CN104987504B

CN104987504B - 聚乙二醇化拉帕替尼及其注射剂和制备方法

Info

Publication number: CN104987504B
Application number: CN201510196919.7A
Authority: CN
Inventors: 李高全; 张翠芳; 谢爱云; 陈毛芬
Original assignee: Nanjing Mingzhen Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Apu Grey Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2015-04-23
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2035-04-23
Also published as: CN104987504A

Abstract

本发明提供了聚乙二醇化拉帕替尼及其注射剂和制备方法。聚乙二醇化拉帕替尼，其通式为：A选自单臂或多臂的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物；X选自 Y和M分别独立地选自带氨基的双羧酸或相应的酰基取代物；N选自氨基酸或肽；LPT为拉帕替尼；a＝0或1；b＝0或1；c＝1或2；d＝1或2；e等于X的臂数。本发明合成了拉帕替尼的聚乙二醇化药物，降低了拉帕替尼的毒性，提高了其水溶性和生物稳定性，避开了癌细胞和癌症干细胞的耐药性，增强了靶向性，显著提高了抗癌疗效。

Description

聚乙二醇化拉帕替尼及其注射剂和制备方法

技术领域

本发明涉及拉帕替尼的偶联物领域，具体而言，涉及聚乙二醇化拉帕替尼及其注射剂和制备方法。

背景技术

拉帕替尼(Lapatinib)是一种口服的小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，主要用于联合卡培他滨治疗ErbB-2过度表达的，以及既往接受过蒽环类、紫杉醇或曲妥珠单抗治疗的晚期或转移性的乳腺癌，于2007年被美国FDA批准进入市场。拉帕替尼能抑制癌症干细胞，如U87-MG脑癌干细胞和SUM225乳腺癌干细胞。

拉帕替尼的分子量为581.06，属于小分子抗癌药，存在水溶解性差、生物稳定性差、毒副作用大的缺点，并且小分子的拉帕替尼通过扩散进入癌细胞或癌症干细胞会被p-糖蛋白膜泵出，进而导致抗药性。而长效缓释的高分子偶联抗癌症干细胞小分子药物能极大地降低小分子药物的毒性，极大地提升其水溶性与生物稳定性，增强其被动靶向性，相对于抗体偶联抗癌药(ADC)、抗体抗癌药、抗体抗癌症干细胞药物或免疫治疗的抗体来说价格低廉，并且可以避开癌细胞或癌症干细胞极强的耐药性，这是因为高分子偶联抗癌药或高分子偶联抗癌症干细胞药物具有较大的分子量，癌细胞或癌症干细胞只能通过内吞和胞饮作用对其进行吸收。但针对既是抗癌药又是抗癌症干细胞药物的拉帕替尼的高分子偶联技术报道和产品尚未发现。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供聚乙二醇化拉帕替尼，所述的聚乙二醇化拉帕替尼是拉帕替尼与聚乙二醇及其衍生物偶联形成的高分子抗癌药物，与拉帕替尼相比，其毒性大幅度降低，水溶性和生物稳定性提高，具有显著的被动靶向性、低得多的耐药性、更高的抗癌疗效。

本发明的第二目的在于提供一种所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，该方法具有操作简单，反应条件温和，反应速率快和产率高等优点。

本发明的第三目的在于提供一种所述的聚乙二醇化拉帕替尼的注射剂，该注射剂具有添加剂少、溶解性高、药效高、易制备等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

聚乙二醇化拉帕替尼，其通式为：

A选自单臂或多臂的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物；X选自 Y和M分别独立地选自带氨基的双羧酸或相应的酰基取代物；N选自氨基酸或肽；LPT为拉帕替尼；

a＝0或1；b＝0或1；c＝1或2；d＝1或2；e等于X的臂数。

由上述通式可知，聚乙二醇化拉帕替尼是以氨基酸为连接链，将聚乙二醇与拉帕替尼偶联在一起形成的大分子物质，其不仅保留了拉帕替尼抗癌性能，而且与单一的拉帕替尼相比显出了以下优势：毒性大幅度降低，水溶性和生物稳定性提高，具有显著的被动靶向性和低得多的耐药性。

在上述通式中，当c＝2时，表示M上连接了两个N-LPT。

优选地，当a、b均为0时，c、d均为1；当a＝0，b＝1时，d＝1。具有以上结构特点的偶联物更容易制备，药物成本低。以下列举了部分偶联物的分子结构式：

优选地，所述带氨基的双羧酸为谷氨酸或天冬氨酸。

优选地，A选自单臂、四臂或八臂的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物。

优选地，A的分子量为12000、20000或40000道尔顿。

优选地，Y和M分别独立地选自

这些物质都是谷氨酸的氨基位置的取代物，可以实现以下两个目的：一是利用谷氨酸或天冬氨酸的高活性酰基偶联更多的酰胺化的LPT，二是增加支链数量，以提高聚乙二醇化拉帕替尼的药物释放速率。另外，支链上的二甲氨基乙氧基乙醇可以降低与聚乙二醇的结合难度。

优选地，N为甘氨酸，其与拉帕替尼更易结合，因此产品更易获得。

优选地，分子式为实验证明，该化合物的药物综合性能更佳，临床上更易推广。

上述聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，包括下列步骤：

步骤A：使拉帕替尼与氨基酸/肽发生酰胺化反应，得到第一中间产物；

步骤B：使所述第一中间产物与M发生酰胺化反应，得到第二中间产物；

步骤C：使所述第二中间产物与Y发生酰胺化反应，得到第三中间产物；

步骤D：使所述第三中间产物与聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物通过酰胺键偶联，得到产品。

上述制备方法以氨基酸为连接桥，降低了聚乙二醇与LPT直接偶联的难度，并且在合成过程中所涉及的三类反应(LPT与氨基酸反应、氨基酸之间的反应、聚乙二醇与Y的反应)的反应条件都很温和，因此对设备和生产环境的要求低，制备成本低。另外，由于合成过程中反应的机理为酰胺化反应，酰胺化反应的选择性高，反应速率快，异构体类的副产物少，因此该合成方法的产率高、速率快。

优选地，所述步骤A中，拉帕替尼与肽或任意氨基酸发生酰胺化反应的条件为：以HBTU、HOBT、DMF和DIEA为助剂，在-2～4℃下反应，并且拉帕替尼、肽或任意氨基酸、HBTU、HOBT和DIEA之间的摩尔比为：1:0.8～1.2:1.3～1.7:1.3～1.7:4.2～4.8。

上述反应是将HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)作为缩合剂，HOBT(1-羟基苯并***)作为补偿剂，DIEA(N，N-二异丙基乙胺)作为生物碱，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)作为溶剂，并以特定的比例促进拉帕替尼与肽/任意氨基酸的反应，使酰基与氨基的结合难度降低，反应产率提高。

优选地，使拉帕替尼与肽或氨基酸发生酰胺化反应之前还包括：用叔丁氧羰基(Boc)保护所述肽或所述氨基酸的氨基。

上述保护措施可以避免肽/任意氨基酸的氨基被取代后，无法与其它氨基酸结合。具体的保护方法可以参照以下方式：将氨基酸溶解在1,4-二氧六环中，再加入氢氧化钠溶液，再在室温下加入二碳酸二叔丁酯(Boc₂O)，在室温下反应，最后分离提取产物；氨基酸、氢氧化钠的摩尔比为1:1.2-1.3。

