CN104974218A - 低丰度差异蛋白的分离方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种低丰度差异蛋白的分离方法，包括：获取健康对照组蛋白样品、患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品；将健康对照组蛋白样品作为抗原进行免疫，制备高丰度蛋白多抗，并以该高丰度蛋白多抗为亲和配体制备高丰度亲和层析柱；将患者对照组蛋白样品于高丰度亲和层析柱过柱，收集流穿组份；将流穿组分浓缩后作为抗原进行再次免疫，制备低丰度蛋白多抗；并以低丰度蛋白多抗作为亲和配体制备低丰度亲和层析柱；将待测组蛋白样品于低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。采用本发明的过程可以一次直接分离得到正常血浆中含量较多的上调蛋白，降低了分离过程的繁复性，而且直接针对差异表达的低丰度蛋白，具有更高的特异性和针对性。

Description

低丰度差异蛋白的分离方法及其应用
技术领域
本发明属于蛋白检测技术领域，具体涉及一种低丰度差异蛋白的分离方法及其应用。
背景技术
经过对所有疾病潜伏和发病过程的研究已经证实，潜在的疾病或潜伏期的生理状态都已经找到了很好的和生理状态相关的生物标记分子，这些生物标记分子，大多是丰度较低的蛋白。这些低丰度蛋白在血浆中，都只有很低的浓度，且经常会被白蛋白等高丰度蛋白，致使在疾病潜伏的前期检测中难以被检测出，大大延迟了疾病的发现时间。所以，差异性的比较正常及非正常生理状态下的血浆蛋白，并找出相应的生物标记分子，从而辅助疾病的更早发现具有重要的医学意义。
然而基于上述目的，要差异性的比较正常及非正常生理状态下的血浆蛋白，并找出相应的生物标记分子，采用目前蛋白质组学的常规检测手段，存在着比较大的困难。原因在于寻找生物标记蛋白的过程中，要先消除高丰度蛋白对整个***的掩盖，使很低浓度的蛋白可以被检测到。目前通常的方法是将所有的蛋白显示在2D电泳胶上，然后对比不同样本之间的差异蛋白；而其中，首先2D电泳并不能显示出极度酸性或者碱性的蛋白，以及疏水性较大的脂蛋白；如果蛋白质过多，蛋白斑点的识别也存在着较大的困难；其次血浆中的高丰度蛋白会掩盖真正具有很重要生物活性作用的微量蛋白，虽然已经有报导各种亲和方法如CB染料介质、抗体介质等来去除高丰度蛋白，但能去除的蛋白还是很有限，并不能去除大部分house-keeping蛋白和正常功能蛋白；第三，和非正常生理状态相关的生物标记蛋白并不局限于低丰度蛋白，有些丰度较高的蛋白也在疾病报道中出现，因此所以仅仅使用高丰度去除也会导致结果不准确。
基于上述不足，本案的发明人早先于2010年在CN102430176A号专利中提出了一种对待测蛋白和对照蛋白之间的差异蛋白进行富集，从而提升待测蛋白或者多肽浓度的方法。其技术实现的过程采用将标准对照蛋白作为抗原进行免疫，制备得到能够与该对照样品中的至少一种蛋白或多肽结合的免疫球蛋白(其实就是以标准对照蛋白作为抗原产生的一抗抗体，属于多克隆抗体)，然后用该免疫球蛋白制成亲和介质的层析柱，用来吸附待测样品中的大量高丰度蛋白，从而流穿组分即为富集浓缩的待测蛋白中的低丰度差异蛋白。
但是这一早先的做法中，采用正常对照蛋白通过免疫制备得到抗体，对照蛋白本身采用的是正常蛋白，所分离和浓缩得到的低丰度蛋白只是新出现或上调的潜在标志蛋白，而无法进一步直接确定这些蛋白的表达是属于非正常血浆中的下调蛋白或者是正常血浆中含量较多的上调蛋白，需要进一步的在采用对比进行大量的对比检测，增加繁复步骤之后降低了准确性，提升了工作量，使得上述方法实施中存在不足。
发明内容
