CN105001305A - 利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，包括以下步骤：1)预处理：对含有达托霉素的发酵液进行过滤，使过滤后的达托霉素发酵液的浊度低于预设值；2)提取：将经过步骤1)处理后的发酵液注入装有第一填料的层析柱中进行吸附，所述第一填料是以葡聚糖或琼脂糖为骨架的阴离子交换凝胶填料，吸附后加入洗脱剂将达托霉素洗脱下来；3)精制：将步骤2)得到的洗脱液注入装有第二填料的层析柱中进行吸附，所述第二填料是以聚苯乙烯-二乙烯基苯或键合硅胶为骨架的填料，吸附后加入缓冲盐洗脱溶剂进行洗脱，从而获得高纯度的达托霉素。该方法工艺简单，操作成本低，可得到纯度高达98％的达托霉素终产品。

Description

利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，特别是一种利用反相层析和阴离子交换层析技术提取高纯度达托霉素的方法，属于医药工业废液处理技术领域。

背景技术

达托霉素作为全球第一个成功开发的环脂肽类药物，在抗革兰氏阳性菌作用上有很好的效果，由于其结构复杂，化学全合成困难较多，目前达托霉素全部采用微生物发酵的方法生产。由于其特殊的化学结构，在发酵液提取的过程中，达托霉素会衍变成脱水达托霉素和β-异构达托霉素等杂质。目前工业上采用的纯化方法主要为大孔树脂吸附以及丁醇浸提或离子交换树脂提取的方法，难以制备得到高纯度的达托霉素产品。

目前达托霉素的纯化工艺主要为调节发酵液的pH值后，用有机相进行提取，经过多次萃取合并后，再调节水相pH值进行反萃取，并将水相经过大孔树脂或离子交换树脂进行吸附、洗脱。由于达托霉素特殊的化学结构，在多步骤的纯化过程中容易造成降解，衍变成脱水达托霉素和β-异构达托霉素等杂质。因此纯度难以提高，仅为89％左右。多步骤的纯化工艺以及大量有机试剂的使用，不但增加了生产成本，也对环境造成了污染，工业三废难以排除。

发明内容

本发明目的是：针对上述问题，提供一种利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，该方法工艺简单，操作成本低，可得到纯度达98％的达托霉素终产品。

本发明的技术方案是：所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)预处理：对含有达托霉素的发酵液进行过滤，使过滤后的达托霉素发酵液的浊度低于预设值；

2)提取：将经过步骤1)处理后的发酵液注入装有第一填料的层析柱中进行吸附，所述第一填料是以葡聚糖或琼脂糖为骨架的阴离子交换凝胶填料，吸附后加入洗脱剂将达托霉素洗脱下来；

3)精制：将步骤2)得到的洗脱液注入装有第二填料的层析柱中进行吸附，所述第二填料是以聚苯乙烯-二乙烯基苯或键合硅胶为骨架的填料，吸附后加入缓冲盐洗脱溶剂进行洗脱，从而获得高纯度的达托霉素。

本发明在上述技术方案的基础上，还包括以下优选方案：

在所述步骤1)中，是采用0.45微米滤膜对含有达托霉素的发酵液进行过滤处理的。

所述第一填料的粒径为30微米～500微米。

所述第二填料的粒径为30微米～300微米。

所述步骤2)中的洗脱剂为醋酸铵-氯化钠缓冲液。

在所述步骤2)中，先用醋酸氨水溶液冲洗，再用所述醋酸铵-氯化钠缓冲液将达托霉素洗脱下来。

所述步骤3)中的缓冲盐洗脱溶剂为PBS-乙腈溶液。

该方法还包括以下步骤：

4)浓缩：采用膜过滤技术，经洗脱液浓缩，将步骤3)得到的高纯度达托霉素进行浓缩，除去高纯度达托霉素中的部分盐分；

5)析晶：将浓缩除盐后的溶液冻干，得到干燥的粉末状固体。

所述步骤4)中膜过滤技术采用的是透过分子量为150的纳滤膜。

所述步骤5)中将浓缩除盐后的溶液冻干的过程为：将步骤4)纳滤后的溶液放入零下40度冷冻，然后放入冻干机冻干。

本发明的优点是：本发明经筛选摸索后，采用新型的制备工艺，仅通过两次纯化步骤，即可得到纯度达98％的达托霉素终产品，工艺过程显著减少了有机溶剂的使用，进一步降低了生产和回收成本。在较低的成本下，显著提高达托霉素终产品的纯度和回收率，从而提高产品的市场竞争力。

1.与传统工艺相比，本发明仅采用两次纯化步骤，纯化工艺中显著减少了有机试剂的使用，降低了分离纯化的成本。

2.采用本发明工艺制备的达托霉素终产品，纯度可达98％，较传统工艺在终产物纯度上有较大提高。

3.本发明工艺绿色环保，废液仅为低浓度的盐溶液，不存在三废污染及工业排废的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中达托霉素在步骤2)中的提取图谱，根据信息收集最高峰的全部组份。该图中，横轴表示时间，其单位为min；左边纵轴表示紫外吸收高度，其单位为紫外吸收值mAu；右边纵轴表示溶剂百分比，其单位为B相流动相的浓度百分比；图中黑线为B相流动相浓度百分比的变化曲线，蓝线为不同时间的紫外吸收曲线。这幅图表明了粗品在制备层析时所出的紫外吸收峰形。