优选地，所述步骤A中，拉帕替尼与肽发生酰胺化反应的方法为：拉帕替尼与所述肽的端头涉及的游离氨基酸反应，得到的产物再按照所述肽中氨基酸的排序依次与所述肽涉及的其它游离氨基酸反应，并且上述反应中的游离氨基酸在参与反应之前：用N-羟基琥珀酰亚胺活化所述游离氨基酸的羧基。通过活化提高反应速率，提高产率，降低偶联难度，使得后处理更加容易。

优选地，所述步骤B中，所述第一中间产物与M酰胺化反应的条件为：所述第一中间产物与M的摩尔比≥2。控制合适的摩尔比使一分子的M可以连接两分子的第一中间产物，使LPT的连接数量翻倍。

优选地，所述第一中间产物与M发生酰胺化反应之前还包括：用N-羟基琥珀酰亚胺活化谷氨酸的羧基；同理，通过活化提高反应速率，降低偶联难度。与此类似，在所述第二中间产物与Y发生酰胺化反应之前也可以先用N-羟基琥珀酰亚胺活化Y的羧基。

优选地，所述步骤C中，所述第二中间产物与Y酰胺化反应的条件为：所述第二中间产物与谷氨酸的摩尔比≥2。同样是控制反应物的比例来增加结合的LPT的数量。

优选地，所述步骤D中，使所述第三中间产物与聚乙二醇发生酰胺化反应之前还包括：N，N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯、N，N'-琥珀酰亚胺基乙酸酯或N，N'-琥珀酰亚胺基戊二酸酯活化聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物。以降低聚乙二醇与LPT的偶联难度。

优选地，所述第三中间产物与聚乙二醇的摩尔比大于1.5；保证第三中间产物与聚乙二醇完全偶联。

优选地，用N，N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯、N，N'-琥珀酰亚胺基乙酸酯或N，N'-琥珀酰亚胺基戊二酸酯活化聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物，得到第四中间产物，所述第三中间产物与所述第四中间产物以二氯甲烷为溶剂，在20-30℃下发生酰胺化反应：选用温和的反应条件降低生产难度。

聚乙二醇化拉帕替尼的注射剂，包括：所述聚乙二醇化拉帕替尼和溶剂，所述溶剂为生理盐水和/或95％乙醇。该注射剂具有添加剂少、溶解性高、药效高、易制备等优点。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)合成了拉帕替尼的高分子偶联药物，降低了拉帕替尼原药的毒性，提高了水溶性和生物稳定性，避开了癌细胞和癌症干细胞很强的耐药性，增强了靶向性，显著提高了抗癌疗效。

(2)聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法操作简单、反应条件温和、反应速率快和产率高，适用于工业化生产。

(3)提供了不同类型的聚乙二醇化拉帕替尼注射剂，为聚乙二醇化拉帕替尼的临床应用提供了依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1至图5分别为6-56、4-208、6-162、7-129、LPT对U87癌细胞抑制率的曲线；

图6至图10为6-56、4-208、6-162、7-129、LPT对N87癌细胞抑制率的曲线；

图11至图13为6-56、6-162、LPT对CALU-3癌细胞抑制率的曲线；

图14至图18为6-56、4-208、6-162、7-129、LPT对BT474癌细胞抑制率的曲线；

图19至图23为6-56、4-208、6-162、7-129、LPT对SK-BR-3癌细胞抑制率的曲线；

图24为生理盐水、7-129、LPT作用于小鼠时肿瘤的生长曲线；

图25至图42分别为实施例1-18提供的聚乙二醇化拉帕替尼的¹H-NMR谱图；

图43至图55分别为实施例1、3-5、9-17提供的聚乙二醇化拉帕替尼的质谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

为满足简明、清楚的要求，下文涉及的部分化合物用数字编号，例如3-59、7-129、P1～P43等。

实施例1

合成的方法：

一、制备

将甘氨酸(19.1274g，254.7943mmol)溶解在1,4-二氧六环(200mL)中，加入2NNaOH溶液(80uL，160mmol)，待溶液温度降至室温后，加入Boc₂O(77.8524g，356.7120mmol)，在室温下反应12小时，蒸发浓缩，最后用乙酸乙酯(150mL×2)洗涤，用盐酸将pH值调至4，再用乙酸乙酯(150mL×5)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，滤液经浓缩干燥得到产物44.6克，产率为100％。

二、制备

在50mL的烧瓶中加入P1(90.4mg，0.5163mmol)、拉帕替尼(300g，0.5163mmol)、HBTU(290.6mg，0.7745mmol)和HOBT(104.6mg，107745mmol)，用DMF(15mL)溶解，将溶液在0℃低温恒温反应浴中冷却20分钟，然后缓慢滴加DIEA(0.41mL，2.3234mmol)。2小时后移至室温，搅拌过夜。将反应液倒入饱和NaHCO₃溶液(200mL)中，用乙酸乙酯萃取(200mL×2)。然后用饱和碳酸氢钠溶液(150mL×2)清洗，最后用饱和NaCl溶液(100mL)清洗。用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩蒸干。硅胶柱层析，用5％MeOH/二氯甲烷洗脱。收集产品，蒸干得380.0mg，产率99.70％。

三、制备

在烧瓶中加入P2(380.0mg，0.5147mmol)，用二氯甲烷(10mL)溶解，最后滴入TFA(0.20mL，2.5737mmol)。室温下搅拌过夜。停止反应，减压蒸干，用MeOH溶解，加入碳酸氢钠(211.2mg，2.5137mmol)，搅拌10分钟。抽滤，往滤液中加入硅胶粉(3克)，旋干做成固体溶液，干法上样。柱层析，先用2％MeOH/二氯甲烷洗脱，再用1％TEA，5％MeOH/二氯甲烷洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得209.9mg，产率63.9％。

四、制备3-59：

在圆筒瓶中加入P3(19.95mg，0.025mmol)和分子量为12000的单臂的聚乙二醇M-SC-12K(200mg，0.01667mmol)，用二氯甲烷(5mL)溶解，室温搅拌一周，停止反应，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品136.3mg，产率65.3％。

实施例2

合成的方法：

在圆筒瓶中加入P3(9.6mg，0.015mmol)和分子量为20000的单臂的聚乙二醇M-SC-20K(200mg，0.01mmol)，用二氯甲烷(5mL)溶解，室温搅拌一周，停止反应，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品182.6mg，产率89.0％。

实施例3

合成的方法：

在圆筒瓶中加入P3(9.6mg，0.015mmol)，和分子量为40000的单臂的聚乙二醇M-SC-40K(200mg，0.01mmol)，用二氯甲烷(8mL)溶解，室温搅拌一周，停止反应，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品168.4mg，产率83.1％。

实施例4

合成

在圆筒瓶中加入P3(19.1433mg，0.03mmol)和分子量为40000的四臂的聚乙二醇4ARM-SC-40K(200mg，0.01mmol)，用二氯甲烷(8mL)溶解，室温搅拌两周，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，得产品，真空烘干得产品120mg，产率55.8％。

