CN104994924B - 使用在反相柱上的替代固定相纯化有机化合物 - Google Patents

使用在反相柱上的替代固定相纯化有机化合物 Download PDF

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Abstract

仅有两种增加可以在单次运行中通过制备型反相高效液相色谱法(制备型RP‑HPLC)来纯化的样品的量的方式：(1)传统方式是使用较大的柱(较大量的固定相)；以及(2)使用更有效地利用固定相的置换色谱法。本发明描述使用C‑18/C‑8衍生化的二氧化硅的独特的制备型RP‑HPLC技术，所述C‑18/C‑8衍生化的二氧化硅用疏水性季铵盐或季鏻盐涂覆，以导致与常规的制备型RP‑HPLC技术相比，(包括合成的粗制肽的有机化合物的粗制混合物的)样品负载增加7至12倍。样品负载容量和输出的这种增加是由于C‑18/C‑8结合的季盐的附加替代固定相特性。季盐表面活性剂被结合至固定相的C‑18/C‑8链和硅醇。

Description

使用在反相柱上的替代固定相纯化有机化合物
发明领域
本发明涉及使用在反相柱上的替代固定相(surrogate stationary phase)纯化有机化合物。具体地，本发明提供用于纯化有机化合物的制备型HPLC方法，所述制备型HPLC方法采用选自疏水性季铵盐或季鏻盐的试剂作为替代固定相。
发明背景
反相高效液相色谱法(RP-HPLC)在学术机构、法医实验室、精细化学品和制药工业等等中被广泛地用于小的有机分子、天然产物和生物活性分子(例如多肽、蛋白质和核苷酸)的分析、表征、分离(separation)、纯化和/或离析(isolation)。在制药工业中，分析型RP-HPLC被用于释放和表征原材料、中间体和活性药物成分(API)。制备型反相高效液相色谱法(制备型RP-HPLC)被用于商业生产肽API以及大多数的其他的不可经受结晶的复杂的API。
在洗脱模式中的制备型RP-HPLC被分析物的负载容量限制。在洗脱制备型RP-HPLC模式中，合成的肽的典型的负载容量在1至2mg每ml填充柱体积的范围内(即相对于总的柱体积的0.1％至0.2％)。
专利申请US20120322976公开GLP-1类似物的制备型HPLC。负载是相对于总的柱体积的0.225％{(约45mg至20ml C-18取代(十八烷基-二甲基甲硅烷基)的二氧化硅树脂(粒度：15微米)上}。
专利申请US20110313131公开(Aib 8，35)GLP-1(7-36)-NH2的以多达20g/L(相对于总的柱体积的2％)的负载的制备型HPLC。
RP-HPLC的最近的进步已经集中于生产球形的二氧化硅以及开发新的键合化学以提供具有改进的稳定性和选择性的固定载体。较早的载体是被C-18或C-8链衍生化的不规则的二氧化硅颗粒，并且它们经受高背压。高背压限制它们关于可以在单次运行中被纯化的数量以及关于相对地较小的直径的柱的用途。
已经被C-18、C-8和其他的配体衍生化的球形的二氧化硅的商业制造已经克服这些挑战并且已经极大地扩展制备型HPLC的实用性。在键合二氧化硅载体中的这些技术进步和工艺HPLC使用仪器已经使得以吨的数量商业生产复杂的肽例如(36个氨基酸的肽)成为可能。不幸地，这些大规模HPLC仪器和相关的柱硬件是非常昂贵的并且限制方法的可承受性。
此外，在置换模式中的RP-HPLC具有比在洗脱模式中的RP-HPLC更好的负载容量，但其开发是费力的。置换色谱法最好地适合于离子交换模式，并且已经发现大量近期的应用。
置换色谱法利用具有比样品组分更高的对固定相材料的亲合力的置换剂溶液作为流动相。区分置换色谱法与洗脱色谱法的关键的操作特征是置换剂分子的使用。
专利US6239262公开用于在疏水性相互作用和反相色谱***中的蛋白质纯化的低分子量置换剂。
