CN105002096B - 一种土壤磷素微生物活化剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种土壤磷素微生物活化剂及其应用，该微生物活化剂是通过将一种具有解磷能力的菌株与菌株繁殖的载体进行科学复配，经发酵而制成的。该磷素微生物活化剂表现出良好的解磷效果，此活化剂的制备对于提高土壤中生物可利用的磷含量具有重要的意义。此外，该磷素活化菌剂的研制不仅可以大幅度提高土壤中的磷素利用效率，提高产量，减少环境污染，从另一方面也节约了大量的磷矿资源。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种用于活化土壤中磷素的微生物制剂。
背景技术
磷是植物生长所必需的重要营养素之一，如何能使土壤中的磷成为有效磷是当前国内外非常关注的研究领域。磷元素参与植物生长繁殖的诸多过程。磷不仅是植物细胞原生质的重要组成组分，而且还参与植物的光合作用，淀粉和糖的利用和能量的传递过程。磷肥则可以提高植物幼苗期根系细胞生长速度，缩短植物的生长期。据研究，世界上绝大部分农业土壤缺磷(总磷不缺，活性磷缺)，从1950年开始，我国大部分地区开始向土壤中施入化学磷肥，但磷肥利用率很低，磷肥的当季利用率一般只有10％～20％，我国农田中约2/3严重缺磷，土壤中95％以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用，为了获取高产每一年都向土壤重复施加大批量的可溶性磷肥，然而因为土壤的板结等原因，作物对施入的磷肥当季节利用效率只有5％～10％，大部分与土壤中的Ca2+，Fe2+，Fe3+，Al3+结合形成难溶性磷酸盐。自1950年以来，为了提高土壤磷素的利用率国内外学者做了大量研究，其中解磷菌是一类具有将难溶性磷盐转化为可溶性磷盐的微生物，国内外已有许多研究发现，解磷菌不仅可以大幅度提高土壤中的磷利用效率，提高产量，从另一方面也能节约大量的磷矿资源。
目前，对于细菌解磷特性的生理学和遗传学知识还了解得极少，尤其是在指示和调节方面。对根际细菌性磷循环机制的了解还停留在早期的水平。但这方面的研究在农业上的应用是巨大的，尤其是长期传统磷肥的施用使得土壤中储存的磷数量大增。而磷素在土壤中的过度积累不仅降低了磷肥的生产效益，而且引起环境问题，如水体富养化及养分不平衡。
20世纪80年代以后，国内许多单位相继开发出了有多种芽孢杆菌组成的复合 解磷菌制剂，但由于解磷细菌的遗传稳定性差，这些菌剂在生产上使用的效果并不理想。因此，寻求一种稳定高效的解磷微生物制剂来开采利用土壤中储存的磷素则是缓解磷肥需求矛盾，减少磷对环境的污染的途径之一。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有技术不足提供一种制法简单且高效的活化磷素的微生物制剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
上述的一种土壤磷素微生物活化剂，是将一种具有解磷能力的菌株与菌株繁殖的载体进行科学复配，经发酵制成的。
上述该活化剂的活菌总数大于2×108CFU/g。
其中，上述的具有解磷能力的菌株是黑色真菌菌株毛霉，其保藏编号为CGMCCNo.9637。
其中，上述菌株繁殖的载体包括但不限于麦麸、豆粕、硅藻土、玉米粉、土壤、米糠、活性炭、锯末的一种或几种。
其中，所述菌株繁殖的载体是将米糠、活性炭、锯末按一定的比例混合而成。
可优化为，所述繁殖载体是将米糠、活性炭、锯末按照质量比为2～3∶1～2∶1混合而制成。
更进一步优化为，所述繁殖载体是将米糠、活性炭、锯末按照质量比为3∶1∶1混合而制成。
其中，制备上述磷素微生物活化剂时按解磷菌与菌株繁殖的载体质量比为0.26～1.82∶1进行配比混合发酵。
其中，制备上述磷素微生物活化剂时优化为，按解磷菌与菌株繁殖的载体质量比为1.25∶1进行配比混合。
其中，所述解磷菌与菌株繁殖的载体混合后进行发酵时，发酵条件控制为：发酵温度28℃～32℃，发酵时间2～6天。
可优化为，所述发酵条件控制为：发酵温度30℃，发酵时间4天。