实施例5

合成

在圆筒瓶中加入P3(101.9mg，0.16mmol)，和分子量为40000的八臂的聚乙二醇8ARM-SG-40K(400mg，0.01mmol)，用二氯甲烷(8mL)溶解，室温搅拌2周，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品236.9mg，产率53.6％。

实施例6

合成

一、制备

在烧瓶中加入L-谷氨酸(20.0620g，13.36mmol)，用水/DMF(100mL/200mL)溶解。室温下边搅拌边加入三乙胺(38.00mL，272.71mmol)，然后加入Boc₂O(30.36g，139.09mmol)，最后加入DMF(40mL)，搅拌过夜。浓缩，用乙酸乙酯(500mL)溶解，用1M HCl(100mL)中和。分离出水相，在水相中加入NaCl，至其不再溶解为止，用乙酸乙酯萃取水相，分离出有机相。将上述有机相合并，用水清洗，用饱和食盐水清洗，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干得产品19.75g，产率58.58％。

二、制备

在1L的圆底烧瓶中加入P4(20g，80.8898mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(37.2384g，323.5592mmol)，用二氯甲烷(400mL)溶解，然后加入DMAP(1.9765g，16.1780mmol)，置于-5℃的低温恒温反应浴中，20分钟后分批加入DCC(66.7599g，323.5592mmol)，1小时后移至室温，搅拌过夜。过滤，将滤液浓缩。用石油醚做溶剂匀浆湿法装柱16cm×8.5cm。湿法上样。柱层析，用30％乙酸乙酯/石油醚到100％乙酸乙酯梯度洗脱，TLC监测，高锰酸钾显色，收集产品，蒸干，真空烘箱干燥得最终产品41.6462g，产率100％。

三、制备

在圆筒反应器中加入P5(223.2mg，0.5056mmol)和P3(709.7mg，1.1223mmol)，用二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜。直接湿法上样，硅胶柱层析，用2％的NH₃·H₂O，4％MeOH/二氯甲烷至3％的NH₃·H₂O，6％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩蒸干得产品620mg，产率47.7％。

四、

在烧瓶中加入P6(620mg，0.4168mmol)，用二氯甲烷溶解，加入TFA(0.1597mL，2.084mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸干，用MeOH溶解，加入碳酸氢钠(175.1mg，2.084mmol)并搅拌10分钟。过滤，将滤液做成硅胶粉固体溶液，干法上样。柱层析，用2％的NH₃·H₂O，4％MeOH/二氯甲烷洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得413.3mg，产率100％。

五、制备

在烧瓶中加入P1(5.0905g，29.0587mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.6788g，31.9646mmol)，用二氯甲烷溶解，再加入DMAP(355.0mg，2.9059mmol)，置于0℃的低温恒温反应浴中，20分钟后加入DCC(6.5953g，31.9646mmol)，1小时后移至室温，搅拌过夜。点TLC板，在20％乙酸乙酯/石油醚中展开，磷钼酸显色显示反应完全。过滤，用二氯甲烷洗涤沉淀。在滤液中加入20g的硅胶粉，旋干，干法上柱。用30％乙酸乙酯/石油醚至50％乙酸乙酯/石油醚至100％的乙酸乙酯洗脱，收集产品点，减压浓缩蒸干得产品4.8945g，产率65.98％。

六、制备

在圆筒瓶中加入P7(220.2mg，0.1587mmol)和P8(43.213mg，0.1587mmol)，用二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜。湿法上样柱层析，用1.5％NH₃·H₂O，3％MeOH/二氯甲烷至3％NH₃·H₂O，6％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩，真空烘干得产品213.9mg，产率89.8％。

七、制备

在烧瓶中加入P9(213mg，0.1385mmol)，用二氯甲烷溶解，再加入TFA(53uL，0.6925mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸干，用MeOH溶解，加入碳酸氢钠(58.2mg，0.6925mmol)搅拌10分钟。过滤，将滤液做成硅胶粉固体溶液，干法上样。柱层析，用3％NH₃·H₂O，6％MeOH/二氯甲烷洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得166.8mg，产率100％。

八、制备3-137

在圆筒瓶中加入P10(65.0mg，0.045mmol)和分子量为40000的四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(300mg，0.015mmol)，用二氯甲烷(8mL)溶解，室温搅拌两周。停止反应，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品289.6mg，产率88.3％。

实施例7

合成

一、制备

在烧瓶中加入P7(4.8g，3.3052mmol)和P5(694.7187mg，1.5739mmol.)，用二氯甲烷溶解，室温下搅拌过夜。匀浆法装硅胶柱25cm×4.5cm。湿法上柱分离，用2％NH₃·H₂O/4％MeOH/二氯甲烷至2.5％NH₃·H₂O/5％MeOH/二氯甲烷洗脱，收集产品点，减压浓缩蒸干得产品3.3147g，产率75.9％.

二、制备

在烧瓶中加入P11(2.8356g，0.9497mmol)，用二氯甲烷(50mL)溶解，在室温搅拌下缓慢加入TFA(0.728mLL，9.4967mmol)，搅拌过夜。减压蒸干，将粗品用无水甲醇溶解，加入碳酸氢钠(797.8177mg，9.4967mmol)搅拌中和。过滤，将滤液做成硅胶粉固体溶液。匀浆法装硅胶柱20cm×4.5cm。干法上柱，用2.5％NH₃.H₂O/5％MeOH/二氯甲烷至5％NH₃.H₂O/10％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品2.5983g，产率94.8％。

三、制备

在圆筒瓶中加入P12(95mg，0.0328mmol)和P8(9.37mg，0.0344mmol)，用二氯甲烷(10mL)溶解，室温搅拌过夜。二氯甲烷湿法匀浆装柱20cm×2cm。湿法上柱，柱层析，用2％NH₃·H₂O，3％MeOH/二氯甲烷至3％NH₃·H₂O，6％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩真空烘干得产品99.8mg，产率100％。

四、制备

在烧瓶中加入P13(99.8mg，0.0328mmol)，用二氯甲烷溶解，加入TFA(12.6uL，0.1640mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸干，用MeOH溶解，加入碳酸氢钠(0.3g)，搅拌10分钟。过滤，将滤液做成硅胶粉固体溶液。二氯甲烷湿法匀浆装柱25cm×2.5cm。柱层析，用4％NH₃·H₂O，8％MeOH/二氯甲烷至5％NH₃·H₂O，10％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩真空烘干得产品96.5mg，产率100％。

五、制备3-153

在圆筒瓶中加入P14(110.5mg，0.03759mmol)和分子量为40000的四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(250.6mg，0.006266mmol)，用二氯甲烷(8mL)溶解，室温搅拌两周，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，抽滤，真空烘干得产品252.36mg，产率77.2％。

实施例8

合成

一、制备

向500mL的烧瓶中加入H₂NCH₂CH₂OCH₂CH₂OH(20g，190.223mmol)，用CH₂Cl₂(300mL)溶解，再加入三乙胺(53mL，380.446mmol)，磁力搅拌下分批加入Boc₂O(49.8192克,228.2670mmol)，室温下搅拌过夜。TLC监测显示原料耗尽。直接蒸干，用甲醇溶解，加入碳酸氢钠(31.9575g，380mmol)中和三乙胺，过滤，在滤液中加入60g硅胶粉并旋干。用石油醚湿法匀浆装柱10cm×8.5cm。干法上样，用20％乙酸乙酯/石油醚至50％乙酸乙酯/石油醚及2％甲醇/乙酸乙酯梯度洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得35.4485g，产率90.79％。