本发明实施的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够直接分离富集非正常血浆中的低丰度下调蛋白的低丰度差异蛋白的分离方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种低丰度差异蛋白的分离方法，包括如下步骤：
获取健康对照组蛋白样品和患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品；
将健康对照组蛋白样品作为抗原进行免疫，制备高丰度蛋白多抗；并以所述高丰度蛋白多抗为亲和配体与固相基质制备高丰度亲和层析柱；
将患者对照组蛋白样品于所述高丰度亲和层析柱进行过柱，并收集流穿组份；
将所述流穿组分浓缩后作为抗原进行免疫，制备低丰度蛋白多抗；并以所述低丰度蛋白多抗作为亲和配体固定与固相基质制备低丰度亲和层析柱；
将待测组蛋白样品于所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。
本发明在上述低丰度差异蛋白的分离方法的基础上，还提出一种上述低丰度差异蛋白的分离方法在低丰度差异表达蛋白检测上的应用。
本发明的低丰度差异蛋白的分离方法和应用，在原先方法的基础上，先用健康组的蛋白进行一次免疫，制备能用来滤除大量背景高丰度差异蛋白的高丰度多抗，然后用该高丰度蛋白多抗制备高丰度蛋白层析柱去除非正常患者差异表达蛋白样品中的背景高丰度蛋白，收集的流穿组分即为非正常患者差异表达的低丰度蛋白；然后将该流穿组分浓缩之后作为抗原去进行第二次免疫，得到低丰度差异表达的多抗，之后再用该低丰度差异表达的多抗作为配体进一步制备低丰度差异蛋白的层析柱，便可以直接一次分离待测组蛋白样品中属于非正常血浆中的下调蛋白或者是属于正常血浆中含量较多的上调蛋白。整体过程可以一次直接分离得到正常血浆中含量较多的上调蛋白，降低了分离过程的繁复性，提升了分离和检测效率，而且最后的洗脱组分直接针对差异表达的低丰度蛋白，具有更高的特异性和针对性。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例分别采用正常人血浆和另一名肝癌患者血浆分别作为待测蛋白按照上述步骤检测获得的洗脱液进行SDS-PAGE电泳银染的图片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实例提出一种低丰度差异蛋白的分离方法，包括步骤概括如下：
S10，获取健康对照组蛋白样品、患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品；
S20，将健康对照组蛋白样品作为抗原进行第一次免疫，制备高丰度蛋白多抗；
S30，将步骤S20获得的高丰度蛋白多抗作为亲和配体，固定至层析柱的固相载体上，制备高丰度亲和层析柱；
S40，将患者对照组蛋白样品用步骤S30制备的高丰度亲和层析柱进行过柱，收集流穿液；
S50，将步骤S40收集的流穿液进行浓缩之后，作为抗原进行再次免疫，制备低丰度蛋白多抗；
S60，将步骤S50获得的低丰度蛋白多抗作为亲和配体，固定至层析柱的固相载体上，制备低丰度亲和层析柱；
S70，将待测组蛋白样品于步骤S60所制备的所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。