在置换色谱法分离中，样品组分以均质的样品溶液的形式被引入，使得在整个样品施加步骤中单独的组分各自以恒定的浓度被递送。用于分离的驱动力是弱的粘合剂被更强地结合的产物混合物的组分从固定相材料上的有限数目的结合位点置换。这以连续的方式进行，直到产物和其他的较强的粘合剂被完全地阻滞在色谱床的较早的部分中，从而允许较弱地结合的杂质进一步沿着色谱床保持结合于固定相材料。在所有的样品分子被结合于固定相后，将没有观察到这些分子的另外的移动。然而，可能因为均质的样品溶液的这样的使用发生的问题，是在样品施用的早期部分期间被引入的强力地结合的组分的分子可以非故意地被在样品施用的较后的阶段期间被引入的较弱的粘合剂置换。
因此，有对用于肽的简单的、有成本效益的并且可缩放的制备型RP-HPLC工艺的需求。
发明概述
本发明的主要目的是提供使用制备型反相高效液相色谱法(制备型RP-HPLC)技术纯化包括肽的有机化合物的新颖的方法。
本发明的另一个目的是提供用于纯化包括肽的有机化合物的方法，所述方法与传统的制备型RP-HPLC技术相比具有大7至10倍的样品负载容量和输出。
本发明的另外的目的是提供使用表面活性剂作为替代固定相(SSP)/附加固定相(ASP)的这样的方法。
在一个方面中，本发明提供用于通过反相色谱法纯化多组分样品的方法，所述方法包括：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用季铵盐或季鏻盐使色谱固定相饱和；
(c)任选地在步骤(b)之后用缓冲剂洗涤柱；以及
(d)把多组分样品施用于包括用疏水性季铵盐或季鏻盐饱和的固定相的色谱床的一个端部；以及
(e)在缓冲剂中洗脱多组分样品；
(f)回收样品中的期望的组分。
在另一个方面中，本发明提供用于通过反相色谱法纯化多组分样品的方法，所述方法包括：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用季铵盐或季鏻盐使色谱固定相饱和；
(c)任选地在步骤(b)之后用缓冲剂洗涤柱；
(d)把多组分样品施用于包括用疏水性季铵盐或季鏻盐饱和的固定相的色谱床的一个端部；以及
(e)在含有季铵盐或季鏻盐的缓冲剂中洗脱多组分样品；以及
(f)回收样品中的期望的组分。
在又一个方面中，本发明提供用于通过反相色谱法纯化多组分样品的方法，所述方法包括：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用季铵盐或季鏻盐使色谱固定相饱和；
(c)任选地在步骤(b)之后用缓冲剂洗涤柱；
(d)把多组分样品施用于包括用疏水性季铵盐或季鏻盐饱和的固定相的色谱床的一个端部；以及
(e)在缓冲剂中洗脱多组分样品；
(f)回收样品中的期望的组分；
(g)用四氟硼酸钠处理平衡的具有季铵盐或季鏻盐的色谱固定相；以及
(h)在步骤(g)之后用溶剂洗涤处理过的色谱固定相以从季铵盐或季鏻盐回收色谱固定相。
本发明的还另一个方面是提供用于纯化有机化合物的制备型HPLC方法，其中方法具有以下的优点：(1)增加的负载(2)溶剂的有限的使用(3)减少的废物处置(4)操作的容易性、以及(5)用于用色谱法分析、洗脱、浓缩和回收期望的组分的设备的减小的规模。
附图简述
图1：使用本发明获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。Discovery BioWide Pore(10mm×250mm，C18，5u，以及孔径)柱被用于制备型RP-HPLC工艺。
图2：使用本发明获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。Waters Symmetry(19mm×50mm，C8，5u，孔径)柱被用于制备型RP-HPLC工艺。
图3：通过使用标准的(常规的)制备型RP-HPLC技术获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。YMC，ODS-AQ(50mm×250mm，C18，10u，孔径)[见比较实施例]被用于制备型RP-HPLC工艺。