二、制备

在氮气保护下，向1L的三口瓶中加入P16(35.4685g，172.803mmol)，用THF(200mL)溶解，机械搅拌，置于0℃的低温恒温反应浴中。20分钟后，分批加入60％的NaH(27.6485g，690.12mmol)，放出大量气泡。20分钟后，加入溴乙酸(36.0165g，259.2045mmol)，放出大量气泡并出现白色浆状沉淀。加完后，移至60℃油浴过夜。TLC检测显示反应完全。滴加水(30mL)中和剩余的NaH，再加入水(300mL)，分离水相和有机相，用石油醚/无水***(100mL×2)洗水相。用1M HCl调节水相pH至4。然后加入NaCl至溶液饱和。用乙酸乙酯萃取水相(100mL×12)。用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩干燥得产品20.4653g，产率44.99％。

三、制备

在500mL的烧瓶中加入P16(20.4653g，77.729mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(10.7311g，93.275mmol)和DMAP(0.9488g，7.7729mmol)，用二氯甲烷(200mL)溶解，置于0℃的低温恒温反应浴中搅拌，30分钟后加入DCC(64.1513g，310.916mmol)。3小时后移至室温，搅拌过夜。TLC显示原料耗尽。过滤，在滤液中加入60g硅胶粉旋干。用石油醚湿法匀浆装柱20cm×8.8cm。干法上样。用20％乙酸乙酯/石油醚至100％的乙酸乙酯梯度洗脱，收集产品点，浓缩干燥得产品20.6374g，产率73.88％。

四、制备

在50mL烧瓶中加入P10(644mg，0.4458mmol)和P17(1.6050g，4.4583mmol)，用二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜。反应完成后加入5g硅胶粉旋干。用二氯甲烷湿法匀浆装柱20cm×3.5cm。干法上样，柱层析。用1％NH₃·H₂O，2％MeOH/二氯甲烷至5％NH₃·H₂O，10％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩干燥得产品169.4mg，产率22.27％。

五、制备

在50mL烧瓶中加入P18(320mg，0.1894mmol)和TFA(0.145mL，1.8939mmol)，用二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜。TLC显示反应完成，直接蒸干，用MeOH溶解，加入碳酸氢钠(2.3863g，2.841mmol)中和多余的TFA，反应完成后加入5g硅胶粉旋干。用二氯甲烷湿法匀浆装柱15cm×2.5cm。干法上样，柱层析。用2％NH₃·H₂O，4％MeOH/二氯甲烷至5％NH₃·H₂O，10％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩干燥得产品228.7mg，产率76.02％。

六、制备6-135-2

在30mL圆筒瓶中加入P19(160mg，0.1006mmol，10.0)和分子量为40000的四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(400mg，0.01mmol)，用二氯甲烷(3mL)溶解，室温搅拌两周。将混合物旋干，将产品用水溶解，放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品432.1mg，产率100％。

实施例9

合成

一、制备

在1L的圆底烧瓶中将6-氨基己酸(50g，381.1847mmol)溶于1，4-二氧六环(300mL)，在0℃条件搅拌下加入2N NaOH水溶液(18.2967g/230mL，457.4217mmol),将反应移至室温，在搅拌条件下，加入Boc₂O，12小时后，将反应液浓缩至原有体系的30％，然后加入水(300mL)，用乙酸乙酯清洗(500mL×2)，用1M HCl将水相PH调至4左右，然后用乙酸乙酯萃取(500mL×5)，合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥2小时左右，过滤，将滤液旋干，用甲苯共沸除水三次，在真空泵下抽干，然后真空烘箱干燥5小时得产品103.79克，产率100％。

二、制备

将P20(20g，86.4230mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(39.7857g，345.6918mmol)和DMAP(2.1166g，17.2846mmol)加入到2L的圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(500mL)，在-5℃条件下搅拌10分钟，然后分批快速加入DCC(71g，345.6918mmol)，在-5℃条件下搅拌1小时，将反应移至室温搅拌过夜。过滤，将滤液蒸干，用乙酸乙酯溶解，加入约60g硅胶粉旋干做成固体溶液，干法上柱。柱层析，用10％乙酸乙酯/石油醚至50％的乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得产品17.8416克，产率64％。

三、制备

将P7(2.5g，1.7215mmol)和P21(1.1292g，3.4428mmol)置于200mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌过夜。反应中根据TLC监测补加P21(649.599mg，2.0658mmol)。反应结束后，浓缩。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱。湿法上样。柱层析，用1％NH₃·H₂O/2％甲醇/二氯甲烷至2％NH₃·H₂O/4％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品2.3933克，产率83.4％。

四、制备

将P22(2.1g，1.2611mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(20mL)，在室温搅拌下缓慢加入TFA(12.6115mmol，0.9664mL)。反应结束后，将反应液旋干，用无水甲醇溶解，加入碳酸氢钠固体(12.6115mmol，1.0595g)中和多余的TFA，过滤，在滤液中加入6g硅胶粉，做固体溶液。用二氯甲烷做溶剂匀浆装柱10cm×3.5cm。干法上样。柱层析，先用二氯甲烷洗脱，再用3％NH₃·H₂O/6％甲醇/二氯甲烷洗脱至5％NH₃·H₂O，10％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品1.5238克，产率100％。

五、制备4-181

将四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(2.5g，0.0625mmol)置于40mL直筒瓶中，然后加入约二氯甲烷(30mL)，在室温搅拌下加入P23(782.57mg，0.5mmol)，由于溶解度不好，加入DMF(2mL)，室温下遮光缓慢搅拌2周。将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，抽滤，真空烘干得产品2.4836g，产率96.7％。

实施例10

合成

将单臂聚乙二醇M-SC-12K(1.0g，0.08333mmol)置于50mL直筒瓶中，加入二氯甲烷(30mL)，在室温搅拌下加入P23(260.9mg，0.1667mmol)，由于溶解度不好，加入DMF(10mL)，室温下遮光缓慢搅拌2周。反应结束后，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品933.3mg，产率93％。

实施例11

合成

一、制备

在500mL的烧瓶中加入P3(2g，3.1343mmol)、P1(0.5491g，3.1343mmol)、HBTU(1.7644mg，4.7015mmol)和HOBT(635.3mg，4.7015mmol)，用DMF(20mL)溶解，将溶液在0℃低温恒温反应浴中冷却20分钟后，滴加DIEA(2.46mL14.1044mmol)。3小时后移至室温，搅拌过夜。将反应液倒入饱和NaHCO₃溶液(200mL)，用乙酸乙酯萃取(200mL×2)。有机相用饱和碳酸氢钠溶液(150mL)清洗，用饱和NaCl溶液(100mL)清洗。用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩将溶液蒸干，然后用二氯甲烷溶解。用二氯甲烷湿法匀浆装柱10cm×3.5cm。湿法上样。硅胶柱层析。用2％MeOH/二氯甲烷至4％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱。收集产品蒸干得2.2062g，产率88.5％。

