述多潜能干细胞具备以下性质中的一个或多个或全部：

(1)表达多潜能性相关标志基因，如内源Oct4，Sox2,Nanog，Sall4，Dnmt3b，Dppa2，Cripto等等；

(2)碱性磷酸酶染色强阳性，表达多种细胞内和细胞膜表面多潜能性相关标志蛋白，如细胞内的OCT4，SOX2，NANOG，细胞膜表面的SSEA-1等；

(3)具有形成畸胎瘤的能力，畸胎瘤可检测到三胚层细胞；

(4)长期传代(>15代)后仍具正常核型；

(5)具备嵌合或种系传递能力；

(6)携带高度免疫缺陷基因突变，如PRKDC以及IL2RG功能性缺失突变；和

(7)多潜能干细胞来源可为从早期胚胎(囊胚)建立的胚胎干细胞，也可以为通过重编程方法获得的可诱导多潜能干细胞。

7.一种生产哺乳动物模型的方法，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，所述方法包括：用根据以上6所述的多潜能干细胞注入所述哺乳动物的胚胎(例如8细胞胚胎)或囊胚中；和/或将获得的胚胎或囊胚移植到哺乳动物体内继续发育成嵌合哺乳动物。

8.根据以上7所述的方法，其中所述哺乳动物是非人灵长类哺乳动物。

9.根据以上7或8所述的方法，其中所述多潜能干细胞被进一步基因修饰。

10.根据以上7-9中任一项所述的方法获得的哺乳动物模型，优选免疫缺陷哺乳动物模型，更优选是免疫缺陷小鼠模型，最优选免疫缺陷NPG小鼠模型。

附图说明

图1为所用NPG小鼠基因型鉴定及免疫缺陷功能性鉴定。图1A为NPG小鼠基因型鉴定。结果表明同野生型小鼠(WT)相比，NPG小鼠携带PRKDC以及IL2RG功能性缺失突变。图1B为NPG小鼠免疫缺陷功能性鉴定。结果表明，同对照组小鼠相比，NPG小鼠体内缺乏T，B及功能性NK细胞。

图2为获得的NPG小鼠多潜能干细胞系形态，初步鉴定及效率统计。图2A(左)为从NPG小鼠囊胚长出的突出物，(中)为单细胞传代后生长两天的克隆形态，(右)为AP染色图；图2B为2批实验中NPG小鼠胚胎干细胞建系效率统计。标尺:100μm。

图3为NPG小鼠多潜能干细胞系的生长特征及长期传代后的基因组稳定性鉴定。图3A为不同多潜能干细胞系，包括2株NPG胚胎干细胞系、1株野生型小鼠胚胎干细胞系和1株化学小分子诱导的野生型多潜能干细胞系的生长曲线图；图3B为传代至15代的NPG小鼠胚胎干细胞系的核型鉴定。说明NPG小鼠胚胎干细胞系在长期传代情况下仍能保持基因组稳定性。

图4为NPG小鼠多潜能干细胞体外性质鉴定。图4A为NPG小鼠胚胎干细胞系组化鉴定，表明Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-1为阳性；图4B为RT-PCR结果，表明NPG小鼠胚胎干细胞系表达干性基因；图4C为甲基化检测结果，表明NPG小鼠胚胎干细胞系的Nanog promoter区域高度去甲基化。标尺:100μm。

图5为NPG小鼠多潜能干细胞体内性质鉴定。图5A畸胎瘤结果表明NPG小鼠胚胎干细胞系能向外胚层、中胚层和内胚层分化；图5B说明NPG小鼠胚胎干细胞具有产生嵌合小鼠的能力。标尺：100μm。

图6为NPG小鼠多潜能干细胞表达谱分析。图6A和6B聚类分析表明NPG小鼠胚胎干细胞基因表达水平与野生型胚胎干细胞系和多潜能干细胞系相似，与小鼠胚胎成纤维细胞有显著差异；图6C为GO分析(david.abcc.ncifcrf.gov/)，表明了NPG小鼠胚胎干细胞中上调和下调的信号通路。