图4：使用四正丁基溴化铵(TBA-Br)和Grace Vydac C18柱(40微米颗粒)获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。
图5：使用四正丁基硫酸氢铵(TBA-HS)和Grace Vydac C18柱(40微米颗粒)获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。
图6：使用十六烷基三甲基溴化铵(CTA-Br)和Grace Vydac C18柱(40微米颗粒)获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。
图7：使用四正丁基氯化鏻(TBP-Cl)和Grace Vydac C18柱(40微米颗粒)获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。
图8：使用四正丁基氯化铵(TBA-Cl)和Grace Vydac C18柱(40微米颗粒)获得的醋酸亮丙瑞林的分析型RP-HPLC分布图。
发明详述
本发明的第一实施方案提供用于纯化有机化合物的制备型HPLC方法，所述制备型HPLC方法采用季铵盐作为替代固定相，其中色谱固定相是疏水性的。
本发明的季铵盐具有如下文提到的结构：
其中R、R1、R2、R3独立地选自包括以下的组：直链或支链的烷基、环烃、芳香族基团、被烷基取代的芳香族基团、被芳基取代的烷基；在通过式(1)代表的化合物中的在本文中被表示为B的阴离子包括双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、双(氟磺酰基)酰亚胺、二氰胺、卤素、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐、硫氰酸盐、二甲基磷酸盐、二乙基二硫代磷酸盐、氨基酸等。优选地，季铵盐是四正丁基溴化铵、四正丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵、四辛基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵。最优选地四正辛基溴化铵。
本发明的第二实施方案提供用于有机化合物的纯化过程的制备型HPLC方法，所述制备型HPLC方法采用季鏻盐作为在疏水性固定相优选地C-18、C-4和C-8疏水性固定相中的替代固定相。
本发明的季鏻盐具有如下文提到的结构，
其中R、R1、R2、R3独立地选自包括以下的组：直链或支链的烷基、环烃、芳香族基团、被烷基取代的芳香族基团、被芳基取代的烷基；在通过式(II)代表的化合物中的在本文中被表示为B的阴离子包括双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺、双(氟磺酰基)酰亚胺、二氰胺、卤素、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐、硫氰酸盐、二甲基磷酸盐、二乙基二硫代磷酸盐、乙基三苯基溴化鏻、乙基三苯基碘化鏻、丁基三苯基溴化鏻、甲基三苯基溴化鏻、三苯基溴化鏻、丁基三苯基氯化鏻。
根据本发明的工艺，有机改性剂的浓度被保持在足以确保/强化分析物对固定相的强的结合的低的浓度。
本发明中的替代固定相是指在用季铵盐或季鏻盐平衡色谱的疏水性固定相之后所形成的改性的疏水性固定相。
本发明的方法以以下方式与现有技术置换色谱法区分：用于通过反相色谱法纯化肽的本发明的方法涉及在添加具有或不具有有机改性剂的附加(替代)固定相之后把包含待被分离的有机化合物的混合物施用于疏水性固定相的步骤，而用于从混合物分离有机化合物的反相置换色谱法(如在专利US6239262、PCT公布WO2013052539和WO2013052087中公开的)，涉及在添加具有或不具有有机改性剂的置换剂之前把包含待被分离的有机化合物的混合物施用于疏水性固定相的步骤。