本发明的低丰度差异蛋白的分离方法，在原先方法的基础上，先用健康组的蛋白进行一次免疫，制备能用来滤除大量背景高丰度差异蛋白的高丰度多抗，然后用该高丰度蛋白多抗制备高丰度蛋白层析柱去除非正常患者差异表达蛋白样品中的背景高丰度蛋白，收集的流穿组分即为非正常患者差异表达的低丰度蛋白；然后将该流穿组分浓缩之后作为抗原去进行第二次免疫，得到低丰度差异表达蛋白的多抗，之后用该低丰度差异表达蛋白的多抗作为配体进一步制备低丰度差异蛋白的层析柱，便可以直接一次分离待测组蛋白样品中属于非正常血浆中的下调蛋白或者是属于正常血浆中含量较多的上调蛋白。从而整体采用本发明的上述操作过程进行，降低了分离过程的繁复性，提升了分离和检测效率，而且最后的洗脱组分直接针对差异表达的低丰度蛋白，具有更高的特异性和针对性。
其中，本发明的上述过程，在步骤S10中采用从健康正常人获取的蛋白、和患病的患者获取的蛋白这两者分别作为高丰度蛋白和低丰度差异蛋白的来源，在该患者获取的蛋白中低丰度差异蛋白的种类和量是明显不同于正常标准的，更加易于直接反映低丰度差异蛋白的表达情况。获取之后用该两种对照作为样品直接制备出针对对待测样品中低丰度蛋白的亲和配体，达到一次直接分离得到正常血浆中含量较多的上调蛋白的目的。具体，之后的处理如下：
为了提升分离低丰度蛋白的特异性和针对性，避免之后层析分离中的高丰度背景蛋白的干扰，需要进一步降低高丰度蛋白的竞争性抑制，所以在步骤S20中本发明将健康对照组蛋白样品作为抗原免疫家兔(也可以是大鼠等其他的免疫体)，通过免疫制备得到免疫的多克隆抗体；免疫过程中大部分蛋白(基本为大量的高丰度蛋白)产生免疫由于；仅有小部分蛋白(基本为低丰度蛋白)因为本身结构的原因或者蛋白含量过低的原因，不能发生免疫反应；所以制备得到的针对于高丰度蛋白的多克隆抗体，通过该高丰度蛋白多克隆抗体来去除背景高丰度蛋白。
进一步，步骤S30将步骤S20制备得到的高丰度蛋白多抗作为亲和配体，固定至固相载体制备特异性吸附高丰度蛋白的层析柱；固相载体作为层析的载体，可以选择葡聚糖凝胶等类型进行；亲和配体与固相载体固定结合的方式可以采用共价交联等通常方式实现。
步骤S40在制备得到高丰度亲和层析柱之后，用该高丰度层析柱对非正常患者蛋白样品进行过柱处理，过柱的过程中由于层析的亲和介质是针对多克隆抗体剔除高丰度蛋白的***，所以此次过柱蛋白样品中的大量高丰度蛋白会被吸附在层析柱上，得到的流穿组分中的成分即绝大多数非正常患者差异表达的低丰度蛋白。当然，在这一过程中为了尽量消除或者减少高丰度在流穿液中的量，可以将流穿液组分再次进行过柱，以尽量提升对背景蛋白的去除。同时，在实施的过程中，为了减少或者降低高丰度层析柱与样品中蛋白的非特异性吸附，将非正常患者蛋白对照样品用只含有固相基质而不含有配体的空柱子先过柱处理，这样非正常患者蛋白对照样品中的很多杂质或者非特异性吸附的因素会被初步滤除，提升高丰度蛋白层析柱亲和的特异性。
然后，步骤S50将步骤S40收集到主要是含有非正常患者低丰度差异蛋白的流穿液进行浓缩，然后将浓缩的蛋白再次作为抗原进行第二次免疫，制备得到针对于低丰度差异蛋白的多克隆抗体。其中，需要指出的是，由于低丰度差异蛋白表达的量较少，所以为了能使其达到免疫的量，实施中可以加大非正常患者蛋白对照样品的量，直至所收集到的低丰度差异蛋白的量能满足本发明的使用要求。同时，本步骤S50中用低丰度蛋白进行的第二次免疫需要采用与步骤S20不同的免疫体进行，比如步骤S30中的第一次免疫采用家兔进行，该步骤S40的再次免疫便可以采用大鼠进行。
通过步骤S50的免疫即能得到特异性针对低丰度差异表达蛋白的多抗，之后步骤S60和S70通过该多抗所具有的低丰度差异蛋白的亲和性和特异性，便能最终将待测蛋白样品中同类差异蛋白进行分离。实施的过程仍然是类似上述高丰度层析柱的方法，将步骤S50进行第二次免疫得到的低丰度差异蛋白多抗作为亲和配体，共价或者非共价的方式固定值固相载体上，制备针对低丰度蛋白的亲和层析柱；然后用该低丰度亲和层析柱处理待测蛋白样品，那么待测蛋白样品中的低丰度差异蛋白便能被该层析柱吸附，吸附之后用洗脱液进行洗脱便能直接得到待测样品属于正常血浆中含量较多的上调蛋白。