图7为NPG小鼠多潜能干细胞系携带NPG小鼠特征性的基因突变检测。结果表明同野生型胚胎干细胞系和多潜能干细胞系相比，NPG小鼠多潜能干细胞携带PRKDC以及IL2RG功能性缺失突变。IL2RG:小鼠IL2RG基因组检测；PRKDC:小鼠PRKDC基因组检测；GAPDH:内参基因。

图8为所用引物列表

具体实施方式：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验中采用的主要试剂和仪器

(一)从NPG小鼠囊胚建立多潜能干细胞系

高度免疫缺陷小鼠来源及品系鉴定：

本实施例选用的高度免疫缺陷小鼠品系是由北京维通达生物技术有限公司提供的NPG小鼠。与国际公认的高度免疫缺陷小鼠品系NSG小鼠具有相似的基因突变及免疫缺陷特征。检测结果见附图1。

主要使用的试剂：

NPG小鼠多潜能干细胞培养基：knock-out DMEM+N2(100x)/B27(50x)，1％双抗(青霉素/链霉素)，0.1mMβ-巯基乙醇，1mM谷氨酰胺，1％非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，3μM CHIR99021，0.5μM PD0325901，Vitamin C(50μg/ml)LIF(10ng/ml)。

实验步骤：

1)收集胚胎E3.5时期的NPG小鼠囊胚(由北京维通达生物技术有限公司提供)。

2)将NPG小鼠囊胚接种于小鼠成纤维饲养层细胞上，在NPG多潜能干细胞培养基(2i/LIF+Vitamin C)中培养5-8天，其间每天更换新鲜培养基。

3)将原代生长出来的克隆手工挑出并用胰酶或accutase消化成为单细胞，传代接种于新鲜的小鼠成纤维饲养层细胞上，在NPG小鼠多潜能干细胞培养基(2i/LIF+Vitamin C)中进行培养及后续传代。传代周期为4-6天。

4)挑选可以长期稳定传代的细胞系进行后续鉴定实验。

(二)NPG小鼠多潜能干细胞系培养和传代

主要使用的试剂：

NPG小鼠多潜能干细胞培养基：knock-out DMEM+N2(100x)/B27(50x)，1％双抗(青霉素/链霉素)，0.1mMβ-巯基乙醇，1mM谷氨酰胺，1％非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，3μM CHIR99021，0.5μMPD0325901，Vitamin C(50μg/ml)，LIF(10ng/ml)。

实验步骤：

1)观察NPG小鼠多潜能干细胞克隆，待其长至对数期(3-5天)即可进行传代。

2)吸出原10cm培养皿中的培养基，用PBS洗2遍，以除去上层死细胞。加入1-2ml accutase于37摄氏度消化1-3分钟。其间不断轻轻拍打晃动培养皿。

3)待NPG小鼠多潜能干细胞克隆开始散开且有约50％以上的克隆从饲养层细胞上脱落时，加入约2-3ml NPG小鼠多潜能干细胞培养基终止消化。

4)用移液枪轻轻将未脱落的克隆从饲养层细胞上吹落，一并转移至15ml离心管中。

5)用移液枪轻轻吹打，使克隆成为单细胞。900rpm离心3分钟后弃上清，加入约2-3ml NPG小鼠多潜能干细胞培养基清洗，900rpm离心3分钟。

6)将提前准备好的饲养层细胞用PBS洗一遍，换液为NPG小鼠多潜能干细胞培养基。

7)将NPG小鼠多潜能干细胞克隆悬液按适当密度接于饲养层细胞上并摇匀，置于37摄氏度培养箱中进行培养。之后每天更换培养基至下次传代(3-5天后)或冻存。

实验结果见图2-图3，图7，用NPG小鼠多潜能干细胞培养基建立的NPG小鼠多潜能干细胞可以体外长期稳定维持。

(三)NPG小鼠多潜能干细胞常规鉴定方法

1.碱性磷酸酶活性染色鉴定

主要使用的试剂：

Alkaline Phosphatase Detection Kit

PBS缓冲液

实验步骤：

1)除去细胞培养基之后，用PBS洗3遍。

2)按Kit使用说明操作。(http://www.millipore.com/catalogue/item/SCR004#)