在多个实施方案中，梯度洗脱可以在组成的多分段的线性变化或逐步的变化下或在其组合下被例如逐步地、线性地实现。在一个方面中，梯度洗脱用增加的量的有机改性剂进行并且洗脱在大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约90％、或多达且包括约100％的有机改性剂中完成。在某些方面中，洗脱用减小的量的有机改性剂完成，例如，小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约2％、小于约1％或约0％的有机改性剂。
本发明中的有机改性剂是指可以在色谱程序和相似的分离方法中使用以改变流动相的性质以可控制地产生期望的材料的连续洗脱的溶剂或化合物。在一个方面中，有机改性剂减小流动相和固定相中的分子之间的离子相互作用。例如，在一个方面中，有机改性剂包含被添加至流动相以减小其极性的溶剂。合适的有机改性剂包括但不限于乙腈、乙醇、甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。分离可以用任何合适的溶剂或溶剂组合实现。
包括可用于在本发明***中分离的多组分混合物的库的性质基本上是无限制的。因此，有机化合物的混合物可以被使用。生物聚合物(天然的或合成的)的蒸煮物是特别有吸引力的。这样的蒸煮物可以包含肽、多糖、多核苷酸、其各种衍生化形式以及其各种大小的片段的混合物。生物聚合物可以从植物或动物组织(患病的或健康的)中提取，蒸煮(如果必要)，或按原样使用。这样的库是丰富可用的，易于制备的，可以具有比合成肽更低的毒性并且是更稳定的，并且可以被***地变化和筛选。
在实施方案中，有机改性剂中的季铵盐或疏水性季鏻盐的浓度被增加以产生分析物的洗脱。有机改性剂可以在具有或不具有季铵盐或疏水性季鏻盐的情况下被使用。
本发明的第三实施方案是提供用于通过采用四氟硼酸钠或六氟磷酸钾与有机改性剂从C-18或C-8柱除去试剂例如疏水性季铵盐或季鏻的工艺。
本发明的第四实施方案是提供用于通过反相色谱法纯化多组分样品的方法，所述方法包括：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用季铵盐或季鏻盐使色谱固定相饱和；
(c)任选地在步骤(b)之后用缓冲剂洗涤柱以除去任何未结合的季盐；
(d)把多组分样品施用于包括用疏水性季铵盐或季鏻盐饱和的固定相的色谱床的一个端部；以及
(e)在缓冲剂中洗脱多组分样品；以及
(f)回收样品中的期望的组分。
在另一个方面中，本发明提供用于通过反相色谱法纯化多组分样品的方法，所述方法包括：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用季铵盐或季鏻盐使色谱固定相饱和；
(c)任选地在步骤(b)之后用缓冲剂洗涤所述柱以除去任何未结合的季盐；
(d)把多组分样品施用于包括用疏水性季铵盐或季鏻盐饱和的固定相的色谱床的一个端部；以及
(e)在含有季铵盐或季鏻盐的缓冲剂中洗脱多组分样品；以及
(f)回收样品中的期望的组分。
在又一个方面中，本发明提供用于通过反相色谱法纯化多组分样品的方法，所述方法包括：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用季铵盐或季鏻盐使色谱固定相饱和；
(c)任选地在步骤(b)之后用缓冲剂洗涤柱以除去任何未结合的季盐；
(d)把多组分样品施用于包括用疏水性季铵盐或季鏻盐饱和的固定相的色谱床的一个端部；以及
(e)在缓冲剂中洗脱多组分样品；
(f)回收样品中的期望的组分；
(g)用四氟硼酸钠处理用季铵盐或季鏻盐饱和的/涂覆的色谱固定相；以及
(h)在步骤(g)之后用溶剂洗涤处理过的色谱固定相以从季铵盐或季鏻盐回收色谱固定相。
常规的RPLC硬件***可以被用于分离，并且术语“配置色谱***”是指设置如本领域中熟知的柱、或柱、泵和检测器的***。
术语“使色谱固定相饱和”是指把溶液中的季铵盐或季鏻盐以特定的浓度传送经过固定相，由此制备替代固定相。