二、制备

在50mL烧瓶中加入P24(2.2062g，2.7778mmol)，用二氯甲烷(5mL)溶解，再加入TFA(0.212mL，27.778mmol)，室温搅拌过夜。TLC显示反应未完成，补加1.5mL。次日反应完成，旋干，用MeOH溶解，加入碳酸氢钠(3g)中和，反应完成后加入15g硅胶粉旋干。用二氯甲烷湿法匀浆装柱30cm×3.5cm。干法上样。柱层析，先用2％MeOH/二氯甲烷洗脱，然后用1％NH₃.H₂O，2％MeOH/二氯甲烷至4％NH₃.H₂O，8％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩，真空烘干得产品1.639g，产率84.88％。

三、制备6-162

在烧瓶中加入P25(1.3903g，2.00mmol)和分子量为40000的四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(10g，0.25mmol)，用二氯甲烷(10mL)溶解，室温下搅拌。有些不溶物，补加DMF(80mL)后完全溶解。两周后将反应移至2L的烧瓶中，磁力搅拌加入***1.5L，产品完全析出，继续磁力搅拌10min，过滤得产品，用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，过滤，真空烘干得产品8.9895g，产率88％。

实施例12

合成

一、制备

将P25(5.0161g，7.2157mmol)和P5(1.5167g，3.4361mmol)置于500mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(200mL)，在室温下搅拌反应。反应结束后，加入10g硅胶粉旋干做成固体溶液。干法上样，柱层析。先用0.5％NH₃·H₂O/1％甲醇/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/8％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品4.006g，产率34.8％。

二、制备

在500mL圆底烧瓶中加入P26(5.4g，3.3718mmol)，用二氯甲烷(50mL)溶解，室温搅拌条件下缓慢滴加TFA(2.58mL，33.7176mmol)，搅拌过夜。反应结束，减压蒸干，将粗产品用无水甲醇溶解，加入碳酸氢钠固体(2.8g，33.7176mmol)中和，过滤，滤液中加入15g硅胶粉旋干。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱15cm×4.5cm。干法上样。柱层析，用1％NH₃.H₂O/2％MeOH/二氯甲烷至5％NH₃.H₂O/10％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩，真空烘干得纯产品4.6g，产率92％。

三、制备

将P27(3.4114g，2.2719mmol)和P21(2.2356g，6.8158mmol)置于500mL圆底烧瓶中，然后加入二氯甲烷(200mL)，室温下搅拌反应。反应中根据TLC监测补加P21(863.4mmg，2.6323mmol)。反应结束后浓缩。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱。湿法上样。柱层析，用2％NH₃·H₂O/4％甲醇/二氯甲烷至6％NH₃·H₂O/12％甲醇/CH₂Cl₂梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品2.3933克，产率83.4％。

四、制备

在500mL圆底烧瓶中加入P28(2.5g，1.4581mmol)，用二氯甲烷(50mL)溶解，室温搅拌下缓慢滴加TFA(1.117mL，14.5812mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后旋干，将粗产品用无水甲醇溶解，加入碳酸氢钠(1.2249g，14.58124mmol)中和剩余的TFA，过滤，在滤液中加入8g硅胶粉做成固体溶液。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱。干法上样。柱层析，用2％NH₃·H₂O/4％甲醇/二氯甲烷至5％NH₃·H₂O/10％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品3.1克，产率100％。

五、制备4-199

将分子量为40000的四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(1.0g，0.02409mmol)置于30mL直筒瓶中，然后加入二氯甲烷(20mL)，在室温搅拌下加入P29(311.2mg，0.19275mmol)，由于溶解度不好，加入DMF(2mL)。室温下遮光缓慢搅拌反应2周。反应结束后，加***沉降，过滤，粗产品用二氯甲烷溶解，再加***沉降，过滤，收集产品干燥得1.0322g，产率100％。

实施例13

合成

将单臂的聚乙二醇M-SC-12K(1.0g，0.08333mmol)置于50mL直筒瓶中，然后加入二氯甲烷(30mL)，室温搅拌下加入P29(269.1mg，0.1667mmol)，由于溶解度不好，加入DMF(10mL)，室温下遮光缓慢搅拌反应2周。反应结束后，加***沉降，过滤，粗产品用二氯甲烷溶解，再用***沉降，收集产品干燥得847.6mg，产率76％。

实施例14

合成

一、制备

将P27(4.4g，2.9303mmol)和P5(616.0mg，51.3954mmol)置于500mL圆底烧瓶中，然后加入二氯甲烷(100mL)，在室温下搅拌反应。至反应结束后，停止反应，加入20g硅胶粉做固体溶液。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱12cm×8.5cm。干法上样。柱层析，用3％NH₃·H₂O/6％MeOH/二氯甲烷至5％NH₃·H₂O/10％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品1.5g，产率17％。

二、制备

在500mL圆底烧瓶中加入P31(1.5g，0.4725mmol)，用二氯甲烷(50mL)溶解，在室温搅拌条件下缓慢滴加TFA(0.3621mL，4.72526mmol)，置于室温搅拌过夜。反应结束，停止反应，旋干，将粗产品用无水甲醇溶解，加入碳酸氢钠中和，过滤，滤液中加入适量硅胶粉做成固体溶液。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱3.5cm×7cm。干法上样。柱层析，用3％NH₃·H₂O/6％MeOH/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/8％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩真空烘干得2.2克，产率100％。

三、制备

在250mL圆底烧瓶中加入P32(2.5g，0.8663mmol)和P21(852.4mg，2.5989mmol)，用二氯甲烷(50mL)溶解，室温下搅拌过夜。湿法装硅胶柱12cm×4.5cm。反应完全后湿法上样。用2％NH₃·H₂O/4％MeOH/二氯甲烷至3％NH₃·H₂O/6％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品点，减压浓缩蒸干得产品26212g，产率976％。

四、制备

在50mL圆底烧瓶中加入P32(200mg，0.06454mmol)，以二氯甲烷(5mL)溶解，室温搅拌下缓慢加入TFA(0.04945mL，0.6454mmol)，搅拌过夜。减压旋干，将粗产品用甲醇溶解，加入碳酸氢钠搅拌中和TFA。过滤，将滤液做成硅胶粉固体溶液。匀浆法装硅胶柱4.5cm×7.4cm。干法上样。柱层析，先用二氯甲烷洗脱，再用2％MeOH/CH₂Cl₂至5％MeOH/二氯甲烷洗脱，然后用2％NH₃·H₂O/5％MeOH/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/8％MeOH/二氯甲烷梯度洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得产品137.4mg，产率70.9％。

五、制备4-226

取单臂的聚乙二醇M-SCM-40K(352.5mg，0.008813mmol)置于直筒瓶中，加入P33(72.6mg，0.02421mmol)，用二氯甲烷(5mL)溶解，室温避光下搅拌2周。浓缩，加入***沉降，过滤得粗产品；将粗产品用二氯甲烷溶解，再加入***沉降，真空烘干得150mg，产率43％。

实施例15

合成

一、制备

取P3(7.1g，11.1267mmol)置于500mL烧瓶中，加入Boc-Leu(2.5735g，11.1267mmol)、HBTU(6.2636g，16.6900mmol)、HOBT(2.2552g，16.6900mmol)和DMF(300mL)，于0℃条件下搅拌30分钟，滴加DIEA(8.7218mL，50.0702mmol)，1小时后移至室温下搅拌过夜。将反应液倒入到饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯(400mL)萃取，水相再用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液清洗(200mL×2)，再用饱和NaCl溶液清洗(200mL×2)。有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，蒸干。粗产品湿法上样过硅胶柱纯化，用3％甲醇/二氯甲烷至5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得9.96g，产率100％。