2.细胞免疫荧光鉴定

主要使用的试剂：

PBS缓冲液

4％多聚甲醛

封闭液：PBS缓冲液中加入0.2％Triton X100和终浓度为5％二抗血清

抗体稀释液：PBS缓冲液+0.1％的BSA

DAPI溶液：1μg/ml

实验步骤：

1)除去细胞培养基之后，用PBS洗3遍。

2)用4％多聚甲醛进行固定。(室温20分钟或4摄氏度过夜)

3)吸出多聚甲醛，用PBS缓冲液洗3遍，每遍5分钟。

4)加入封闭液封闭。(室温60分钟或4摄氏度过夜)

5)吸出封闭液，用PBS缓冲液洗3遍，每遍5分钟。

6)加入一抗(Oct4(Abcam),Nanog(R&D),Sox2(Santa Cruz),SSEA-1(millipore))(按1：50-1：200进行稀释)。(37摄氏度2小时或4摄氏度过夜)

7)吸出一抗，用抗体稀释液洗洗3遍，每遍5分钟。

8)加入二抗(donkey anti rabbit rhodamine(Santa Cruz),donkey anti goatrhodamine(Santa Cruz),goat anti mouse rhodamine(Santa Cruz)。(按1：50-1：200进行稀释)。(于避光处37摄氏度2小时或4摄氏度过夜)

9)吸出二抗，用抗体稀释液洗3遍，每遍5分钟。

10)加入DAPI溶液染细胞核，于室温染1-5分钟。

11)吸出DAPI溶液，用抗体稀释液洗3遍，每遍5分钟。

12)加入抗体稀释液，荧光显微镜下观察或于4摄氏度避光保存。

3.细胞总RNA提取

主要使用的试剂：

Trizol试剂

异丙醇

氯仿

DEPC水

75％乙醇：DEPC水配制

无水乙醇

实验步骤：

1)除去细胞培养基之后，用PBS洗3遍。

2)加入与培养基等体积的Trizol试剂，室温放置10分钟。将细胞裂解液转移至1.5ml离心管中。

3)加入氯仿(体积为Trizol的1/4)剧烈震荡约15秒。室温放置2-3分钟。

4)于4摄氏度离心10分钟，离心力为12000g。

5)转移上清至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。

6)于4摄氏度离心10分钟，离心力为12000g。

7)弃去上清，加入75％乙醇0.5ml洗1-2次

8)于4摄氏度离心5分钟，离心力为7500g。

9)弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上晾干乙醇。

10)加入DEPC水10μl于37摄氏度溶解。

4.RNA反转录为cDNA

主要使用的试剂：

cDNA反转录试剂盒A3500(Promega)

实验步骤：

1)配置反应体系(20μl)