在本发明的优选的实施方案中，其中用于纯化有机化合物的制备型HPLC方法保持有机改性剂的低浓度，以将替代固定相保留在柱上。所述条件被需要用于替代固定相与溶质的相互作用以及与C-18、C-4和C-8配体的相互作用。
本公开内容的某些方面和实施方案在下文的实施例中描述，实施例被提供仅用于图示的目的并且不被意图以任何方式限制本公开内容的范围。
本发明的例证性实施例
C-18/C-8反相柱被5至10个柱体积(Vc)的含有10mM四正丁基硫酸氢铵(TBAHS，缓冲剂A)的5％至10％含水的乙腈平衡。起始缓冲剂的pH不被调整，并且是约1.95(将乙腈的浓度保持为低于在分析型HPLC柱上洗脱产物所需要的浓度是重要的)。待被纯化的粗制的API被溶解在起始缓冲剂A或含水的TFA或含水的HOAc中并且被负载至柱上。在负载是完全的之后，柱被2个柱体积Vc的缓冲剂A平衡。接下来，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B通常是在5％至10％含水的乙腈中的300mM至500mM TBAHS。在10个Vc内的0％B至100％缓冲剂B的线性梯度被施用。
当感兴趣的产物(API)即将洗脱时，梯度保持可以被施用直到所有的API已经从柱洗脱。可选择地，如果期望洗脱以浓缩的形式的产物，梯度可以被允许按常规发展。含有纯的API产物的级分在确认汇集的级分满足纯化标准之后被合并。相关的TBAHS的近似量被计算。其然后用1.5至2当量的四氟硼酸钠(NaBF4)处理并且用氯仿萃取3次以除去作为其四氟硼酸盐的TBA阳离子。然后含水的残留物被负载至所有的TBAHS已经从其除去的C-18/C-8柱上。从C-18/C-8柱除去TBAHS通过以下的步骤被实现：柱首先用至少3个Vc的80％乙腈-20％水洗涤。接下来，柱用3个Vc的在80％乙腈-20％水中的100mM NaBF4洗涤。柱被在1％含水的乙腈(10个Vc)中的1M乙酸平衡。含有“纯的API”和过量的NaBF4的水相被水(5×其体积)稀释并且被负载至C-18/C-8柱上。柱被5至10个Vc的1％磷酸-1％乙腈-98％水洗涤以将BF4阴离子交换为磷酸根阴离子。然后柱被5至10个Vc的100mM含水的胍.HCl洗涤以除去磷酸根阴离子并且以将磷酸根阴离子交换为氯阴离子。最终地氯阴离子被交换为乙酸根阴离子。含有“纯的产物乙酸盐”的级分被合并，并且有机挥发物在减压下被除去。含水的残留物被冻干或在除去水之后沉淀。最终的API根据USP/EP分析方法被分析。
表1：亮丙瑞林的纯化：被替代固定相辅助的制备型RP-HPLC与标准的制备型RP-HPLC的比较
标准的制备型RP-HPLC的纯化的产物(亮丙瑞林)输出是2.45mg/mL的柱体积。相比之下，替代固定相辅助的制备型RP-HPLC的纯化的产物输出是29.6mg/mL的柱体积(表1，条目2)和16.3mg/mL的柱体积(表1，条目3)。这些结果表明，7至12倍常规的制备型RP-HPLC的容量的负载在本发明中描述的工艺下是可实现的。
实施例
实施例-1：醋酸亮丙瑞林的制备型RP-HPLC：
两个不同的柱关于亮丙瑞林的纯化被评价：Discovery Bio Wide Pore柱{柱参数：10mm(ID)×250mm(L)，C18，5u颗粒，孔径，负载的量是1.2g的粗制的亮丙瑞林)和Waters Symmetry柱{柱参数：19mm(内径，ID)×50mm(长度，L)，C8，5u颗粒，孔径，负载的量是1.4g的粗制的亮丙瑞林}被使用。柱被在10％含水的乙腈中的5至10个柱体积(Vc)的10mM TBAHS(缓冲剂A)预平衡。在负载是完全的之后，柱被2个Vc的缓冲剂A洗涤。接下来，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在10％含水的乙腈中的300mM TBAHS。在60min内0％B至100％缓冲剂B的线性梯度被用于洗脱。梯度保持被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的API产物的级分被合并并且用1.5至2当量的四氟硼酸钠(NaBF4)处理并且用氯仿萃取3次。整个的纯化过程被重复3次以表明并且确认一致的性能。含有“纯的亮丙瑞林”的级分被合并并且被负载至所有的TBAHS已经从其除去的C-18柱上，如之前所描述。