二、制备

取P34(9.8394g，11.5568mmol)置于500mL烧瓶中，加入二氯甲烷(70mL)溶解，加入TFA(10mL)，室温下搅拌过夜。蒸干，粗产品用甲醇溶解，加入碳酸氢钠中和多余的TFA。过滤，加入硅胶粉(40g)至滤液中，旋蒸制成固体溶液，干法上样过硅胶柱纯化。先用3％甲醇/二氯甲烷至5％甲醇/二氯甲烷洗脱，再用2％NH₃·H₂O/5％甲醇/二氯甲烷至3％NH₃·H₂O/7％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得6.75克，77.74％。

三、制备

取P35(6.657g，8.8610mmol)置于500mL烧瓶中，加入Boc-Phe(2.3509g，8.8610mmol)、HBTU(4.9882g，13.2915mmol)、HOBT(1.7960g，13.2915mmol)和DMF(400mL)，于0℃下磁力搅拌30分钟，滴加DIEA(6.9485mL，39.8745mmol)，1小时后移至室温，搅拌过夜。将反应液倒入到饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯(400mL)萃取，水相再用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液清洗(200mL×3)，再用饱和NaCl溶液清洗(200mL×3)。有机相以无水MgSO₄干燥，过滤，蒸干。粗产品用二氯甲烷溶解，湿法上样过硅胶柱纯化。先用二氯甲烷洗脱，再用2％甲醇/二氯甲烷至7％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得8.9151g，产率100％。

四、制备

取P36(8.8209g，8.8335mmol)置于250mL烧瓶中，加入二氯甲烷(70mL)，再加入TFA(6.7688mL，88.3350mmol)，室温下搅拌过夜。蒸干，粗产品用甲醇溶解，加入碳酸氢钠中和，过滤，加入硅胶粉(60g)至滤液中，旋蒸制成固体溶液，干法上样过硅胶柱纯化。先用二氯甲烷洗脱，然后用5％甲醇/二氯甲烷洗脱，再用2％NH₃·H₂O/5％甲醇/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/8％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得8.8842g，产率100％。

五、制备

取P37(8.7882g，9.7815mmol)置于1L烧瓶中，加入P1(1.7135g，9.7815mmol)、HBTU(5.5063g，14.6723mmol)、HOBT(1.9825g，14.6723mmol)和DMF(400mL)，于0℃条件下搅拌30分钟，滴加DIEA(7.6673mL，44.0168mmol)，2小时后移至室温下，搅拌过夜。将反应液倒入到饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯(500mL)萃取，水相再用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。合并有机相用饱和碳酸氢钠溶液清洗(200mL×3)，再用饱和NaCl溶液清洗(200mL×3)。有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，蒸干，粗产品用二氯甲烷溶解，湿法上样过硅胶柱纯化。先用二氯甲烷洗脱，然后用2％甲醇/二氯甲烷至7％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得产品8.2468g，产率79.87％。

六、制备

取P38(8.1332g，10.1936mmol)置于250mL烧瓶中，加入二氯甲烷(70mL)溶解，缓慢加入TFA(10mL)，室温下搅拌过夜。次日补加TFA(2mL)，反应完成后停止反应，蒸干，粗产品用甲醇溶解，加入碳酸氢钠中和，过滤，加入硅胶粉(60g)至滤液中，旋干制成固体溶液，干法上样过硅胶柱纯化。先用二氯甲烷洗脱，然后用2％甲醇/二氯甲烷洗脱，最后用1％NH₃·H₂O/3％甲醇/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/8％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得产品6.4309g，产率90.42％。

七、制备7-129

取四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(3.9847g，0.09962mmol)置于500mL烧瓶中，加入P39(0.7616g，0.7970mmol)，以二氯甲烷(80mL)溶解，室温避光下搅拌2周。浓缩，加入***沉降，过滤得粗产品，将粗产品用二氯甲烷溶解，再用***沉降，过滤干燥得产品4.3973g，产率92.93％。

实施例16

合成

一、制备

取P39(3.6671g，3.8379mmol)置于250mL烧瓶中，加入P5(806.7mg，1.8275mmol)，然后加入二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌5天。加入甲醇将产品溶解，然后加入硅胶粉(30g)制成固体溶液，干法上样过硅胶柱纯化。用0.5％NH₃·H₂O/1％甲醇/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/7％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得产品3.55g，产率83.62％。

二、合成

取P40(3.5g，1.6492mmol)置于500mL烧瓶中，加入二氯甲烷(50mL)溶解，再缓慢加入TFA(2mL)，于室温下搅拌过夜，后又补加TFA(4mL)，过夜。停止反应，旋干，粗产品用甲醇溶解，加入碳酸氢钠中和，过滤，加入硅胶粉(40g)至滤液中，旋干制成固体溶液，干法上样过硅胶柱纯化。先用0.5L二氯甲烷洗脱，然后用2％NH₃·H₂O/5％甲醇/二氯甲烷至4％NH₃·H₂O/8％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得产品3.1333g，产率93.96％。

三、制备

取P41(3.0423g，1.5045mmol)置于100mL烧瓶中，加入P21(0.9870g，3.0091mmol)和二氯甲烷(20mL)，室温下搅拌4天。浓缩，然后加入正己烷沉降，过滤干燥得产品2.9822g，产率8869％。

四、制备

取P42(2.8756g，1.2866mmol)置于500mL烧瓶中，加入二氯甲烷(20mL)，再缓慢滴加TFA(2mL)，室温下搅拌过夜。旋干，粗产品用甲醇溶解，加入碳酸氢钠中和多余的TFA。过滤除去固体杂质，加入硅胶粉(30g)至滤液中，旋干制成固体溶液，干法上样过硅胶柱纯化。先用二氯甲烷洗脱，然后用2％甲醇/二氯甲烷至5％甲醇/二氯甲烷洗脱，再用2％NH₃·H₂O/5％甲醇/二氯甲烷至5％NH₃·H₂O/10％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，浓缩干燥得产品1.9896g，产率72.43％。

五、制备7-172

取四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(2.5g，0.0625mmol)置于直筒瓶中，加入二氯甲烷(20mL)和P43(1.0724g，0.5mmol)，室温避光下搅拌2周，用DMF转移至200mL烧瓶中再反应7天。旋蒸浓缩，然后加入无水***沉降，过滤得粗产品；然后将粗产品用二氯甲烷和甲醇溶解，加入***沉降，过滤干燥得产品1.7192g。

实施例17

合成

取单臂的聚乙二醇M-SC-12K(1g，0.0833mmol)置于直筒瓶中，加入二氯甲烷(5mL)和P43(357.4796mg，0.1667mmol)，室温避光下搅拌2周，用DMF转移至100mL烧瓶中继续反应9天。旋蒸浓缩，加入无水***沉降，过滤得粗产品；然后将粗产品用二氯甲烷和甲醇溶解，加入***沉降，过滤干燥得产品0.9927g，产率84.93％。