图2为本发明实施例中达托霉素在步骤3)中的精制图谱，根据信息收集最高峰的全部组份。该图中，横轴表示时间，其单位为min；左边纵轴表示紫外吸收高度，其单位为紫外吸收值mAu；右边纵轴表示溶剂百分比，其单位为B相流动相的浓度百分比；图中黑线表示B相流动相浓度百分比的变化曲线，蓝线表示不同时间的紫外吸收曲线，47min至59min所显示的线段为收集线对应收集的样品，方便看出图中紫外吸收值所对应的样品。这幅图表明了二次制备层析时所出的紫外吸收峰形。

图3为本发明实施例中达托霉素经过步骤3)精制处理后的分析图。该图中，横轴表示时间，其单位为min；纵轴表示紫外吸收高度，其单位为紫外吸收值mAu；曲线为紫外吸收波长曲线，上面数据主要是显示样品的保留时间及样品中各组分的含量百分比。这幅图表明了最终做出样品的纯度，图中可以看出达托霉素的纯度在98％以上。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

本实施所公开的这种利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，包括以下步骤：

1)预处理：对含有达托霉素的发酵液进行过滤，使过滤后的达托霉素发酵液的浊度低于预设值。

为了获得较佳的过滤效果，一般采用0.45微米滤膜对含有达托霉素的发酵液进行过滤处理。过滤后含达托霉素的发酵液呈透明状态，无固体杂质。

2)提取：将经过步骤1)处理后的发酵液注入装有第一填料的层析柱中进行吸附，所述第一填料是以葡聚糖或琼脂糖为骨架的阴离子交换凝胶填料，吸附后加入洗脱剂将达托霉素洗脱下来。

该步骤2)应用的层析提取方法属于离子交换层析法。

为了获得较佳的层析效果和洗脱效果，本例中所述第一填料的粒径在30微米～500微米之间，所述洗脱剂采用醋酸铵-氯化钠缓冲液。

为了进一步提高洗脱效果，本例在该步骤2)中，先用醋酸氨水溶液冲洗，再用所述醋酸铵-氯化钠缓冲液将达托霉素洗脱下来。

3)精制：将步骤2)得到的洗脱液注入装有第二填料的层析柱中进行吸附，所述第二填料是以聚苯乙烯-二乙烯基苯或键合硅胶为骨架的填料，吸附后加入缓冲盐洗脱溶剂进行洗脱，从而获得高纯度的达托霉素。

该步骤3)应用的层析提取方法属于反向层析法。

为了获得较佳的层析和洗脱效果，本例中所述第二填料的粒径在30微米～300微米之间，而且所述缓冲盐洗脱溶剂采用PBS-乙腈溶液。

从图3中可以看出，本实施例这种方法提取出来的达托霉素纯度达到了98％以上。

为了方便将提取出来的高纯度达托霉素保存起来，本例实施例还进行了如下的步骤4)和步骤5)操作：

4)浓缩：采用膜过滤技术，经洗脱液浓缩，将步骤3)得到的高纯度达托霉素进行浓缩，除去高纯度达托霉素中的大部分盐分。该步骤4)中膜过滤技术采用的是透过分子量为150的纳滤膜。

5)析晶：将浓缩除盐后的溶液冻干，得到干燥的粉末状固体。该步骤5)中将浓缩除盐后的溶液冻干的过程为：将步骤4)纳滤后的溶液放入零下40度冷冻，然后放入冻干机冻干。

当然，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让人们能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)预处理：对含有达托霉素的发酵液进行过滤，使过滤后的达托霉素发酵液的浊度低于预设值；

2)提取：将经过步骤1)处理后的发酵液注入装有第一填料的层析柱中进行吸附，所述第一填料是以葡聚糖或琼脂糖为骨架的阴离子交换凝胶填料，吸附后加入洗脱剂将达托霉素洗脱下来；

3)精制：将步骤2)得到的洗脱液注入装有第二填料的层析柱中进行吸附，所述第二填料是以聚苯乙烯-二乙烯基苯或键合硅胶为骨架的填料，吸附后加入缓冲盐洗脱溶剂进行洗脱，从而获得高纯度的达托霉素。

2.根据权利要求1所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：在所述步骤1)中，是采用0.45微米滤膜对含有达托霉素的发酵液进行过滤处理的。

3.根据权利要求1所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：所述第一填料的粒径为30微米～500微米。

4.根据权利要求1所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：所述第二填料的粒径为30微米～300微米。

5.根据权利要求1所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：所述步骤2)中的洗脱剂为醋酸铵-氯化钠缓冲液。

6.根据权利要求5所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，先用醋酸氨水溶液冲洗，再用所述醋酸铵-氯化钠缓冲液将达托霉素洗脱下来。

7.根据权利要求1所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：所述步骤3)中的缓冲盐洗脱溶剂为PBS-乙腈溶液。

8.根据权利要求1所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于该方法还包括以下步骤：

4)浓缩：采用膜过滤技术，经洗脱液浓缩，将步骤3)得到的高纯度达托霉素进行浓缩，除去高纯度达托霉素中的部分盐分；

5)析晶：将浓缩除盐后的溶液冻干，得到干燥的粉末状固体。

9.根据权利要求8所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于：所述步骤4)中膜过滤技术采用的是透过分子量为150的纳滤膜。

10.根据权利要求9所述的利用层析技术提取高纯度达托霉素的方法，其特征在于所述步骤5)中将浓缩除盐后的溶液冻干的过程为：将步骤4)纳滤后的溶液放入零下40度冷冻，然后放入冻干机冻干。