CN104977415A - Metrnl蛋白作为炎症性肠病诊断血清标志物的应用及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及METRNL蛋白作为炎症性肠病诊断血清标志物的应用及其试剂盒。本发明首次证实了METRNL蛋白可以作为炎症性肠病诊断的血清标标志物，可以通过检测血清中的METRNL蛋白浓度来诊断和预示炎症性肠病，具有取样方便、易于检测等优点。本发明不仅为METRNL蛋白提供了新用途，也为炎症性肠病提供了更有效的诊断方法。

Description

METRNL蛋白作为炎症性肠病诊断血清标志物的应用及其试剂盒
技术领域
本发明涉及临床诊断技术领域，具体地说，是METRNL蛋白作为肠道炎症诊断血清标志物的应用及其试剂盒。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)又称肠炎，是一组反复发作的慢性肠炎症性肠道疾病。炎症性肠病主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)两类。在发达国家，IBD的发病率达到了1/1000。在中国，近十年间炎症性肠病的总病例约为35万。值得注意的是，该病患病人数在逐年增加，与前10年相比，炎症性肠病总病例数增长约超过24倍，其中，克罗恩病患者数量增长甚至超过15倍。溃疡性结肠炎病变主要位于结肠的黏膜层，且以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，但可向近端扩展，以致遍及整个结肠，其重要症状有腹泻、脓血便、腹痛和里急后重，该病病程长，病情轻重不一，常反复发作，与结肠癌的发病有关，临床上常常表现为反复发作而治愈难度大，被世界卫生组织列为现代难治病之一。
目前，肠镜、病理学及影像学检查是诊断及炎症性肠病患者定期复查的主要手段，这些检查费用较高，大多数为侵入性的有创检查，风险高，而该疾病病程偏长，患者常需反复定期复查肠镜及其他检查，患者的忍受性差，严重影响了患者的生活质量及工作。因此，急需寻找一种对炎症性肠病诊断特异性高，创伤小，操作简单，方便高危人群，能够检测疾病的发展及预后的血清标志物，这样无论是对临床还是对患者带来很大的利益。
Metrnl蛋白共由311个氨基酸组成，在NCBI中的注册号为NM_001004431.1，注释为人神经胶质细胞分化调节因子meteorin样分子。Metrnl蛋白已经在人、小鼠、牛、鸡、非洲瓜蟾和斑马鱼中鉴定出来。
中国专利文献CN200980137344.4，公开了Metrnl的治疗用途，用于制备治疗神经***的疾病、疾患或损害的药物，并指出Metrnl是分泌性生长因子，可促进神经迁移、再生和分化，可用于治疗一般性的神经***疾病，特别是用于治疗涉及脑、脑干或脊髓和/或外周神经损伤的疾病。中国专利文献CN201310525184.9，公开了Metrnl蛋白在制备降血糖药物或保健食品中的应用。
然而，目前关于Metrnl蛋白作为炎症性肠病诊断血清标志物的应用及其试剂盒，还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种METRNL蛋白或其特异性抗体的用途。
本发明的再一的目的是，提供一种用于检测炎症性肠病的诊断试剂盒。
本发明的另一的目的是，提供所述试剂盒的用途。
本发明的第四个目的是，提供一种METRNL蛋白的用途。 
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
METRNL蛋白或其特异性抗体的用途，用于制备检测炎症性肠病的诊断试剂或试剂盒。
所述的检测是血清检测。
所述的炎症性肠病是克罗恩病。
所述的炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于检测炎症性肠病的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含测定血清中METRNL蛋白含量的试剂。
所述的测定血清中METRNL蛋白含量的试剂为METRNL蛋白的特异性抗体。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的诊断试剂盒的用途，用于制备检测炎症性肠病的诊断试剂或试剂盒。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种METRNL蛋白的用途，它被用作检测炎症性肠病的标志物。
本发明优点在于：
本发明首次证实了METRNL蛋白可以作为炎症性肠病诊断的血清标标志物，可以通过检测血清中的METRNL蛋白浓度来诊断和预示炎症性肠病，具有取样方便、易于检测的优点。本发明不仅为METRNL蛋白提供了新用途，也为炎症性肠病提供了更有效的诊断方法。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例
一、实验材料 
健康雄性SD大鼠30只，体质量180-200g，由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供，葡聚糖硫酸钠Sigma公司生产。试剂盒购自美国R&Dsystems，试剂盒全称：Mouse/Meteorin-like/METRNL DuoSet，货号：DY6679，组成：捕获抗体1瓶、检测抗体1瓶、标准品3瓶和Streptavidin-HRP1瓶，另外洗脱液和稀释液按照说明书自行配制。反应底物TMB单组分显色液购自Solarbio，货号：PR1200。96孔板购自购自Costar，货号：34012001。Bovine Serum Albumin购自Sigma货号：WXBB6634V。
二、实验方法 