实施例18

合成

一、制备

在烧瓶中加入L-天冬氨酸(15g,112.70mmol)用H2O/DMF(150mL/120mL)溶解。室温条件下边搅拌边加入三乙胺(31.41mL,225.39mmol)，然后加入Boc2O(25.09g,114.95mmol)，最后加入DMF(60mL)搅拌，过夜。用旋转蒸发仪直接蒸干，用乙酸乙酯(500mL)溶解，用1M HCl(90mL)中和。分离出水相，在水相中加入NaCl，至其不再溶解为止，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。合并有机相用水(200ml)和饱和食盐水(200ml)清洗。用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，真空干燥得产品302g，产率100％。

二、制备

在500mL的三颈烧瓶中入5-70(1.8462g，7.9180mmol)、5-64(10.6125g,16.6278mmol)、HBTU(8.9146g,23.7539mmol)和HOBT(3.2096g,23.7539mmol),用DMF(300mL)溶解，将溶液在-5℃低温恒温反应浴中冷却20分钟，然后滴加DIEA(12.63mL,71.2617mmol)。30分钟后移至室温搅拌，过夜。反应停止，将反应液倒入饱和NaHCO₃溶液(200mL)中，用乙酸乙酯萃取(400mL)，然后用饱和NaHCO₃溶液(200mL×3)清洗有机相，再用饱和NaCl溶液(300mL×2)清洗。最终的有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，然后减压浓缩将溶液蒸干。将粗品用二氯甲烷溶解，加入30g硅胶粉做成固体溶液，柱层析，用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱，用1％NH₃.H₂O/2％MeOH/CH₂Cl₂至2％NH₃.H₂O/4％MeOH/CH₂Cl₂梯度洗脱。收集产品，蒸干得6.2g，产率53.2％。

三、制备

在烧瓶中加入5-75(6g,4.0715mmol)，用CH₂Cl₂(50ml)溶解，在室温搅拌下缓慢滴加TFA(3.1199mL，40.7152mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束，减压蒸干，将粗品用无水甲醇溶解，加入NaHCO₃固体中和。过滤，将滤液做成硅胶粉固体溶液。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱。干法上样。柱层析，用2％NH₃.H₂O/2％MeOH/CH₂Cl₂至2.5％NH₃.H₂O/5％MeOH/CH₂Cl₂梯度洗脱。收集产品，减压浓缩蒸干得3.3g产率60％。

四、制备

将5-78(1.0g，0.7280mmol)和P21(478.1mg，1.4561mmol)置于200mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩。用二氯甲烷做溶剂匀浆湿法装柱。湿法上样。柱层析，用1％NH₃·H₂O/2％甲醇/二氯甲烷至2％NH₃·H₂O/4％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品5-85:808.7mg，产率70％。

五、制备

将5-85(2.0g，1.2602mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(20mL)，室温搅拌下缓慢加入TFA(12.6022mmol，0.9657mL)。反应结束后，将反应液旋干，用甲醇溶解，加入碳酸氢钠固体中和多余的TFA，过滤，在滤液中加入硅胶粉做成固体溶液，干法上样。柱层析10cm×3.5cm，用二氯甲烷做溶剂匀浆装柱。先用二氯甲烷洗脱，再用3％NH₃·H₂O/6％甲醇/二氯甲烷洗脱至5％NH₃·H₂O/10％甲醇/二氯甲烷梯度梯度洗脱，收集产品，减压浓缩蒸干得产品5-99:1.78克，产率95.0％。

六、制备5-123

将四臂的聚乙二醇4ARM-SCM-40K(1.0g，0.02409mmol)置于50mL直筒瓶中，加入二氯甲烷(20mL)，室温搅拌下加入5-99(286.6mg，0.01928mmol)，由于溶解度不好，加入DMF(15mL)，室温遮光下缓慢搅拌2周。反应结束后，将混合物旋干，将产品用水溶解放入透析袋透析。然后将产品的水溶液减压浓缩，真空干燥后用二氯甲烷溶解，边搅拌边加入无水***将其沉淀出来，抽滤，真空烘干得产品5-123:1.132g，产率100％。

测试上述实施例的¹H-NMR谱图和质谱图，如图25-55所示。

聚乙二醇化拉帕替尼的性能考察实验

实验1、细胞毒性测试

利用MTS检测方法，测定化合物对人恶性胶质瘤细胞株(U87)、人胃癌细胞株(N87)、人肺癌细胞株(CALU-3)、人乳腺癌细胞株(BT474)以及人乳腺癌细胞株(SK-BR-3)增殖的抑制作用。

待测化合物共13组。第一、二组分别为拉帕替尼和索拉菲尼的DMSO溶液，浓度均为0.1M。第三至八组分别为6-56、6-162、7-172、4-181、4-208、7-129的生理盐水溶液。第九至十三组分别为6-56、6-162、7-172、4-181、7-129的95％乙醇溶液。

一、对于U87、CALU-3、N87和BT474四株细胞(待测定化合物采用无菌生理盐水溶解)

U87和CALU-3用EMDM+10％FBS+1％P/S进行培养，N87和BT474用1640+10％FBS+1％P/S进行培养，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。2～3天传代一次。待细胞长至培养瓶底约80％时，胰酶消化细胞，准确计数，以3000个/100μL/孔的量接入96孔板中，空白组直接加入不含细胞的培养液，24小时后待细胞贴壁后使用。吸去孔板中的细胞培养液，对应加入待测化合物梯度稀释应用液。将细胞置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，72小时后吸去培养液，继续加入待测化合物梯度稀释应用液，培养48小时。到达作用时间后，每孔加入10μL MTS，37℃孵育3小时，于Sunrise酶标仪上检测OD 492nM。

二、对于SK-BR-3细胞的测定(待测定化合物采用无水乙醇溶解)

SK-BR-3采用1640+10％FBS+1％P/S进行培养。细胞培养的其它条件、步骤与上述四株细胞相同。待测化合物的作用方式也与上述四株细胞相同。

实验结果

待测化合物对癌细胞抑制率的曲线如图1-23所示，从图中可得出以下结论：

1、与其它待测化合物相比，化合物4-208在生理盐水中的溶解度较好。所有待测化合物在95％乙醇中的溶解性大于生理盐水中的溶解性。

2、所有待测化合物在生理盐水中都表现出了一定程度的抑制活性，并且溶解度较好的化合物4-208的活性最强。所有待测化合物95％乙醇中的药物活性大于在生理盐水中的药物活性。可以推测出6-56以及6-162两个化合物的IC₅₀值约在20μM附近。

3、本实验中的原药拉帕替尼(LPT)显示出了较好的活性，本实验的阳性药Sorafenib的IC₅₀为μM级别，这与文献值是一致的，说明本***是可靠的。

实验2、聚乙二醇偶联拉帕替尼的动物耐受性实验

一、考察6-56和6-162单次尾静脉给药时动物的耐受性

在Balb/c雌性小鼠上，予以不同剂量的受试物6-56和6-162单次尾静脉给药，具体为：将小鼠随机分成7组，每组3只，给药一天，给药当天为D1，给药后观察小鼠体重及临床症状一周，D7处死。

结果如表1所示。6-56给药3-4天后，体重下降了2.8％-10.1％，给药7天后体重基本恢复；而Ctrl组和受试物2给药后体重一直呈上升趋势；并且所有组别在给药期间均未观察到动物死亡。说明6-56的耐受性较低，而6-162基本无毒副作用。