2)将此体系混合液在室温放置10分钟，然后放入PCR仪，42摄氏度孵育15分钟，95摄氏度5分钟。

3)反应终止后将得到的cDNA溶液测定浓度后置于-20摄氏度保存。

5.细胞基因组DNA提取

主要使用的试剂：

细胞裂解液：100ml体系含蛋白酶K 100μg/ml,0.2％SDS，20mM EDTA，10mM Tris，0.1M NaCl

实验步骤：

1)将细胞用胰酶消化后重悬于预冷PBS中。

2)于4摄氏度离心10分钟收集细胞。离心力为1500rpm

3)加入细胞裂解液400μl，50摄氏度震荡1小时

4)待体系冷却到室温后，加入1/10体积饱和NaCl，反复颠倒混匀约10分钟。

5)将离心管置于冰上冷却约20-30分钟。

6)于4摄氏度离心15分钟。离心力为4000g

7)将上清转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇，混匀。

8)将离心管置于冰上冷却约20分钟。

9)于4摄氏度离心15分钟。离心力为13000rpm

10)吸出上清，于室温通风干燥基因组DNA沉淀。

11)加入30-50ul无菌水进行过夜溶解。

6.多聚酶链式反应(PCR)分析

主要使用的试剂：

2×EasyTaq PCR Supermix(北京全式金生物技术有限公司)

实验步骤：

1)配置反应体系(200μl)

2)设定反应条件

3)PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检验

7.实时定量多聚酶链式反应(RT-PCR分析)

主要使用的试剂：

细胞裂解液：100ml体系含蛋白酶K 100μg/ml,0.2％SDS，20mMEDTA，10mM Tris，0.1M NaCl

实验步骤：

PCR在ABI Prism 7300 Sequence Detection System上用Power Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)体系完成.数据分析采用delta-delta Ct法。

8.畸胎瘤实验

实验步骤：

1)将欲进行畸胎瘤注射的靶细胞重悬于D/F12培养基中，按一块6cm培养皿的细胞对应一个位点注射入NOD/SCID免疫缺陷小鼠(北京维通达生物技术有限公司)腹腔或皮下。

2)待移植部位出现明显畸胎瘤生成后将小鼠断颈处死。用解剖键和解剖镊分离取出畸胎瘤。

3)将畸胎瘤置于4％多聚甲醛中进行固定，石蜡包埋切片染色观察。

9.NPG小鼠多潜能干细胞注入C57小鼠8细胞期或囊胚期胚胎嵌合实验

实验步骤：

7-10个NPG小鼠多潜能干细胞显微注射到C57小鼠(北京维通达生物技术有限公司)8细胞胚胎中(交配后2.5天(2.5dpc)雌鼠中分离得到)或者NPG小鼠多潜能干细胞显微注射到C57小鼠囊胚中(3.5dpc雌鼠中分离得到)，培养一天后，囊胚或8细胞胚胎分别移植到2.5dpc或0.5dpc CD-1假孕雌鼠体内(每个输卵管或子宫角内6-8个胚胎)令其继续发育出生为嵌合小鼠。

10.NPG小鼠多潜能干细胞NPG特征性基因突变型检测

实验步骤：

1)基因组DNA的准备

见：“(一)NPG小鼠多潜能干细胞常规鉴定方法”中“5.基因组DNA提取”

2)PRKDC点突变PCR反应体系(10μl)

3)IL2RG敲除PCR反应体系(10μl)

4)设定反应条件

11.NPG小鼠多潜能干细胞核型分析

本发明采用的为常规核型分析步骤(北京维通达生物技术有限公司产品说明书)。

12.RNA-SEQ分析

本发明采用的为常规RNA-SEQ分析步骤，建库采用Illumina mRNA-seqPrep Kit(Illumina)。测序使用Illumina HiSeq 2500(Illumina)。