当然，在步骤S70的实施过程中，由于本身待测蛋白样品中高丰度蛋白的含量占到绝对优势，可能在吸附中会产生较强的竞争性优势，所以在实施中为了进一步提升低丰度的特异性、以及降低低丰度蛋白的竞争性劣势，因此可以采用在过柱之前将待测组蛋白样品先用梯度离心的方式进行初步处理，通过梯度离心的方式便可以初步除掉一些分子量或者是量大高丰度蛋白，从而更加利于提升低丰度蛋白亲和吸附的特异性。
当然，在待测组蛋白样品进行过柱的过程中，同样也是为了避免非特异性吸附，也可以采用将待测组蛋白样品用不含有低丰度蛋白多抗的空白层析柱进行过柱，采用该未偶联有多克隆抗体只含有固相基质的空白柱子进行过柱，本发明的目的是将其作为背景，可以引起非特异性结合的因素、以及小颗粒碎片等等被阻留在该只含有柱基质的空白层析柱上，从而实现初步去除背景干扰，更进一步提升多抗层析柱对于待测样品的特异性吸附的效果。
同时在上述步骤S70中，待测样品进行过柱处理之后，可以进一步用缓冲液对亲和层析柱进行洗涤，以去除没有结合而滞留在间质空隙内的蛋白，降低本底干扰。用于洗涤的缓冲液可以采用任何不干扰抗原-抗体结合反应的缓冲液都可以。
吸附之后最后再采用咪唑等洗脱液进行洗脱，即可分离得到待测样品中的低丰度蛋白。然后对洗脱液进行浓缩、SDS-PAGE电泳银染、Western-blot分析、质谱之后便能将低丰度差异蛋白很快地显示出来。上述整体的过程基于本身差异表达的低丰度蛋白种类和量都比较少，因此最终按照上述实施过柱纯化之后，之后再进行洗脱得到的洗脱组分，用LTQ-MASS分析后，大致上仅需要从剩余的几十个蛋白质中比较不同生理状态的差异功能蛋白质；这大大减少了蛋白质差异显示的工作量，跳过了繁复的2D电泳，在疾病的早期检测和生物标记分子的发现检测领域有着较大的潜力。同时过柱吸附和洗脱的过程不需要多次重复，耗时和工作量大大缩短。
发明人早先采用的过程用高丰度蛋白制备特异性多抗进行层析收集流穿液，而流穿液中含有很多在正常血浆中存在的大量蛋白，如Apo E，Hemopexin，Sex hormone-binding globulin，Apo B-100和Haptoglobin-related protein等；这些蛋白之所以会在流穿溶液中出现，是因为在各种不同的非正常生理状态下，这些蛋白在血浆中的浓度大大增加，超过了多克隆抗体在亲和吸附介质上的比例，使得不能被完全吸附；因此最终的流穿液还需要进一步进行分离和纯化才能进行比对和质谱。而本发明中吸附的过程中都是特异性吸附，最终收集到的洗脱液，基本上都是特异性吸附的指定蛋白，基本上不含有上述高丰度蛋白，可以直接进行比对和质谱。
以上患者的可以根据不同的研究不同疾病的类型进行选择，可以选择比如一般容易错过早期诊断的淋巴癌、黑色素瘤、胃癌、直肠癌、细菌感染、血液病变、乳腺癌、***、结肠癌、食道癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、非小细胞淋巴瘤、间皮瘤、多发性硬化、神经***感染等等。对照患者蛋白样品采用从确诊为患有上述疾病的患者血样中进行获取，采集完血样后离心处理分离血细胞之后的血浆作为样品即可。
用本发明的亲和层析柱纯化的过程中，制备层析柱所用基质的量须调整到略高于其饱和水平，保持带有多克隆抗体基质的体积，使非特异性本底尽可能降低。而多克隆抗体对对应的抗原的捕获量与流速有关，流速较慢时柱容量更有效，因为偶联的抗体就有更多时间与抗原结合。同时，上样时的机械性压力应尽可能小，并避免过度与空气接触。
基于上述实施过程中，层析柱中的层析介质本发明中优选采用SepharoseCL 4B作为层析柱的固相基质，在本发明的使用中，Sepharose CL 4B相比其他种类的基质，具有比较好的多孔性，可以增加吸附的容量，避免因为待测样品中的高丰度蛋白的竞争性造成目的蛋白不足的情形。
