CN104975079A - 基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法及检测试剂盒。其工作原理为：17b-***与核酸适体相互作用，启动链置换反应，不断打开三组茎环DNA探针，形成DNA纳米结构，在该DNA纳米结构中的三条DNA臂末端形成具有催化活性的G四聚体。G四聚体与氯高铁血红素结合，从而形成具有类似HRP的催化活性，催化氧化TMB，产生蓝色底物，结果肉眼可见，17b-***的浓度与蓝色深浅直接相关。本发明操作简单，可在室温下完成整个反应，具有较高的灵敏度，对17b-***的检测限为100 fM，具有很好的特异性，检测结果直接肉眼可见，无需任何检测仪器，可用于17b-***的实地现场快速检测。

Description

基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种DNA纳米结构用于17-***可视化检测方法及检测试剂盒。
背景技术
17β-***(17β-estradiol,E2)是一类作用最强烈、最具潜在危害的内分泌干扰物，广泛存在于河流、土壤、水源、大气以及农产品中。它主要来源于杀虫剂、废气、食品添加剂、人畜***物及生活污水，即使在极低的浓度下也会对生物体产生明显的影响，其含量水平与***癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及男性生殖障碍具有显著相关性。传统的17β-***检测方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等，这些方法需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，需要经验丰富的操作人员难以实现大批量样本的现场快速分析。另一种方法是以抗体来检测17β-***，但是抗体的制备过程繁琐，保存麻烦，而且要涉及多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。
发明内容
为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测试剂盒，其包括如下组分：
(1)DNA1：17β-***的核酸适体的5'或3’端延伸至少24碱基，形成DNA1，其从5’至3’依次包括5单元、2*单元、5单元、1*单元和17β-***核酸适体单元；
(2)DNA2：DNA2与DNA1的1*单元和部分17β-***核酸适体单元互补；
(3)茎环DNA探针A：从5’到3’依次包括4单元、1单元、5*单元、2单元、5*单元、5单元、3*单元、5单元、2*单元、5单元；
(4)茎环DNA探针B：茎环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、2单元、5*单元、3单元、5*单元、5单元、1*单元、5单元、3*单元、5单元；
(5)茎环DNA探针C：茎环DNA探针C从5’到3’依次包括4单元、3单元、5*单元、1单元、5*单元、5单元、2*单元、5单元、1*单元、5单元；
茎环DNA探针A-C中，首尾的4单元和5单元是切割成两部分的G四聚体核酸序列，二者处于分开状态，无法形成完整的G四聚体结构，无催化活性；
以上DNA分子中，1、2、3、5单元分别与1*、2*、3*、5*单元互补；
(6)氯高铁血红素
(7)H2O2
(8)TMB或ABTS或邻苯二胺。
作为优选的，所述DNA2与DNA117β-***核酸适体单元的互补碱基数为9-24个；所述DNA分子中的1单元、1*单元、2单元、2*单元、3单元、3*单元、5单元、5*单元的碱基数均为6-9个。
作为优选的，所述茎环DNA探针A、茎环DNA探针B或茎环DNA探针C的4单元中含有3组GGG碱基，5单元中含有1组GGG碱基。
作为优选的，所述DNA1中，17β-***核酸适体的序列如下所示：
5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'(SEQ ID NO.6)。
作为优选的，各DNA分子的序列如下所示：
DNA1：
5'-ATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'(SEQ ID NO.1)；
DNA2：5'-ATTCAATAAGCTGGAAGCCGTTGA-3'(SEQ ID NO.2)；
茎环DNA探针A：
5'-TGGGTAGGGCGGGTCGTTGAACCCATAGTGAGACCCATATGGGTCAAGACATGGGTCTCACTATGGGT-3'(SEQ ID NO.3)；
茎环DNA探针B：
5'-TGGGTAGGGCGGGTAGTGAGACCCATGTCTTGACCCATATGGGTTCAACGATGGGTCAAGACATGGGT-3'(SEQ ID NO.4)；
茎环DNA探针C：