实验结果见图4-图7，用NPG小鼠多潜能干细胞培养基建立的NPG小鼠多潜能干细胞具备小鼠多潜能干细胞所有典型特征。

因此，本发明包括以下方面：

1.得到的NPG小鼠多潜能干细胞具备以下性质：

(1)表达多潜能性相关标志基因，如内源Oct4，Sox2,Nanog，Sall4，Dnmt3b，Dppa2，Cripto等等。

(2)碱性磷酸酶染色强阳性，表达多种细胞内和细胞膜表面多潜能性相关标志蛋白，如细胞内的OCT4，SOX2，NANOG，细胞膜表面的SSEA-1等。

(3)具有形成畸胎瘤的能力，畸胎瘤可检测到三胚层细胞。

(4)长期传代(>15代)后仍具正常核型。

(5)具备嵌合或种系传递能力。

(6)携带高度免疫缺陷基因突变，如PRKDC以及IL2RG功能性缺失突变。

(7)NPG小鼠多潜能干细胞来源可为从早期胚胎建立的胚胎干细胞，也可以为通过重编程方法获得的可诱导多潜能干细胞。

其中符合(5)(6)(7)条中的至少一条。

2.获得高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞的方法：

(1)初始细胞来源：可以是从高度免疫缺陷小鼠早期胚胎建立的胚胎干细胞，也可是适用于重编程技术的高度免疫缺陷小鼠体细胞，通过外源基因介导的重编程，或由化学小分子等不依赖外源基因的方法进行重编程，在后期使用本发明条件，得到1中所述性质的细胞。高度免疫缺陷小鼠细胞来源不仅限于NPG品系小鼠，还包括具有类似高度免疫缺陷性质的NOD-scid,B2m^-/-,NOD-scidB2m^-/-,Tg(HLA-A2),NOD-scidTg(HLA-A2),BALB/c-Rag2^-/-Il2rg^-/-,Rag1^-/-,NOD-scid IL2rg^-/-,IL2rg^-/-,NOD-Rag1^-/-Il2rg^-/-，NOD-Rag1^-/-,Prf1^-/-,NOD-Rag1^-/-Prf1^-/-,Tg(SOD1-G93A)1Gur,Dmd^mdx-5Cv,NOD-Rag1^-/-Tg(SOD1-G93A)1Gur,NOD-Rag1^-/-Ins2^Akita,Ins2^Akita,NOD-Rag1^-/-Dmd^mdx-5Cv品系小鼠等。

(2)在获得高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞过程中所使用的信号通路调控因子组合。主要涉及以下信号通路之间的组合：最关键的是WNT信号通路调控因子，LIF/STAT3通路调控因子,MAPK通路抑制因子以及Vitamin C相关下游信号通路调控因子。调控因子类型可以是细胞因子，化学小分子，转录因子，胞外基质等可以作用于上述信号通路的物质。

例如，本发明可以使用下述GSK3-beta抑制剂：

例如，本发明可以使用下述MAPK抑制剂：

例如，本发明可以使用下述Vitamin C及其衍生物：

(3)基础培养液包括D/F12，K-DMEM,KSR,FBS，N2,B27等适用于常规干细胞培养的培养液之间的组合。例如其中常用浓度配比为D/F12：KSR＝9：1–3：1，K-DMEM：KSR＝9：1–3：1，D/F12：FBS＝9：1–3：1，K-DMEM：FBS＝9：1–3：1。N2，B27按生产厂家建议的常规用量添加。

(4)根据上述以上设计使用的一种高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞培养基：knock-out DMEM+N2(100x)/B27(50x)，1％双抗(青/链霉素)，0.1mMβ－巯基乙醇，1mM谷氨酰胺，1％非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，3μM CHIR99021，0.5μMPD0325901，Vitamin C(50μg/ml)，LIF(10ng/ml)。

其中基础培养液条件可更换为(3)中所述任意组合。

(5)上述高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞培养基培养基使用范围：高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞诱导，包括从早期胚胎建系以及在体细胞重编程后阶段处理。处理时间一般为5-7天。高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞常规培养，包括有饲养层体系和无饲养层培养体系。

3.高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞的应用

利用2中所述的方法获得的具有1中所述性质的高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞可以被应用于以下方面：

(1)生产高度免疫缺陷小鼠动物模型。

(2)对这种高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞进行基因修饰，包括但不限于使用转基因，TALEN，CRISPER/CAS9,ZFN等方法。

(3)通过对这种高度免疫缺陷小鼠多潜能干细胞进行基因修饰生成新的免疫缺陷小鼠动物模型。

(4)利用上述方法生产出的高度免疫缺陷小鼠动物模型可应用于人源细胞或组织移植，肿瘤生物学，人源化抗体制造，人类传染病研究，造血及免疫学研究，新的人源化动物模型研发等研究领域。

参考文献：

Bente,D.A.,Melkus,M.W.,Garcia,J.V.,and Rico-Hesse,R.(2005).Denguefever in humanized NOD/SCID mice.J Virol 79,13797-13799.