进一步地，本发明的另一目的是提供一种大量制备上述高效的活化磷素的微 生物制剂的方法。
上述方法，包括如下步骤：
1)将一种具有解磷能力的菌株与菌株繁殖的载体进行科学复配进行发酵，逐级扩大培养，获得长有大量菌体的饼土母剂；
2)培制出来的母剂作为接种剂，接种大堆堆料，进一步扩大培制，将制得菌剂风干或在40℃以下烘干。
更近一步地，本发明的再一目的在于提供上述微生物制剂在提高土壤中磷素的利用效率上的应用。
其中，上述微生物制剂用作基肥、拌种或用做追肥施用于作物生长区域。
其中，上述作物生长区域包括农田、林场或景观苗圃。
本发明的磷素微生物活化剂具有良好的解磷效果，可通过实施例中的解磷实验可知，该制剂优先利用可溶性磷，当可溶性磷利用殆尽时，启动解磷机制，将难溶性磷转化为可溶性磷，从而使溶液中可溶性磷的含量提高，可溶性磷含量的提高能促进植物对磷素的吸收和利用，进而可促进作物的生长提高作物产量。可见，本发明提供的磷素微生物活化剂对发展持续高效农业具有深远意义。
此外，利用该解磷微生物制剂来开采土壤中储存的磷素是缓解磷肥需求矛盾，减少磷对环境的污染的一个有效途径。
附图说明
图1为黑色真菌菌株毛霉显微示意图；
图2为磷的标准曲线图；
图3A和图3B为制得的解磷微生物菌剂外观图；图3A为菌剂制备过程发酵情况，图3B为菌剂成品，从左到右为米糠、锯末、活性炭的质量比为3∶1∶1，1∶2∶1，2∶2∶1；
图4为接菌量对有效磷增量的影响柱状图；
图5为发酵温度对有效磷增量的影响柱状图；
图6为发酵时间对有效磷增量的影响柱状图；以及
图7为3种微生物制剂解解磷动态图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
实施例1 磷素活化微生物制剂制备参数筛选
1.1试验材料
1.1.1试验菌株和载体
试验菌株：具有解磷能力的黑色真菌菌株毛霉，上述黑色真菌菌株毛霉已于2014年9月4号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其分类命名毛霉(Mucor sp.)，其保藏编号为CGMCC No.9637，该菌株的显微观察如图1所示；
菌株载体：米糠、活性炭、锯末
1.1.2主要试验仪器
恒温培养箱，DHG-9053A干燥箱，QHZ－98A摇床，722型可见分光光度计，SW-CJ-IB无菌操作台，粉碎机，高压蒸汽灭菌锅，FA1104型电子天平
1.1.3试验试剂
发酵培养液:葡萄糖10克，氯化钾0.3g，氯化钠0.3g，，硫酸铵0.5g，七水合硫酸锰0.3g，七水合硫酸亚铁0.03g，磷矿粉5g，四水硫酸锰0.03g，蒸馏水1000mL，调节溶液pH至中性，磷矿粉不能提前加入到溶液中，要单独灭菌后混合。
无机磷固体培养基:琼脂18-20g加入到无机磷发酵培养液中。
钼锑贮存溶液：准确量取153mL浓H2SO4，徐徐加入到装有400mL蒸馏水的烧杯中，自然冷却至室温。在300mL水(约60℃)中溶解钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·H2O，研磨细]10g，自然冷却。将硫酸溶液徐徐加入到钼酸铵溶液中，加入100mL的0.5％酒石酸锑钾[KSbOC4H4O6·1/2H2O]溶液，冷却后，用水稀释至1L，充分摇匀，于棕色试剂瓶中保存，此贮存液含1％钼酸铵，2.75mol/LH2SO4。
钼锑抗显色剂：于100mL钼锑贮存溶液中溶解1.50g抗坏血酸，这种溶液
5mg/L磷标准溶液：准确称取0.4394g KH2PO4(于50℃烘干)溶于100mL水中，加入浓硫酸5mL(防腐)，用蒸馏水定容到1000mL，此磷标准溶液浓度为100mg/L，此溶液能长期保存。吸取100mg/L的磷标准溶液10mL于200mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至标线，则为5mg/L的磷标准溶液，此溶液现配现用。
1.2试验方法
1.2.1菌株的活化
为了使待试菌株恢复繁殖活性，要进行菌株的活化。取待试菌株培养基，刮取菌落表面的菌丝溶于已湿热灭菌的装有1000mL无菌水三角瓶中，至可见瓶中有黑色悬浮孢子为宜，充分打散摇匀备用。