5'-TGGGTAGGGCGGGTGTCTTGACCCATCGTTGAACCCATATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGATGGGT-3'(SEQ ID NO.5)。
所述试剂盒中还含有Tris-HCl缓冲液和显色缓冲液。
一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法，包括如下步骤：
(1)将DNA1、DNA2和茎环DNA探针分别溶于缓冲液中；
(2)将DNA1与DNA2溶液混合，室温反应；
(3)将待检样品加入步骤(2)的反应液中，混匀，室温反应；
(4)往步骤(3)的反应液中加入茎环DNA探针A、茎环DNA探针B和茎环DNA探针C，混匀，室温反应；
(5)往步骤(4)反应液中加入氯高铁血红素，混匀，室温反应；
(6)取步骤(5)的反应液加入含有TMB和H2O2的显色缓冲液中，混匀，室温反应，观察颜色变化，如果反应液中产生蓝色的底物，则表明待检样品中含有17β-***；
其中，DNA1、DNA2、茎环DNA探针A、茎环DNA探针B和茎环DNA探针C的序列组成如上所述。
作为优选的，步骤(1)所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH为7.4，含有200mMNaCl以及50mMKCl。
作为优选的，步骤(6)所述显色缓冲液含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mMKCl，10μL 0.5％的TMB，20μL 30％的H2O2，pH＝5.0。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对17β-***的检测限为100fM，检测结果肉眼可见，适于现场快速分析；
(2)本发明所述的17β-***的检测方法具有很好的特异性，常见的其他干扰物对检测不产生影响；
(3)以核酸适体为分子识别元件，通过形成DNA纳米结构，达到级联信号放大的目的。以G四聚体作为信号报告分子，检测结果直接肉眼可见，无需使用任何检测仪器，无需使用抗体，无需洗涤分离过程，操作简单，适于现场快速检测。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图；
图2为对不同浓度的17β-***检测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测试剂盒，其包括如下组分：
(1)DNA1：
52*51*17β-***核酸适体
5'-ATGGGT—CTCACT--ATGGGT--TCAACG—GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'(SEQ ID NO.1)
17β-***的核酸适体的5'或3’端延伸，形成DNA1，其包括5单元、2*单元、5单元、1*单元和17β-***核酸适体区域。
(2)DNA2：
5'-ATTCAATAAGCTGGAAGCCGTTGA-3'(SEQ ID NO.2)
DNA2与DNA1的1*区域和部分17β-***核酸适体区域互补。
(3)茎环DNA探针A：
415*25*53*
5'-TGGGTAGGGCGGGT--CGTTGA—ACCCAT--AGTGAG—ACCCAT—ATGGGT--CAAGAC--ATGGGT--CTCACT--ATGGGT-3'(SEQ ID NO.3)
52*5
茎环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、1单元、5*单元、2单元、5*单元、5单元、3*单元、5单元、2*单元和5单元，其中，5*-2-5*单元与5-2*-5单元互补形成茎环结构。
(4)茎环DNA探针B：
425*35*51*
5'-TGGGTAGGGCGGGT--AGTGAG—ACCCAT—GTCTTG—ACCCAT—ATGGGT--TCAACG--ATGGGT--CAAGAC--ATGGGT-3'(SEQ ID NO.4)
53*5
茎环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、2单元、5*单元、3单元、5*单元、5单元、1*单元、5单元、3*单元和5单元，其中，5*-3-5*区域与5-3*-5区域互补形成茎环结构。
(5)茎环DNA探针C：
435*15*52*
5'-TGGGTAGGGCGGGT—GTCTTG--ACCCAT—CGTTGA—ACCCAT—ATGGGT—CTCACT--ATGGGT--TCAACG--ATGGGT-3'(SEQ ID NO.5)
51*5
茎环DNA探针C从5’到3’依次包括4单元、3单元、5*单元、1单元、5*单元、5单元、2*单元、5单元、1*单元和5单元，其中，5*-1-5*区域与5-1*-5区域互补形成茎环结构。