Blunt,T.,Finnie,N.J.,Taccioli,G.E.,Smith,G.C.,Demengeot,J.,Gottlieb,T.M.,Mizuta,R.,Varghese,A.J.,Alt,F.W.,Jeggo,P.A.,et al.(1995).Defective DNA-dependent protein kinase activity is linked to V(D)Jrecombination and DNA repair defects associated with the murine scidmutation.Cell 80,813-823.

Cao,X.,Shores,E.W.,Hu-Li,J.,Anver,M.R.,Kelsall,B.L.,Russell,S.M.,Drago,J.,Noguchi,M.,Grinberg,A.,Bloom,E.T.,et al.(1995).Defectivelymphoid development in mice lacking expression of the common cytokinereceptor gamma chain.Immunity 2,223-238.

Chen,J.,Guo,L.,Zhang,L.,Wu,H.,Yang,J.,Liu,H.,Wang,X.,Hu,X.,Gu,T.,Zhou,Z.,et al.(2013a).Vitamin C modulates TET1 function duringsomatic cell reprogramming.Nat Genet 45,1504-1509.

Chen,J.,Liu,H.,Liu,J.,Qi,J.,Wei,B.,Yang,J.,Liang,H.,Chen,Y.,Wu,Y.,Guo,L.,et al.(2013b).H3K9 methylation is a barrier during somatic cellreprogramming into iPSCs.Nat Genet 45,34-42.

Cong,L.,and Zhang,F.(2015).Genome engineering using CRISPR-Cas9system.Methods Mol Biol 1239,197-217.

Devoy,A.,Bunton-Stasyshyn,R.K.,Tybulewicz,V.L.,Smith,A.J.,and Fisher,E.M.(2012).Genomically humanized mice:technologies and promises.NatRev Genet 13,14-20.

Esteban,M.A.,and Pei,D.(2012).Vitamin C improves the quality of somaticcell reprogramming.Nat Genet 44,366-367.

Evans,M.J.,and Kaufman,M.H.(1981).Establishment in culture ofpluripotential cells from mouse embryos.Nature 292,154-156.

Gao,Y.,Han,Z.,Li,Q.,Wu,Y.,Shi,X.,Ai,Z.,Du,J.,Li,W.,Guo,Z.,andZhang,Y.(2015).Vitamin C induces a pluripotent state in mouse embryonicstem cells by modulating microRNA expression.Febs J 282,685-699.

Gao,Y.,Yang,L.,Chen,L.,Wang,X.,Wu,H.,Ai,Z.,Du,J.,Liu,Y.,Shi,X.,Wu,Y.,et al.(2013).Vitamin C facilitates pluripotent stem cell maintenanceby promoting pluripotency gene transcription.Biochimie 95,2107-2113.

Hou,P.,Li,Y.,Zhang,X.,Liu,C.,Guan,J.,Li,H.,Zhao,T.,Ye,J.,Yang,W.,Liu,K.,et al.(2013).Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cellsby small-molecule compounds.Science 341,651-654.

Ito,M.,Hiramatsu,H.,Kobayashi,K.,Suzue,K.,Kawahata,M.,Hioki,K.,Ueyama,Y.,Koyanagi,Y.,Sugamura,K.,Tsuji,K.,et al.(2002).NOD/SCID/gamma(c)(null)mouse:an excellent recipient mouse model forengraftment of human cells.Blood 100,3175-3182.