1.2.2得到适宜单因素参数后微生物菌剂的制备
按照前期筛选出的适宜载体比例设计载体配比，混匀，称取25g加入到250mL三角瓶中，具棉塞于120℃高压湿热灭菌，取出冷却。于无菌工作台取1mL上述已制备好的菌悬液均匀接种于各比例的三角瓶中，同时加入5mL的无机磷培养液，混匀，每种比例设三组平行，同时用不接菌液的相应比例载体做空白。将配置好的载体按照筛选出的各适宜单因素培养，与干燥箱中32℃通风烘干48h，取出用粉碎机粉碎保存。
1.2.3有效磷的测定方法
标准曲线的绘制：分别准确吸取0、2、4、6、8、10mL的5mg/L磷标准溶液于50mL容量瓶中，加入等体积的空白溶液，滴入二硝基酚指示剂2～3滴，用盐酸溶液调节溶液至微黄色，准确加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀，加蒸馏水定容至标线，即得磷含量为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/、1.0mg/L的标准溶液系列。摇匀后于室温15℃以上，显色30min。于可见波长700nm处，测定其吸光度，以磷浓度(mg/L)为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
可溶性磷测定：将待测液体(由于较浑浊静止后取上清)移至25mL比色管中，用水稀释至标线。吸取已稀释的待测液2.5mL于50mL比色管中，加水稀释至比色管总体积的五分之三处，滴入二硝基酚指示剂1～2滴，并用NAOH调节 颜色刚呈微黄色，加入5mL钼锑抗显色剂，充分混匀，加蒸馏水定容至标线，室温15℃以上，显色30min。在700nm波长下，以空白(不接菌体)的为参比液调零，进行比色测定，从标准曲线上查得相应的含磷量，标准曲线见图2。
为了更直观的比较摇瓶实验中有效磷的增加量，定义：
解磷率＝增加的有效磷含量(mg/L)/空白的有效磷含量(mg/L)。
1.2.4菌剂适宜载体的筛选及参数优化
选择米糠，锯末，活性炭作为供试载体，筛选适宜载体配比，设计质量比例分别为1∶3∶1，2∶2∶1，3∶1∶1，按比例称取后充分混匀，准确称取25g加入到三角瓶(250mL)中，具棉塞，于120℃高压湿热灭菌，取出冷却。在无菌环境下取1mL上述已制备好菌悬液均匀接种于各比例的三角瓶中，同时均匀加入5mL的无机磷培养液，每种比例设三组平行，同时用不接菌液的相应比例载体做空白。将配置好的三角瓶于26℃恒温培养箱中培养72h，然后在干燥箱中32℃通风烘干48h，取出用粉碎机粉碎。取上述制备好的菌剂1g于250mL三角瓶中，加入150mL无机磷培养液，于摇床140r/min，26℃恒温培养72h，用钼锑抗比色法测定有效磷浓度(具体操作方法参见1.2.3)。
选择米糠，锯末，活性炭作为供试载体，筛选适应载体配比，设计质量比例分别为1∶3∶1，2∶2∶1，3∶1∶1，制成的菌剂为为灰黑色粉末状，质地松软，有轻微发酵气味，摇晃可见有球状菌落聚集体，如图3A和图3B所示。
通过图3A和图3B可知，从发酵过程来看，3∶1∶1载体的菌生长状况最好，菌丝生长最茂盛，并覆盖大量载体，其他比例相比较没有其生长好。菌剂制成后，3∶1∶1比例的菌剂颜色较黑，对不同载体配比获得微生物菌剂的活菌数进行研究。
准确称取烘干后的菌剂1.0g加入9mL无菌水后立即摇匀，使微生物细胞分散完全，即为浓度10-1的稀释液；取1mL移液管(已湿热灭菌)，吸取1mL浓度10-1稀释液于试管中，移入9mL无菌水，为使菌液充分混合均匀，重复吹吸三次，此时稀释液浓度为10-2；按照这种方法连续稀释菌液浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。将已灭过菌的平板编上号码10-7、10-8、10-9，吸取浓度10-7、10-8、10-9的稀释液1mL放入对应编号的3个平板中，每一浓度设置 三组重复。然后将已冷却至50℃左右的无机磷培养基倒入平板，慢慢旋动至菌液和培养基均匀混合，冷疑，倒置于30℃恒温箱中培养。长出菌落后则可计数，结果如表1。