茎环DNA探针A-C中，首尾的4单元和5单元是切割成两部分的G四聚体核酸序列，二者处于分开状态，无法形成完整的G四聚体结构，无催化活性。
以上DNA分子中，1、2、3、5单元分别与1*、2*、3*、5*单元互补。
(6)氯高铁血红素；
(7)H2O2；
(8)TMB或ABTS或邻苯二胺；
(9)Tris-HCl缓冲液，含有200mMNaCl以及50mMKCl。
(10)显色缓冲液，包含含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mMKCl，10μL
0.5％的TMB，20μL 30％的H2O2，pH＝5.0。
本试剂盒的工作原理为：
(1)将DNA1和DNA2在缓冲体系中反应一段时间，形成DNA1-DNA2复合物，在DNA1-DNA2复合物中，DNA1中的1*区域被DNA2封闭。
(2)将待检样品加入到DNA1-DNA2反应体系中，如果待检样品中含有17β-***，17β-***将与DNA1中的17β-***核酸适体区域相互作用，从而把DNA2置换下来，使DNA1中的1*区域暴露出来。
(3)DNA1暴露的1*区域与茎环DNA探针A的1区域互补杂交，启动链置换反应，打开茎环结构，形成I·A复合物，从而使得茎环DNA探针A中本来封闭的2*区域被打开。
(4)I·A复合物中的2*区域与茎环DNA探针B中的2区域互补杂交，启动链置换反应，打开茎环结构，形成I·A·B复合物，从而使得茎环DNA探针B中本来封闭的3*区域被打开。
(5)I·A·B复合物中的3*区域与茎环DNA探针C中的3区域互补杂交，启动链置换反应，打开茎环结构，形成I·A·B·C复合物。该复合物本身不稳定，会把DNA1置换下来，形成A·B·C复合物(DNA纳米结构)。置换下来的DNA1又可以重新启动下一轮的信号扩增过程，从而不断形成大量的DNA纳米结构。
(6)在A·B·C复合物中，每条DNA臂的末端都会把4区域和5区域拉近，形成完整的G四聚体序列，加入氯高铁血红素后，会在每条DNA臂末端形成具有催化活性的G四聚体。它们能催化氧化TMB-H2O2(四甲基联苯胺-双氧水)检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测17β-***的目的。
实施例2
利用实施例1建立的试剂盒检测17β-***，步骤如下：
(1)先用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH为7.4，含有200mMNaCl以及50mMKCl)分别溶解DNA1、DNA2以及茎环DNA探针；
(2)将100nM的DNA1与400nM的DNA2混合，室温反应20分钟，形成DNA1-DNA2混合物；
(3)将待检样品加入到DNA1-DNA2混合物中，室温反应45分钟；
(4)再加入1μM的茎环DNA探针A、B、C，室温反应60分钟；
(5)加入0.3μM的hemin(氯高铁血红素)，室温反应30分钟；
(6)取出50μL反应液，加入到950μL显色缓冲液中(含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mMKCl，10μL 0.5％的TMB，20μL 30％的H2O2，pH＝5.0)，室温反应15分钟，观察颜色变化；
如果反应液中产生蓝色的底物，则表明待检样品中含有17β-***。
实施例3
对不同浓度17β-***的检测：
配制17β-***标准溶液，浓度分别为100fM，1pM，10pM，100pM和1nM，室温保存。
将不同浓度的17β-***溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，100fM的17β-***可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为100fM。随着17β-***浓度的增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。
实施例4
特异性实验：
配制浓度为10nM的不同干扰物标准溶液，分别是雌三醇、双酚A、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素。
将10nM的不同干扰物标准溶液和10pM17β-***标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，10nM的雌三醇、双酚A、孕酮、西维因、洁霉素和丝裂霉素没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入17β-***后才会产生蓝色，这证明该方法对17β-***的检测具有很好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>  广东省生态环境与土壤研究所
 