表1 6-56和6-162单次尾静脉给药时动物的体重变化

二、考察6-56和6-162多次尾静脉给药时动物的耐受性

在Balb/c雌性小鼠上，予以不同剂量的受试物6-56和6-162多次尾静脉给药，具体为：将小鼠随机分成3组，每组3只，分别在1，6，11，16天给药，给药当天分2次给(间隔时间6小时)，共给药8次。给药当天为D1，给药后观察小鼠体重及临床症状，D16末次给药后一周内处死。

结果如表2所示，6-56(20mg/kg)给药组小鼠在给药6天左右，体重正常上升；在给药6-16天期间体重变化较小，基本维持不变。而溶剂对照组和6-162(60mg/kg)给药组小鼠给药后体重一直呈上升趋势。所有组别在所选定的剂量下，未观察到动物死亡。

表2 6-56和6-162多次尾静脉给药时动物的体重变化

三、7-129药物耐受实验

BALB/c小鼠，采用无水乙醇溶解，超声辅助，当药物完全溶解后再添加生理盐水后达到药物溶解效果。药物分为生理盐水对照组和7-129药物模型组。药物溶解方式为7.75mg药物超声悬浮于15ul无水乙醇后加水45ul溶解，37℃持续水浴。实验分组：对照组单次，模型组单次(共注射20mg/kg)，对照组多次，模型组多次(上午和下午各尾静脉注射一次，每次注射量为10mg/kg)。

实验结果

1、药物耐受实验单次组：经过1周的观察，和生理盐水相比，毛发无差异；体重变化无明显差异；无恶心、呕吐、腹泻、食欲、消化不良、皮肤干燥、皮疹、皮肤红肿、搔痒、疼痛、背痛、呼吸困难、疲倦及失眠等情况发生。体内器官肉眼观看无差异。小鼠睡眠和活跃情况无差异；小鼠***和排便情况无差异，未有腹泻情况。

2、药物耐受实验多次组：经过1周的观察，和生理盐水相比，毛发不顺，不光亮顺滑。体重变化无明显差异；无恶心、呕吐、腹泻、食欲、消化不良、皮肤干燥、皮疹、皮肤红肿、搔痒、疼痛、背痛、呼吸困难、疲倦及失眠等情况发生。体内器官肉眼观看无差异。小鼠睡眠和活跃情况无差异；小鼠***和排便情况无差异，未有腹泻情况。

实验3、聚乙二醇偶联拉帕替尼的小鼠活体疗效

小鼠成瘤：SK-BR-3细胞培养至数瓶后，胰酶消化，PBS洗涤计数后使用无血清1640培养基重悬，是溶液密度达到1*10E7/mL，碎冰上放置待用。NOD小鼠接种部位剃毛，使用一次性无菌注射器接种SK-BR-3细胞，0.2mL/支，接种后使用酒精棉球擦拭以杀死溢出的细胞，放回笼中正常饲养。

活体治疗：

原药LPT：生理盐水分散，1g分散于200mL生理盐水中，均匀分散。在中午口服灌胃20mg/kg。7-129：分为上午和下午各注射一次10mg/kg(折算剂量)，间隔时间6-7小时，共计20mg/kg。

实验分组：原药多次给药组；7-129多次给药组；生理盐水组。

实验结果

肿瘤生长曲线如图24所示，与原药相比，7-129对肿瘤显示出了更高的抑制性，说明拉帕替尼在聚乙二醇化之后，药效显著提高。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.聚乙二醇化拉帕替尼，其通式为：

A选自单臂或多臂的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物取代基；X选自 Y和M分别独立地选自带氨基的双羧酸取代基或其相应的酰基取代物取代基；N选自氨基酸取代基或肽取代基；LPT为拉帕替尼取代基；

a＝0或1；b＝0或1；c＝1或2；d＝1或2；e等于A的臂数。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，当a、b均为0时，c、d均为1；当a＝0，b＝1时，d＝1。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，所述带氨基的双羧酸为谷氨酸或天冬氨酸。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，A选自单臂、四臂或八臂的聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物取代基。

5.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，A的分子量为12000、20000或40000道尔顿。

6.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，Y和M分别独立地选自以下化合物的取代基：

7.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，N为甘氨酸取代基。

8.根据权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼，其特征在于，分子式为

9.权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤B：使所述第一中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物发生酰胺化反应，得到第二中间产物；

步骤C：使所述第二中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物发生酰胺化反应，得到第三中间产物；

10.根据权利要求9所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，拉帕替尼与肽/氨基酸发生酰胺化反应的条件为：以HBTU、HOBT、DMF和DIEA为助剂，在-2～4℃下反应，并且拉帕替尼、肽/任意氨基酸、HBTU、HOBT和DIEA之间的摩尔比为：1:0.8～1.2:1.3～1.7:1.3～1.7:4.2～4.8。

11.根据权利要求10所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，使拉帕替尼与肽或氨基酸发生酰胺化反应之前还包括：用叔丁氧羰基保护所述肽或氨基酸的氨基。

12.根据权利要求9所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，拉帕替尼与肽发生酰胺化反应的方法为：拉帕替尼与所述肽的端头涉及的游离氨基酸反应，得到的产物再按照所述肽中氨基酸的排序依次与所述肽涉及的其它游离氨基酸反应，并且上述反应中的游离氨基酸在参与反应之前：用N-羟基琥珀酰亚胺活化所述游离氨基酸的羧基。

13.根据权利要求9所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，所述第一中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物酰胺化反应的条件为：所述第一中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物的摩尔比≥2。

14.根据权利要求13所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，步骤B：使所述第一中间产物与谷氨酸发生酰胺化反应，所述第一中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物发生酰胺化反应之前还包括：用N-羟基琥珀酰亚胺活化谷氨酸的羧基。

15.根据权利要求9所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，所述第二中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物酰胺化反应的条件为：所述第二中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物的摩尔比≥2。

16.根据权利要求15所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，若步骤B中，使所述第一中间产物与谷氨酸发生酰胺化反应，所述第二中间产物与带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物发生酰胺化反应之前还包括：用N-羟基琥珀酰亚胺活化带氨基的双羧酸或其相应的酰基取代物的羧基。

17.根据权利要求9所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，所述步骤D中，使所述第三中间产物与聚乙二醇或其衍生物发生酰胺化反应之前还包括：用N，N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯、N，N'-琥珀酰亚胺基乙酸酯或N，N'-琥珀酰亚胺基戊二酸酯活化聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物。

18.根据权利要求17所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，所述第三中间产物与聚乙二醇的摩尔比大于1.5。

19.根据权利要求17所述的聚乙二醇化拉帕替尼的制备方法，其特征在于，用N，N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯、N，N'-琥珀酰亚胺基乙酸酯或N，N'-琥珀酰亚胺基戊二酸酯活化聚乙二醇或聚乙二醇的衍生物，得到第四中间产物，所述第三中间产物与所述第四中间产物以二氯甲烷为溶剂，在20-30℃下发生酰胺化反应。

20.权利要求1所述的聚乙二醇化拉帕替尼的注射剂，其特征在于，包括：所述聚乙二醇化拉帕替尼和溶剂，所述溶剂为生理盐水和/或95％乙醇。