将磷酸根/硫酸氢根阴离子转化为乙酸根阴离子被如早前描述地进行。含有纯的醋酸亮丙瑞林API的级分被冻干。纯化收率是约30％。(TBA-HS在本文中表示四正丁基硫酸氢铵)
实施例-2：醋酸曲普瑞林的制备型RP-HPLC
C-18/C-8反相柱被5至10个Vcs的含有10mM TBAHS的5％至10％含水的乙腈(缓冲剂A)预平衡。Discovery Bio Wide Pore柱{柱参数：10mm(ID)×250mm(L)，C18，5u颗粒，孔径，负载的量是1.0g的粗制的曲普瑞林}被使用。在负载是完全的之后，柱被2个Vc的缓冲剂A洗涤。接下来，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在10％含水的乙腈中的300mMTBAHS。在60min内0％B至100％缓冲剂B的线性梯度被用于洗脱。梯度保持被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的API产物的级分被合并并且用1.5至2当量的四氟硼酸钠(NaBF4)处理并且用氯仿萃取3次。整个的纯化过程被重复3次以表明并且确认一致的性能。含有“纯的曲普瑞林”的级分被合并并且被负载至所有的TBAHS已经从其除去的C-18柱上，如之前所描述。
将磷酸根/硫酸氢根阴离子转化为乙酸根阴离子被如早前描述地进行。含有纯的曲普瑞林API的级分被冻干。纯化收率是约25％。(TBAHS在本文中表示四正丁基硫酸氢铵)
实施例-3：醋酸亮丙瑞林的采用四正丁基溴化铵(TBA-Br)的制备型RP-HPLC：
C-18反相柱[Grace Vydac柱参数：12克的C-18，40微米颗粒，孔径]被在360mL的水中的36克的TBA-Br以8.0ml/min的流量饱和。柱然后被10个Vcs的缓冲剂A(在水中的25mM TBA-Br)以8.0ml/min的流量平衡。粗制的亮丙瑞林三氟乙酸盐被溶解在缓冲剂A中并且被负载至柱上。在负载是完全的之后，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在50％含水的乙腈中的25mM的TBA-Br。在10个Vcs内的0％的缓冲剂B至100％的缓冲剂B的线性梯度被施用。当亮丙瑞林即将洗脱时，梯度保持可以被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的亮丙瑞林的级分在分析型HPLC上确认纯度之后被合并。收率：66.4％。在本文中TBA-Br是四正丁基溴化铵。
从C-18柱除去TBA-Br：柱首先用至少5个Vcs的在乙腈和水(8:2)中的0.1M四氟硼酸钠洗涤。
实施例-4：醋酸亮丙瑞林的采用四正丁基硫酸氢铵(TBA-HS)的制备型RP-HPLC
C-18反相柱[Grace Vydac柱参数：12克的C-18，40微米颗粒，孔径]被36克的TBA-HS在360mL的水中的溶液以8.0ml/min的流量饱和。柱然后被约10个Vcs的缓冲剂A(在水中的25mM TBA-HS)以8.0ml/min的流量平衡。粗制的亮丙瑞林三氟乙酸盐被溶解在缓冲剂A中并且被负载至柱上。在负载是完全的之后，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在50％含水的乙腈中的25mM的TBA-HS。在10个Vcs内的0％的缓冲剂B至100％的缓冲剂B的线性梯度被施用。当亮丙瑞林即将洗脱时，梯度保持可以被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的亮丙瑞林的级分在分析型HPLC上确认纯度之后被合并。收率：64.4％。在本文中TBA-HS是四正丁基硫酸氢铵。
从C-18柱除去TBA-HS：柱首先用至少5个柱体积的在乙腈和水(8:2)中的0.1M四氟硼酸钠洗涤。