本发明的上述低丰度差异蛋白的分离方法，相比通常的蛋白质组学的2D电泳差异性比较仍然难以进行以及高丰度蛋白免疫的抗体吸附的方法，本发明以低丰度蛋白作为直接目标进行免疫后亲和吸附，并且在所有的步骤和过程中逐步削弱和降低高丰度蛋白的竞争性以及背景性干扰，进而提升低丰度蛋白分离和富集的能力，最终获得特异性较强且种类较为完全的低丰度差异表达蛋白；为生物标记物的发现和相关的监测提供了更优的生物学手段。
所以基于相关的监测和检测的目的，本发明进一步提出上述低丰度差异蛋白的分离方法在低丰度差异蛋白检测中的应用，通过上述分离的方法可以直接富集到低丰度差异蛋白，可以直接用于后续的CCD检测分析，质谱等等。分离的过程按照本发明的上述方法一次即可完成，而且整体准确性较好。
为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明方法相比现有2D电泳以及高丰度蛋白免疫的抗体吸附的进步性，以下通过具体的实施例和实际分析数据进行举例说明。
实施例1
在该实施例1中以分析研究肝癌相关的低丰度差异蛋白的生物标记物为目的，因此采用获取的蛋白样品分别从已经确诊的肝癌患者和正常人血样中获得，具体步骤实施步骤参考如下进行：
S10’，分别获取健康人血浆蛋白样品、肝癌患者的血浆蛋白样品、以及待测蛋白血浆样品(以上血浆为将获取的血液样品添加抗凝剂并后进行离心处理，弃去细胞沉淀后的上层黄色清液)。
S21’，取步骤S10’中健康人血浆样品2mL，与2ml弗氏完全佐剂混合，超声波乳化完全；对3只家兔进行皮下多点注射，并于家兔耳根静脉取血样保存；
S22’，加强免疫：两周后同样再次制取2mL步骤S21’中获得的蛋白溶液，与2ml弗氏不完全佐剂混合，超声波乳化完全；对3只家兔进行皮下多点注射，并于家兔耳根静脉取血样保存；
S23’，将步骤S22’中取的家兔血样用ELISA实验测定生成的多克隆抗体对S22’中获得的蛋白溶液的特异性吸附情况；当ELISA试验检测免疫的家兔血滴度达到104～105时，处死家兔取血。如果ELISA试验检测结果达不到标准，那么继续重复步骤S22’对家兔进行增强免疫，直至达到符合标准时，处死家兔取血。
S24’，从步骤S23’中获得的家兔血样中分离血浆，一般一只家兔可放血100～120mL；将取得的血液放入预先装有抗凝剂的容器，充分混匀后，1000rpm4℃离心5min，取出上清即为血浆；
S25’，从步骤S24’的兔血浆中取出10mL，提取高丰度蛋白多克隆抗体；
用pH7.0的PBS缓冲液稀释5倍待用；取出Protein G柱(1ml)，先用pH7.0的PBS缓冲液冲洗，直至蛋白核酸检测仪显示的数据达到基线；取出pH7.0的PBS缓冲液稀释的兔血浆溶液，以0.5ml/min的流速上Protein G柱，上样完成后用pH 7.0的PBS缓冲液冲洗至基线，收集流穿液；当然，这一个步骤中收集的流穿液中也可能还含有尚未被吸附的多克隆抗体，所以该流穿液可以重复多次过柱，以降低多克隆抗体的浪费；
用pH2.5Gly-HCl缓冲液冲洗介质，接收洗脱蛋白溶液，即为针对高丰度蛋白的多克隆抗体，然后立即调节pH值至中性；测定A280nm以及A260nm，估算蛋白浓度；对洗脱蛋白溶液进行SDS-PAGE分析。
S30’，制备多克隆抗体亲和柱：
S31’，获取Sepharose CL 4B介质(购自上海源叶生物CAS No.61970-08-9)；
S32’，然后将步骤S31’的Sepharose CL 4B介质，用去离子水500mL清洗，抽干成湿饼状(沉降体积为约45mL)，转移到200mL烧杯中；凝胶悬浮在100mL去离子水中，用磁力搅拌棒轻轻搅拌；