King,M.,Pearson,T.,Rossini,A.A.,Shultz,L.D.,and Greiner,D.L.(2008).Humanized mice for the study of type 1 diabetes and beta cell function.Ann NY Acad Sci 1150,46-53.

Koo,G.C.,Hasan,A.,and O'Reilly,R.J.(2009).Use of humanized severecombined immunodeficient mice for human vaccine development.Expert RevVaccines 8,113-120.

Kumar,P.,Ban,H.S.,Kim,S.S.,Wu,H.,Pearson,T.,Greiner,D.L.,Laouar,A.,Yao,J.,Haridas,V.,Habiro,K.,et al.(2008).T cell-specific siRNAdelivery suppresses HIV-1 infection in humanized mice.Cell 134,577-586.

Martin,G.R.(1981).Isolation of a pluripotent cell line from early mouseembryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.ProcNatl Acad Sci U S A 78,7634-7638.

Pera,M.F.(2013).Epigenetics,vitamin supplements and cellularreprogramming.Nat Genet 45,1412-1413.

Sato,K.,Misawa,N.,Nie,C.,Satou,Y.,Iwakiri,D.,Matsuoka,M.,Takahashi,R.,Kuzushima,K.,Ito,M.,Takada,K.,et al.(2011).A novel animal model ofEpstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis inhumanized mice.Blood 117,5663-5673.

Shi,Y.,Zhao,Y.,and Deng,H.(2010).Powering reprogramming with vitaminC.Cell Stem Cell 6,1-2.

Shultz,L.D.,Ishikawa,F.,and Greiner,D.L.(2007).Humanized mice intranslational biomedical research.Nat Rev Immunol 7,118-130.

Shultz,L.D.,Schweitzer,P.A.,Christianson,S.W.,Gott,B.,Schweitzer,I.B.,Tennent,B.,McKenna,S.,Mobraaten,L.,Rajan,T.V.,Greiner,D.L.,et al.(1995).Multiple defects in innate and adaptive immunologic function inNOD/LtSz-scid mice.J Immunol 154,180-191.

Sun,X.,Xu,J.,Lu,H.,Liu,W.,Miao,Z.,Sui,X.,Liu,H.,Su,L.,Du,W.,He,Q.,et al.(2013).Directed differentiation of human embryonic stem cells intothymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymicmicroenvironment in vivo.Cell Stem Cell 13,230-236.

Sun,Z.,Denton,P.W.,Estes,J.D.,Othieno,F.A.,Wei,B.L.,Wege,A.K.,Melkus,M.W.,Padgett-Thomas,A.,Zupancic,M.,Haase,A.T.,et al.(2007).Intrarectal transmission,systemic infection,and CD4+T cell depletion inhumanized mice infected with HIV-1.J Exp Med 204,705-714.

Yajima,M.,Imadome,K.,Nakagawa,A.,Watanabe,S.,Terashima,K.,

Nakamura,H.,Ito,M.,Shimizu,N.,Yamamoto,N.,and Fujiwara,S.(2009).Tcell-mediated control of Epstein-Barr virus infection in humanized mice.JInfect Dis 200,1611-1615.

Ying,Q.L.,Wray,J.,Nichols,J.,Batlle-Morera,L.,Doble,B.,Woodgett,J.,Cohen,P.,and Smith,A.(2008).The ground state of embryonic stem cellself-renewal.Nature 453,519-523.