葡聚糖硫酸钠诱导的UC模型与人类UC的病理形态极为近似，选用SD大鼠建立UC动物模型，并观察正常组与DSS模型组大鼠血清中的METRNL蛋白的表达。将葡聚糖硫酸钠溶于蒸馏水配置成3％的DSS溶液，30只SD大鼠随机分为2组，正常对照组、DSS模型组，每组各9只。模型组大鼠给予3％的DSS溶液自由饮用，正常组给予等量的生理盐水，记录每只大鼠DSS的饮用量，确保各组DSS饮用量大致相等。每日观察大鼠一般状态和体重变化，观察粪便性状及便血情况，根据Cooper HS评分标准，进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分，评估大鼠结肠粘膜炎症损伤情况。评分标准：体质量不下降计为0分，下降1％-5％为1分，下降5％-10％为2分，下降10％-15％为3分，下降>15％为4分；大便正常为0分，松散为2分，稀便为4分；大便潜血正常为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分，肉眼血便为4分。实验进行10d后，处死大鼠，取下结肠，4％中性***固定，石蜡包埋切片后进行染色，镜下观察肠黏膜损伤情况，根据Cooper HS评分标准，观察15个放大100视野，取平均值，观察组织学损伤评分。评分标准：正常结肠黏膜记为0分；结肠隐窝腺体丢失三分之一者为1分；隐窝腺体丢失三分之二为2分；若隐窝腺体全部丢失，黏膜上皮完整，伴有轻度炎性细胞浸润为3分；黏膜上皮糜烂、破坏，伴有明显炎性细胞浸润为4分。
大鼠血清样本中METRNL蛋白浓度的检测，双抗一步夹心法酶联免疫吸附(ELISA)法。实验方法按照试剂盒说明书进行，主要实验步骤如下：
微孔酶标板的制备：
1、2.0ug/ml 100ul捕获抗体加入96孔板中室温孵育过夜；
2、用洗脱液洗板三次；
3、以300ul稀释液封闭至少1h；
4、用洗脱液洗板三次。
测量：
1、加100ul样品或者标准品在制备好的96孔板中，室温孵育至少2h；
2、用洗脱液洗板三次；
3、0.5ug/ml100ul检测抗体加入每孔，室温孵育2h；
4、用洗脱液洗板三次；
5、每孔加100ul稀释后的Streptavidin-HRP避光孵育20min；
6、用洗脱液洗板三次；
7、每孔加100ul反应底物避光孵育20min；
8、每孔加50ul终止液，并在450nm测量OD值。根据标准曲线计算出样品的浓度，单位是ng/ml。
三、实验结果 
(1)正常对照组大鼠活动自如，反应灵敏，大便正常，毛色光泽，体重增加；模型组大鼠饮用3％DSS8d后出现稀便、血便或脓血便、大便潜血实验阳性，体重减轻，活动进食均减少。DAI评分显示模型组大鼠DAI升高，与正常对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。光镜下观察正常大鼠结肠黏膜完整连续，腺体排列规则整齐，无炎细胞浸润和溃疡形成。而模型组大鼠结肠充血水肿，黏膜丧失，糜烂、溃疡、出血，腺体排列絮乱，可见大量炎细胞浸润，以上结果说明造模成功。
表1正常组和模型组大鼠DAI评分和组织学评分比较
组别 DAI评分 组织学评分
正常组 0.00±0.00 0.00±0.00
DSS模型组 8.80±1.20* 4.60±0.60*
与正常组比较，*P<0.05。
(2)两组大鼠血清样本中METRNL的检测结果 
表2
METRNL浓度(ng/ml) 正常组 DSS模型组
  648 5331
   21 6253
  340 5621
  234 6222
  870 6180
  1515 6071
  317 5879
  580 5982
  1812 6134
平均值 704 5964
标准差 602 309
四、结果分析 
正常大鼠血清中METRNL蛋白浓度的平均值为704ng/ml，而DSS模型组中METRNL蛋白浓度的平均值为5964ng/ml，远高于正常小鼠，这说明大鼠诱导炎症性肠病后血清中METRNL蛋白表达增加了数倍。为了证明炎症性肠病对于METRNL蛋白的升高是特异的，我们分别检测了45例正常人、METRNL平均浓度是466.3±371.4ng/ml。62例克罗恩病患者、METRNL平均浓度是4632.8±410.4ng/ml。51例溃疡性结肠炎患者、METRNL平均浓度是5711.4±486.6ng/ml。46例直肠癌患者、METRNL平均浓度是651.4±491.6ng/ml。62例肠结核患者、METRNL平均浓度是641.5±457.6ng/ml。48例肠道淋巴瘤患者、METRNL平均浓度是726.5±587.6ng/ml和55例细菌性痢疾患者、METRNL平均浓度是643.5±539.6ng/ml，发现炎症性肠病患者血清中METRNL的升高是比较特异的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.METRNL蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备检测炎症性肠病的诊断试剂或试剂盒。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是血清检测。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的炎症性肠病是克罗恩病。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
5.一种用于检测炎症性肠病的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含测定血清中METRNL蛋白含量的试剂。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的测定血清中METRNL蛋白含量的试剂为METRNL蛋白的特异性抗体。
7.权利要求5或6所述的诊断试剂盒的用途，其特征在于，用于制备检测炎症性肠病的诊断试剂或试剂盒。
8.一种METRNL蛋白的用途，其特征在于，它被用作检测炎症性肠病的标志物。
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