表1不同载体配比的活菌量
由表1可知，在10×-8这一稀释比例中，米糠∶锯末∶活性炭的比例为3∶1∶1时测得的活菌数最多，2∶2∶1的活菌数次之，1∶3∶1的活菌数相比较最少。分析可知载体中营养成分的含量高低应该是制约活菌数的关键因素，米糠中含有微生物需要的较多营养物质，米糠中平均含16％-22％脂肪，15％蛋白质，10％水分，3％-8％糖，热量125.1KJ/g。相比较其他单一载体更能满足微生物正常的生长需要，故米糠含量多的载体活菌数较多。活性炭本身含有较少微生物生长繁殖所需要的营养物质，在载体中主要起到增加通气量的作用，在微生物数量不饱和时，对微生物的影响较小。锯末中含有的营养物质较米糠中少，对微生物的影响比米糠较小。根据微生物菌剂标准，粉末菌剂活菌数目达到2×108CFU/g为合格，由表格可知2∶2∶1和3∶1∶1的载体都符合菌剂制备要求。
1.2.5解磷微生物接种适宜用量的筛选
设计米糠，锯末，活性炭质量比例为3∶1∶1，混匀，取25g于250mL三角瓶中，具棉塞120℃高压湿热灭菌，取出后自然冷却。于超净工作台按梯度浓度1，3，5，7mL均匀加入菌悬液于三角瓶中，同时加入5mL的无机磷培养液混匀，于26℃恒温培养箱中发酵72h，取出32℃通风烘干，粉碎保存。取制备好的1g菌剂于250mL三角瓶中，加入150mL无机磷培养液，以纱布扎口，于摇床140r/min，26℃摇床培养72h后用钼锑抗比色法测其有效磷浓度(具体操作方法参见1.2.3)，同时设3组平行实验，实验结果见图4。
由图4可知，当接种菌含量为32.5×108时，摇瓶中的有效磷含量增加率最大，达到88％。接种量较少时，由于初生菌体较少，较短时间内无法发酵出足够数量的解磷菌，影响解磷效果，接种量较多则会影响菌的生长条件，比如营养，氧气等。有限的营养对菌体的繁殖造成影响，菌之间的生存竞争较大，故接种菌量为32.5×108的接种量最佳。
1.2.6发酵温度的筛选
设计米糠∶锯末∶活性炭3∶1∶1的比例配制载体，拌匀，取25g载体于250mL三角瓶中具塞，120℃湿热灭菌，取出冷却。加入1mL的菌悬液，5mL的无机磷培养液，于26℃，28℃，30℃，32℃，34℃的培养箱中发酵72h，通风烘干，用粉碎机粉碎。准确称取1g菌剂于三角瓶中，加入150mL无机磷培养液，于140r/min，26℃下摇床培养72h后用钼锑抗比色法测定有效磷浓度(具体操作方法参见1.2.3)，每组温度设三组平行，结果见图5。
由图5知，当发酵温度为30℃时，有效磷的增加率最大，达到了95％，从26℃到30℃，微生物的解磷能力随着温度的上升而升高。30℃以后，温度继续升高对微生物生长产生不利影响，解磷效果有一定的下降，温度过高时，加速了菌体的老化。温度较低时，影响菌体中的酶活性，解磷效果也不理想。总体可以看出低温对于解磷菌株的影响较高温更明显，此解磷菌有可能是耐一定高温的，温度在发酵过程中起到的限制作用较大，应该重点控制。
1.2.7发酵时间的筛选
设计米糠∶锯末∶活性炭质量比例为3∶1∶1比例配制载体，，每瓶装入25g，具塞120℃湿热灭菌，取出冷却。每瓶加入1mL的菌悬液，150mL的无机磷培养液置于26℃的恒温培养箱中分别发酵2，4，6天，取出通风烘干粉碎。准确称取1g菌剂于三角瓶中，加入150mL无机磷培养液，于140r/min，26℃下摇床培养72h后用钼锑抗比色法测定有效磷浓度(具体操作方法参见1.2.3)，每组温度设三组平行，实验结果见图6。
由图6可以看出，随着发酵的进行，磷含量逐渐增加，至第4d天达到了峰值15mg/L，继续发酵，由于解磷菌的生物量增多，需要的营养物质增多，氧气增 多，摇瓶中有限的磷不足以满足微生物生长繁殖所需要的磷含量，个体之间出现生存竞争，从而一部分磷被微生物自身利用掉，因此有效磷的含量有一定程度的下降，由此可以推断，磷肥的使用应适量，过量的使用可能不能促进生物的生长，反而会对植物的生长产生不利的影响。
实施例2 三种磷素微生物活化剂解磷效果
所需试剂配制参见实施例1
2.1菌剂解磷效果试验