实施例-5：醋酸亮丙瑞林的采用十六烷基三甲基溴化铵(CTA-Br)的制备型RP-HPLC
C-18反相柱[Grace Vydac柱参数：12克的C-18，40微米颗粒，孔径]被1mMCTA-Br在水中的溶液以8.0ml/min的流量饱和。柱然后被约10个Vcs的缓冲剂A(在水中的5mM CTA-Br)以8.0ml/min的流量平衡。粗制的亮丙瑞林三氟乙酸盐被溶解在缓冲剂A中并且被负载至柱上。在负载是完全的之后，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在50％含水的乙腈中的5mM的CTA-Br。在10个Vcs内的0％的缓冲剂B至100％的缓冲剂B的线性梯度被施用。当亮丙瑞林即将洗脱时，梯度保持可以被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的亮丙瑞林的级分在分析型HPLC上确认纯度之后被合并。收率：61.4％。在本文中CTA-Br是十六烷基三甲基溴化铵。
从C-18柱除去CTA-Br：柱首先用至少5个Vcs的在乙腈和水(8:2)中的0.1M四氟硼酸钠洗涤。
实施例-6：醋酸亮丙瑞林的采用四正丁基氯化鏻(TBP-Cl)的制备型RP-HPLC
C-18反相柱[Grace Vydac柱参数：12克的C-18，40微米颗粒，孔径]被36克的TBP-Cl在360mL的水中的溶液以8.0ml/min的流量饱和。柱然后被约10个Vcs的缓冲剂A(在水中的25mM TBP-Cl)以8.0ml/min的流量平衡。粗制的亮丙瑞林三氟乙酸盐被溶解在缓冲剂A中并且被负载至柱上。在负载是完全的之后，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在50％含水的乙腈中的25mM的TBP-Cl。在10个柱体积内的0％的缓冲剂B至100％的缓冲剂B的线性梯度被施用。当亮丙瑞林即将洗脱时，梯度保持可以被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的亮丙瑞林的级分在分析型HPLC上确认纯度之后被合并。收率：60.3％。在本文中TBP-Cl是四正丁基氯化鏻。
从C-18柱除去TBP-Cl：柱首先用至少5个Vcs的在乙腈和水(8:2)中的0.1M四氟硼酸钠洗涤。
实施例-7：醋酸亮丙瑞林的采用四正丁基氯化铵(TBA-Cl)的制备型RP-HPLC
C-18反相柱[Grace Vydac柱参数：12克的C-18，40微米颗粒，孔径]被在360mL的水中的36克的TBA-Cl以8.0ml/min的流量饱和。柱然后被约10个Vcs的缓冲剂A(在水中的25mM TBA-Cl)以8.0ml/min的流量平衡。粗制的亮丙瑞林三氟乙酸盐被溶解在缓冲剂A中并且被负载至柱上。在负载是完全的之后，梯度洗脱过程被开始。缓冲剂B是在50％含水的乙腈中的25mM的TBA-Cl。在10个Vcs内的0％的缓冲剂B至100％的缓冲剂B的线性梯度被施用。当亮丙瑞林即将洗脱时，梯度保持可以被施用直到所有的API已经从柱洗脱。含有纯的亮丙瑞林的级分在分析型HPLC上确认纯度之后被合并。收率：53.5％。在本文中TBA-Cl是四正丁基氯化铵。
从C-18柱除去TBA-Cl：柱首先用至少5个Vcs的在乙腈和水(8:2)中的0.1M四氟硼酸钠洗涤。

Claims (15)

1.一种纯化包括肽的有机化合物的方法，所述方法通过制备型反相高效液相色谱柱的增加的样品负载容量例证，所述柱通过使用与C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相结合的替代固定相/附加固定相获得，
其中所述替代固定相/附加固定相是疏水性季铵盐，并且一般结构在下文示出：
其中R、R1、R2、R3独立地选自包括以下的组：直链或支链的烷基、环烃、芳香族基团、被烷基取代的芳香族基团、被芳基取代的烷基；并且B-表示阴离子；或者