<120>  基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法及检测试剂盒
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  100
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
atgggtctca ctatgggttc aacggcttcc agcttattga attacacgca gagggtagcg       60
 
gctctgcgca ttcaattgct gcgcgctgaa gcgcggaagc                            100
 
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
attcaataag ctggaagccg ttga                                              24
 
 
<210>  3
<211>  68
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tgggtagggc gggtcgttga acccatagtg agacccatat gggtcaagac atgggtctca       60
 
ctatgggt                                                                68
 
 
<210>  4
<211>  68
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
tgggtagggc gggtagtgag acccatgtct tgacccatat gggttcaacg atgggtcaag       60
 
acatgggt                                                                68
 
 
<210>  5
<211>  68
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
tgggtagggc gggtgtcttg acccatcgtt gaacccatat gggtctcact atgggttcaa       60
 
cgatgggt                                                                68
 
 
<210>  6
<211>  76
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
gcttccagct tattgaatta cacgcagagg gtagcggctc tgcgcattca attgctgcgc       60
 
gctgaagcgc ggaagc                                                       76

Claims (10)

1.一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测试剂盒，其包括如下组分：
（1）DNA1：17b-***的核酸适体的5'或3’端延伸至少24碱基，形成DNA1，其从5’至3’依次包括5单元、2*单元、5单元、1*单元和17b-***核酸适体单元；
（2）DNA2：DNA2与DNA1的1*单元和部分17b-***核酸适体单元互补；
（3）茎环DNA探针A：从5’到3’依次包括4单元、1单元、5*单元、2单元、5*单元、5单元、3*单元、5单元、2*单元、5单元；
（4）茎环DNA探针B：茎环DNA探针A从5’到3’依次包括4单元、2单元、5*单元、3单元、5*单元、5单元、1*单元、5单元、3*单元、5单元；
（5）茎环DNA探针C：茎环DNA探针C从5’到3’依次包括4单元、3单元、5*单元、1单元、5*单元、5单元、2*单元、5单元、1*单元、5单元；
茎环DNA探针A-C中，首尾的4单元和5单元是切割成两部分的G四聚体核酸序列，二者处于分开状态，无法形成完整的G四聚体结构，无催化活性；
以上DNA分子中，1、2、3、5单元分别与1*、2*、3*、5*单元互补；
（6）氯高铁血红素；
（7）H2O2；
（8）TMB或ABTS或邻苯二胺。
2.根据权利要求1所述的17β-***可视化检测试剂盒，其特征在于，所述DNA2与DNA117b-***核酸适体单元的互补碱基数为9-24个；所述DNA分子中的1单元、1*单元、2单元、2*单元、3单元、3*单元、5单元、5*单元的碱基数均为6-9个。
3.根据权利要求1所述的17β-***可视化检测试剂盒，其特征在于，所述茎环DNA探针A、茎环DNA探针B或茎环DNA探针C的4单元中含有3组GGG碱基，5单元中含有1组GGG碱基。
4.根据权利要求1所述的17β-***可视化检测试剂盒，其特征在于，所述DNA1中，17b-***核酸适体的序列如下所示：
5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'。
5.根据权要求1-4任一项所示的17β-***可视化检测试剂盒，其特征在于，各DNA分子的序列如下所示：
DNA1：5'-ATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGGCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'；
DNA2：5'-ATTCAATAAGCTGGAAGCCGTTGA-3'；
茎环DNA探针A：5'-TGGGTAGGGCGGGTCGTTGAACCCATAGTGAGACCCATATGGGTCAAGACATGGGTCTCACTATGGGT-3'；
茎环DNA探针B：5'-TGGGTAGGGCGGGTAGTGAGACCCATGTCTTGACCCATATGGGTTCAACGATGGGTCAAGACATGGGT-3'；
茎环DNA探针C：5'-TGGGTAGGGCGGGTGTCTTGACCCATCGTTGAACCCATATGGGTCTCACTATGGGTTCAACGATGGGT-3'。
6.根据权利要求1所述的17β-***可视化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有Tris-HCl缓冲液和显色缓冲液。
7.一种基于DNA纳米结构的17β-***可视化检测方法，包括如下步骤：
（1）将DNA1、DNA2和茎环DNA探针分别溶于缓冲液中；
（2）将DNA1与DNA2溶液混合，室温反应；
（3）将待检样品加入步骤（2）的反应液中，混匀，室温反应；
（4）往步骤（3）的反应液中加入茎环DNA探针A、茎环DNA探针B和茎环DNA探针C，混匀，室温反应；
（5）往步骤（4）反应液中加入氯高铁血红素，混匀，室温反应；
（6）取步骤（5）的反应液加入含有TMB和H2O2的显色缓冲液中，混匀，室温反应，观察颜色变化，如果反应液中产生蓝色的底物，则表明待检样品中含有17β-***；
其中，DNA1、DNA2、茎环DNA探针A、茎环DNA探针B和茎环DNA探针C的序列组成如权利要求1-5任一项所示。
8.根据权利要求7所述的17β-***可视化检测方法，其特征在于，步骤（1）所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH为7.4，含有200 mMNaCl以及50 mMKCl。
9.根据权利要求7所述的17β-***可视化检测方法，其特征在于，步骤（6）所述显色缓冲液含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mMKCl，10 mL 0.5%的TMB，20 mL 30%的H2O2，pH=5.0。
10.17b-***的核酸适体，其为如下核苷酸序列所示DNA分子或者是与其互补的核苷酸序列所示的DNA分子：
5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'。
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