S33’，取4.2g CNBr溶解在50ml HPLC级乙腈中，加入到凝胶悬液中，放入pH探头，用20％的NaOH维持反应混合物的pH在11.0，整个***处于冰浴中，温度维持0℃；反应10～15min时，检查CNBr是否全部溶解。此时，NaOH消耗速度将减少；pH稳定在11.0后，反应混合物倾入预冷的砂芯玻璃漏斗中，用1L冰冷的去离子水和500mL冰冷的偶联缓冲掖(pH8.5，0.1MNaHCO3)快速地洗涤凝胶，由于活化载体的不稳定性，凝胶必须立即偶联蛋白质或配基；
滤出液用500mL0.1M FeSO4中和没反应的CNBr，倒入废液缸；
S34’，用pH 8.5的0.1M NaHCO3透析从步骤S25’制备获得的洗脱蛋白溶液(即免疫步骤中分离的高丰度多抗)，并与介质混合，4℃环境下均匀混合35h；加入乙醇胺0.5ml，4℃环境下振荡5h；用pH 7.0，0.01M的PBS缓冲液清洗介质后，装柱。
S40’上样过柱：
S41’将步骤S10’的患者对照血浆样品取20μL，加入980μl 10mM PBS；使用公式：C(mg/ml)＝1.45xA280nm-0.74xA260nm估算样品的蛋白浓度；根据估算的浓度取约含1mg待测样品备用；
S42’取Sepharose CL 4B介质制备一空白层析柱，将步骤S41’制备的待测样品上10mM的PBS平衡过的空白层析柱后，并用PBS清洗3个体积收集流穿液；
S43’将步骤S42’中用空白层析柱初步过滤之后收集的流穿液，上10mM的PBS平衡过的步骤S34’制备的层析柱；并用PBS冲洗介质3～4个柱体积，接收各流穿溶液(该流穿液可以再次进行过柱，并重复2～3次)。
S51’将全部的非正常患者的血浆样品全部过柱之后的流穿液，全部收集后(如果量不够可以进一步加大非正常患者的血浆样品的量)，用透析袋浓缩；
S52’然后参照步骤S21’～S25’的过程，将步骤S51’浓缩得到的病患血浆中的低丰度差异表达蛋白作为抗原，以大鼠为免疫体进行再次免疫，同样最后提取低丰度蛋白的多克隆抗体；
S60’，将步骤S52’制备的低丰度蛋白的多克隆抗体，参照步骤S30’的全部过程制备以该低丰度蛋白多克隆抗体为亲和配体的低丰度亲和层析柱；
S71’，将待测血浆蛋白样品用梯度离心沉降的方式初步简单去除一些高丰度蛋白之后备用；
S72’，将步骤S71’中初步去除了一些高丰度蛋白的待测血浆蛋白样品，用Sepharose CL 4B介质制备一空白层析柱过柱，去除背景干扰，收集流穿液；
S73’，将步骤S72’中空白过柱之后的流穿液，上10mM的PBS平衡过的步骤S60制备的低丰度亲和层析柱，并用PBS冲洗介质3～4个柱体积；
S74’，将步骤S73’过柱之后的低丰度亲和层析柱用咪唑洗脱液进行洗脱，收集洗脱组分。
基本上步骤S74’收集到洗脱液之中即存在所要制备的低丰度差异表达蛋白。为了验证这一结果，本发明中继续进行下述过程：
S80’然后将步骤S74’中获得的洗脱液加入1/4倍体积的50％TCA溶液，4℃冰箱过夜后，于4℃下12000rpm离心30min，取沉淀；
上述沉淀样品加入1mL，-20℃预冷丙酮清洗，4℃，12000rpm，离心10min，弃上清(重复3次)后；真空干燥，保存于4℃冰箱待用。
为了突出对比肝癌患者和正常人蛋白差异表达的情况，分别同时选取已经确诊为肝癌患者血浆和正常健康人血浆分别作为待测样本1和待测样本2，进行处理，最后收集洗脱液。然后进行SDS-PAGE电泳银染，后Western-blot、LTQ-MASS分析，比对的结果参见附图所示。其中附图1为分别采用正常人血浆和另一名肝癌患者血浆分别作为待测蛋白按照上述步骤检测获得的洗脱液进行SDS-PAGE电泳银染的胶片；图1中的条带1～3为正常人血浆经过多克隆抗体亲和吸附后的洗脱蛋白，条带4～6为肝癌患者血浆经过多克隆抗体亲和吸附后的洗脱蛋白；从电泳胶片的条带1～6明显可以看出，正常人条带的蛋白数量明显少于非正常人条带的蛋白量。而且胶条4～6中蛋白的染色明显的蛋白数量为2条、胶条1～3只有1条，并且胶条4～6的拖带现象比较明显，是因为存在较多的蛋白差异表达所造成的。