其中所述替代固定相/附加固定相是季鏻盐，并且一般结构在下文示出：
其中R、R1、R2、R3独立地选自包括以下的组：直链或支链的烷基、环烃、芳香族基团、被烷基取代的芳香族基团、被芳基取代的烷基；并且B-表示阴离子。
2.如权利要求1所述的方法，其中C-18/C-8反相柱的所述样品负载容量通过用替代固定相/附加固定相涂覆所述C-18/C-8反相柱来增加。
3.如权利要求2所述的方法，其中季铵盐中的所述阴离子选自由以下组成的组：卤素、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺盐酸、三氟乙酸盐、硫氰酸盐或氨基酸。
4.如权利要求2所述的方法，其中季铵盐选自由以下组成的组：四正丁基溴化铵、四正丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵、四辛基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵。
5.如权利要求1所述的方法，其中季鏻盐中的所述阴离子选自由以下组成的组：卤素、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟甲磺酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐或硫氰酸盐。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述季鏻盐是四正丁基氯化鏻。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述C-18/C-8反相固定相是四辛基溴化铵。
8.如权利要求1所述的方法，包括通过用四氟硼酸钠或六氟磷酸钾连续地洗涤所述柱来从C-18/C-8衍生化的二氧化硅除去所述替代固定相/附加固定相的涂层。
9.如权利要求3所述的方法，其中在将所述阴离子转化成四氟硼酸盐或六氟磷酸盐之后，将来自期望的纯化的产物的残留的季铵盐萃取到氯仿中。
10.一种用于通过制备型反相高效液相色谱法纯化包括肽的有机化合物的多组分样品的方法，包括以下步骤：
(a)配置具有疏水性固定相的色谱***；
(b)用选自四烷基铵盐的替代固定相/附加固定相表面活性剂使所述疏水性固定相饱和；
(c)采用有机溶剂和水的混合物洗涤柱以除去过量的未结合的表面活性剂；
(d)用起始流动相平衡所述柱；
(e)把多组分样品施用于包括用季铵盐表面活性剂涂覆的固定相的色谱床的一个端部；
(f)在含有季铵盐或季鏻盐的缓冲剂中洗脱所述多组分样品；以及
(g)回收所述多组分样品中的期望的组分。
11.如权利要求10所述的方法，其中步骤(a)中的所述疏水性固定相是C-8/C-18烷基链衍生化的二氧化硅。
12.如权利要求10所述的方法，其中步骤(b)中的所述表面活性剂选自由以下组成的组：四正丁基溴化铵、四正丁基氯化铵、四正丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵、四辛基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述起始流动相选自由以下组成的组：四正丁基溴化铵、四正丁基氯化铵、四正丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵、四辛基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵。
14.如权利要求10所述的方法，包括通过用四氟硼酸钠或六氟磷酸钾连续地洗涤所述柱来从C-18/C-8衍生化的二氧化硅除去所述替代固定相/附加固定相的涂层。
15.如权利要求10所述的方法，其中在将四烷基铵盐的阴离子转化成四氟硼酸盐或六氟磷酸盐之后，将来自期望的纯化的产物的残留的季铵盐萃取到氯仿中。
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