Claims (10)

1.一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的组合物，所述组合物包含：干细胞基础培养基；和维生素C或其衍生物，其中

(1)优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选是选自以下品系小鼠组成的组的免疫缺陷小鼠：NOD-scid Il2rg^–/–(NPG)，NOD-scid,B2m^-/-,NOD-scidB2m^-/-,Tg(HLA-A2),NOD-scidTg(HLA-A2),BALB/c-Rag2^-/-Il2rg^-/-,Rag1^-/-,NOD-scid IL2rg^-/-,IL2rg^-/-,NOD-Rag1^-/-Il2rg^-/-，NOD-Rag1^-/-,Prf1^-/-,NOD-Rag1^-/-Prf1^-/-,Tg(SOD1-G93A)1Gur,Dmd^mdx-5Cv,NOD-Rag1^-/-Tg(SOD1-G93A)1Gur,NOD-Rag1^-/-Ins2^Akita,Ins2^Akita,NOD-Rag1^-/-Dmd^mdx-5Cv；

(2)优选所述干细胞基础培养基是传统2i/LIF培养条件下使用的培养基，更优选包含选自以下组成的组的干细胞培养基：D/F12，K-DMEM,KSR,FBS，N2，B27和它们的组合；和/或

(3)优选所述组合物包含选自由以下表示的维生素C或其衍生物：

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含另外的信号通路调控因子或联合另外的信号通路调控因子使用，优选所述信号通路调控因子选自WNT信号通路调控因子、LIF/STAT3通路调控因子、MAPK通路抑制因子、维生素C相关下游信号通路调控因子和它们的组合，优选GSK3-beta抑制剂或MAPK抑制剂，优选所述调控因子是作用于上述信号通路的细胞因子、化学小分子、转录因子或胞外基质。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含：knock-outDMEM+N2(100x)/B27(50x)，双抗(青霉素/链霉素)，β-巯基乙醇，谷氨酰胺，非必需氨基酸(Non-essential Amino Acids)，CHIR99021，PD0325901，LIF和维生素C。

4.一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，任选地还包含另外的干细胞诱导因子，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠。

5.一种用于制备哺乳动物的多潜能干细胞的方法，所述方法包括在根据权利要求1-3中任一项所述的组合物的存在下培养初始哺乳动物细胞，优选所述初始哺乳动物细胞是哺乳动物早期胚胎(囊胚)建立的胚胎干细胞或适合于通过重编程技术获得多潜能干细胞的体细胞，其中对于体细胞而言，在通过重编程技术获得多潜能干细胞的后期使用所述方法，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠；优选所述培养是在有饲养层体系或无饲养层体系下培养。

6.通过根据权利要求5所述的方法获得的哺乳动物多潜能干细胞，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，最优选NPG小鼠，优选所述多潜能干细胞具备以下性质中的一个或多个或全部：

(1)表达多潜能性相关标志基因，如内源Oct4，Sox2,Nanog，Sall4，Dnmt3b，Dppa2，Cripto等等；

(2)碱性磷酸酶染色强阳性，表达多种细胞内和细胞膜表面多潜能性相关标志蛋白，如细胞内的OCT4，SOX2，NANOG，细胞膜表面的SSEA-1等；

(3)具有形成畸胎瘤的能力，畸胎瘤可检测到三胚层细胞；

(4)长期传代(>15代)后仍具正常核型；

(5)具备嵌合或种系传递能力；

(6)携带高度免疫缺陷基因突变，如PRKDC以及IL2RG功能性缺失突变；和

(7)多潜能干细胞来源可为从早期胚胎(囊胚)建立的胚胎干细胞，也可以为通过重编程方法获得的可诱导多潜能干细胞。

7.一种生产哺乳动物模型的方法，优选所述哺乳动物是免疫缺陷哺乳动物，更优选是免疫缺陷小鼠，所述方法包括：用根据权利要求6所述的多潜能干细胞注入所述哺乳动物的胚胎(例如8细胞胚胎)或囊胚中；和/或将获得的胚胎或囊胚移植到哺乳动物体内继续发育成嵌合哺乳动物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是非人灵长类哺乳动物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述多潜能干细胞被进一步基因修饰。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法获得的哺乳动物模型，优选免疫缺陷哺乳动物模型，更优选是免疫缺陷小鼠模型，最优选免疫缺陷NPG小鼠模型。