CN104975007A

CN104975007A - 磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法

Info

Publication number: CN104975007A
Application number: CN201510449617.6A
Authority: CN
Inventors: 王清水; 余彦
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2015-10-14

Abstract

本发明涉及一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，属于生物技术领域。本发明提供一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，包括革兰氏阴性菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA。与传统方法相比，利用该方法能够方便、快捷地提取革兰氏阴性菌基因组，与常规的革兰氏阴性菌基因组提取方法相比仅需3h就能提取到革兰氏阴性菌基因组，本发明不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阴性菌基因组DNA。

Description

磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法

技术领域

本发明涉及一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，属于生物技术领域。

技术背景

革兰阳性菌、革兰阴性菌是根据对细菌进行革兰氏染色的结果来区分的，如果将细菌作革兰氏染色，凡染后菌体呈紫色的，称“革兰氏阳性菌”，菌体呈伊红色，称“革兰氏阴性菌”。无论阳性菌还是阴性菌都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌、沙门氏菌、克雷白杆菌；绿脓杆菌属于假单胞菌，为非发酵菌，是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。

革兰氏阴性菌是原核生物，构造相对简单，遗传背景清晰，培养操作容易，因此也常常被作为基因工程的对象加以利用：研究者常常将外源基因导入质粒，将质粒整合入革兰氏阴性菌基因，这样，革兰氏阴性菌就能够表达基因重组后的蛋白(例如胰岛素，某些疫苗等)了。此外，革兰氏阴性菌还常常作为模型生物参与细胞学实验。

革兰氏阴性菌分布广泛，是微生物遗传学和分子遗传学重要的研究对象，对革兰氏阴性菌遗传学研究的许多重要发现，加深了我们在分子水平上对生物遗传机制的理解；同时由于我们对革兰氏阴性菌遗传背景有较深的了解，革兰氏阴性菌在基因工程研究中占据着不可替代的重要地位。为了更好地研究革兰氏阴性菌的遗传信息，需要提取革兰氏阴性菌的基因组DNA。研制一种适用于革兰氏阴性菌基因组DNA提取的方便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法所获得的DNA样品提取时间长的问题。此外，有效的提取革兰氏阴性菌基因组DNA，能够为进行基因分析与基因克隆提供重要保证，从而丰富基因组学的研究内容。

发明内容：

本发明提供一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，与传统方法相比，利用该方法能够方便、快捷地提取革兰氏阴性菌基因组。

磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，包括革兰氏阴性菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，具体步骤如下：

革兰氏阴性菌细胞的破碎：取1.5ml革兰氏阴性菌过夜培养液加到1.5ml离心管中，10000-13000rpm/min离心1-5分钟后弃上清。往菌体沉淀中加入0.5-1ml溶菌酶溶液悬浮沉淀，37℃温育2-4h。加入0.5-1ml SDS溶液，反复颠倒混匀10-20min，10000-13000rpm/min离心10-20分钟后取上清至新的1.5ml离心管。

DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入200-600μl酚、氯仿和异戊醇抽提，其中酚：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1，10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中。加入200-600μl氯仿和异戊醇抽提，其中氯仿：异戊醇体积比为24:1，10000-13000rpm/min离心10-20分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中。

磁珠法快速纯化基因组DNA：往溶液中加入等体积的Buffer A。震荡10-30s。室温放置1-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入0.5-1.5ml Buffer B,打匀后室温静止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入30-60μl Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为革兰氏阴性菌基因组DNA产物。于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。

所述的溶菌酶溶液：0.1-0.3mol/L氯化钠(Nacl)，0.1-0.2mol/L乙二胺四乙酸(EDTA),10-20mg/ml溶菌酶，PH＝7-9。

所述的SDS溶液：0.1-0.2mol/L氯化钠(Nacl)，0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5-20％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS),PH＝7-9。

所述的Buffer A:异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。

所述的Buffer B:4.3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),42.9-85.7mmol/L氯化钠(Nacl)，60-80％无水乙醇。

所述的Buffer C:5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，PH＝7.0-9.0。

磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um。购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号：AK1-G1000。

本发明的显著优点：

常规的革兰氏阴性菌基因组通常采用无水乙醇沉淀基因组，需要12h以上的操作时间，长时间的操作也容易造成革兰氏阴性菌基因组的降解。一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法与常规的革兰氏阴性菌基因组提取方法相比仅需3h就能提取到革兰氏阴性菌基因组。与常规革兰氏阴性菌基因组提取方法相比，本发明不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到革兰氏阴性菌基因组DNA。

附图说明

图1为利用本方法提取的革兰氏阴性菌基因组DNA的电泳检测图。

具体实施例

图1中，泳道1为利用本方法提取大肠杆菌基因组DNA的结果图，泳道2为利用本方法提取铜绿假单胞菌基因组DNA的结果图，泳道3为利用本方法提取变形杆菌基因组DNA的结果图，泳道4为TAKARA公司的DL4500Marker。

磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，具体步骤如下：

(1)革兰氏阴性菌细胞的破碎：分别取1.5ml大肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌过夜培养液加到1.5ml离心管中，12000rpm/min离心1分钟后弃上清。往菌体沉淀中加入0.5ml溶菌酶溶液悬浮沉淀，37℃温育2h。加入0.5ml SDS溶液，反复颠倒混匀10min，12000rpm/min离心10分钟后取上清至新的1.5ml离心管。

(2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入500μl酚：氯仿：异戊醇(其体积比为25：:24:1)抽提，12000rpm/min离心10分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中。加入500μl氯仿：异戊醇(其体积比为24:1)抽提，12000rpm/min离心10分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中。

(3)磁珠法快速纯化基因组DNA：往溶液中加入等体积的Buffer A。震荡30s。室温放置10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入1ml Buffer B,打匀后室温静止5min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入30μl Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为革兰氏阳性菌基因组DNA产物。于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。

下表为本实施例革兰氏阴性菌基因组DNA产物的纯度表。

	泳道1	泳道2	泳道3
				OD(260:280)	1.79	1.80	1.79

下表试剂的配方如下：

溶菌酶溶液：0.15mol/L氯化钠(Nacl)，0.1mol/L乙二胺四乙酸(EDTA),15mg/ml溶菌酶，PH＝8。

SDS溶液：0.1mol/L氯化钠(Nacl)，0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，10％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS),PH＝8。

Buffer A：异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。

Buffer B：28.6mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),3.4mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),60mmol/L Nacl,70％无水乙醇。

Buffer C：8mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，PH＝8.0。

磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um。购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号：AK1-G1000

磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的检测结果见图1，泳道1为利用本方法提取大肠杆菌基因组DNA的结果图，泳道2为利用本方法提取铜绿假单胞菌基因组DNA的结果图，泳道3为利用本方法提取变形杆菌基因组DNA的结果图，泳道4为TAKARA公司的DL4500Marker。从图中可看出，本方法可以快速地提取到革兰氏阴性菌基因组DNA。革兰氏阴性菌基因组DNA的纯度见表1，从表1可看出，本方法提取到的革兰氏阴性菌基因组DNA的OD(260：280)在1.79-1.80之间，说明本方法可以提取到纯度高的革兰氏阴性菌基因组DNA。

Claims

1.一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，包括革兰氏阴性菌细胞的破碎，DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法快速纯化基因组DNA，其特征是：

革兰氏阴性菌细胞的破碎：取1.5ml革兰氏阴性菌过夜培养液加到1.5ml离心管中，10000-13000rpm/min 离心1-5分钟后弃上清；往菌体沉淀中加入0.5-1ml 溶菌酶溶液悬浮沉淀，37°C温育2-4h；加入0.5-1ml十二烷基硫酸钠溶液，反复颠倒混匀10-20min，10000-13000rpm/min 离心10-20分钟后取上清至新的1.5ml离心管；

DNA的游离与杂蛋白的抽除：加入200-600μl 酚、氯仿和异戊醇混合液抽提，混合液体积比为酚：氯仿：异戊醇为25:24:1，10000-13000rpm/min 离心10-20分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中；加入200-600μl氯仿和异戊醇混合液抽提，其体积比氯仿：异戊醇为24:1，10000-13000rpm/min 离心10-20分钟，将上清转移至干净的1.5ml离心管中；

磁珠法快速纯化基因组DNA：往离心管中加入等体积的 Buffer A；震荡10-30s；室温放置1-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离；待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠；往含有磁珠的离心管中加入0.5-1.5ml Buffer B,打匀后室温静止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离；待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠；往含有磁珠的离心管中加入30-60μl Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离；待磁珠吸附到离心管一侧时吸取液体，此溶液即为革兰氏阴性菌基因组DNA产物，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

2.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，其特征是所述的溶菌酶溶液：0.1-0.3mol/L氯化钠，0.1-0.2 mol/L乙二胺四乙酸,10-20mg/ml 溶菌酶，PH=7-9。

3.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，其特征是所述的SDS溶液：0.1-0.2 mol/L氯化钠，0.1-1 mol/L三羟甲基氨基甲烷，5-20%质量体积比的十二烷基硫酸钠,PH=7-9。

4.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，其特征是所述的Buffer A: 异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。

5.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，其特征是所述的Buffer B: 4.3-21.4 mmol/L三羟甲基氨基甲烷, 2.1-4.2 mmol/L乙二胺四乙酸,42.9-85.7 mmol/L氯化钠，60-80%无水乙醇。

6.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，其特征是所述的Buffer C: 5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH=7.0-9.0。

7.根据权利要求1所述的一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，其特征是所述的磁珠为硅基生物磁珠，粒径为1um。