准确称取1g菌剂于三角瓶中，加入150mL无机磷培养液，于140r/min，26℃下摇床培养72h后用钼锑抗比色法测定有效磷浓度(具体操作方法参见1.2.3)，同时设3组平行实验，实验结果见图7。
由图7分析可知，三种载体的的有效磷含量总体趋势可以分为两个阶段，及先是下降，到达一个谷点后，以更快的速度上升。这也是符合微生物的生长规律，当摇瓶中有较容易利用的磷时，此时微生物分解难溶性磷的能力较小，而是优先利用存在的可溶性磷，从而满足自身生长繁殖对于磷含量的需要。直至摇瓶中的磷利用将要殆尽时，不能满足其需要，这时解磷菌启动解磷机制，开始分解难溶性的磷盐为可溶性的磷盐，摇瓶中的有效磷含量迅速上升。具体分析每种载体比例，米糠∶锯末∶活性炭为1∶3∶1时转折点出现在摇瓶实验的第5d，2∶2∶1的转折点出现在第6d。3∶1∶1出现在第4d，这也正好与前面进行的发酵实验相对应，发酵时间4d时，载体中的活菌数达到最大，故摇瓶中的已存在的磷的利用被吸收掉的最快，比其他载体更快的进入利用难容性磷盐的过程，转折点出现的最早。总体分析，此解磷菌的解磷效果非常明显，24h内可以将摇瓶中的有效磷含量提升到比原来更高的水平。从进入第二阶段的时间及最后的解磷效果来看，米糠∶锯末∶活性炭比例为3∶1∶1时更适宜制成菌剂，制成的菌剂更早的发挥解磷作用并且由较良好的解磷效果。
实施例3 该微生物活化剂应用到土壤中的案例
将通过实施例1筛选得到的磷素活化微生物制剂作为基肥施用于安徽省全椒县小麦示范基地的生长区域，按区域划分为试验组1、2、3，相应区域内没有 使用上述微生物活化剂的分别设为对照组1、2、3，小麦生长过程中采用相同管理水平管理试验组和对照组，结穗后统计生长亩有效穗、单穗小穗数、结实小穗数、退化小穗数、穗粒数、千粒重、预测产量指标，结果见表2：
表2磷素养分活化剂试验小麦预产统计表
通过表2中的的统计结果来看，试验1的亩有效穗较对照1多1.3万穗，多3.6％，单穗总小穗数多1.4个，结实小穗数多1.6个，退化小穗数少0.2个，穗粒数多3.4粒，产量高55.2kg/亩；试验2的亩有效穗较对照2多2.8万穗，多8.4％，单穗总小穗数多0.2个，结实小穗数相等，退化小穗数多0.2个，退化小穗偏多可能与总有效穗偏大有关，穗粒数多0.5粒，产量高36.6kg/亩；试验3因为播种偏迟，于4月21日以后进入扬花期，较试验1、2的4月18日进入扬花期稍迟，但收花期推迟较多，本次调查时依然有少量小花开放，不能进行预产，但调查亩有效穗数较对照3多0.9万穗，多2.8％。
Claims (7)
1.一种土壤磷素微生物活化剂，其特征在于，将一种具有解磷能力的菌株与菌株繁殖的载体进行科学复配，经发酵制成；
其中，所述的具有解磷能力的菌株是黑色真菌菌株毛霉(Mucor sp.)，其保藏编号为CGMCC No.9637；该活化剂的活菌总数为6.5×108CFU/g；
所述繁殖载体是将米糠、活性炭、锯末按照质量比为3:1:1混合而制成。
2.根据权利要求1所述的微生物活化剂，其特征在于，所述发酵条件控制为：发酵温度28℃～32℃，发酵时间2～6天。
3.根据权利要求2所述的微生物活化剂，其特征在于，所述发酵条件控制为：发酵温度30℃，发酵时间4天。
4.一种大规模制备权利要求1～3任一项所述的磷素微生物活化剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将一种具有解磷能力的菌株与菌株繁殖的载体进行科学复配进行发酵，逐级扩大培养，获得长有大量菌体的饼土母剂；
2)培制出来的母剂作为接种剂，接种大堆堆料，进一步扩大培制，将制得菌剂风干或在40℃以下烘干。
5.权利要求1～3任一项所述的微生物活化剂在提高土壤中磷素的利用效率上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该微生物制剂用作基肥、拌种或用做追肥施用于作物生长区域。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述作物生长区域包括农田、林场或景观苗圃。
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