进一步进行LTQ-MASS分析的结果如下表：
表1正常人血浆经过多克隆抗体亲和吸附后的洗脱蛋白
表2肝癌患者血浆经过多克隆抗体亲和吸附后的洗脱蛋白
从上述差异蛋白的比对结果，正常人和肝癌患者表达的蛋白是存在差异的，具体的相关的功能上可能还不一定准确，有待于更进一步的跟踪和分析，但是乙腈检测到存在差异是可以确定。而且从上述还可以看出本发明的方法得到的低丰度差异表达蛋白，这些是采用常规的2D电泳等蛋白质组学手段无法获取的；而且可以直接一次性便能分离和制备得到低丰度差异表达蛋白的种类和数量，进一步进行层析的流穿液进行LTQ-MASS分析的结果可以看出，检出的正常血浆蛋白和正常细胞功能蛋白的种类和数量减少了，说明本发明方法对于高丰度蛋白的背景干扰去除的效果更好，对低丰度差异表达蛋白具有更高的特异性和针对性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取健康对照组蛋白样品、患者对照组蛋白样品和待测组蛋白样品；
将健康对照组蛋白样品作为抗原进行免疫，制备高丰度蛋白多抗；并以所述高丰度蛋白多抗为亲和配体与固相基质制备高丰度亲和层析柱；
将患者对照组蛋白样品于所述高丰度亲和层析柱进行过柱，并收集流穿组份；
将所述流穿组分浓缩后作为抗原进行再次免疫，制备低丰度蛋白多抗；并以所述低丰度蛋白多抗作为亲和配体固定与固相基质制备低丰度亲和层析柱；
将待测组蛋白样品于所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分。
2.如权利要求1所述的低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，将患者对照组蛋白样品于所述高丰度亲和层析柱进行过柱，并收集流穿组份步骤之前，还包括：
将所述患者对照组蛋白样品用不含高丰度蛋白多抗为亲和配体的空白层析柱进行过柱。
3.如权利要求1或2所述的低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，将待测组蛋白样品于所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分步骤之前，还包括：
将所述待测组蛋白样品用不含低丰度蛋白多抗为亲和配体的空白层析柱进行过柱。
4.如权利要求1或2所述的低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，所述固相基质为Sepharose CL 4B。
5.如权利要求1或2所述的低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，将患者对照组蛋白样品于所述高丰度亲和层析柱进行过柱，并收集流穿组份步骤之前，还包括：
将所述患者对照组蛋白样品进行梯度沉降处理。
6.如权利要求1或2所述的低丰度差异蛋白的分离方法，其特征在于，将待测组蛋白样品于所述低丰度亲和层析柱进行过柱，并收集洗脱组分步骤之后，还包括：
将所述洗脱组分进行浓缩、电泳、Western-blot分析和质谱处理。
7.权利要求1至6任一项所述的低丰度差异蛋白的分离方法在低丰度差异表达蛋白检测上的应用。
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