CN104968375A - 光交联的透明质酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了光交联透明质酸(HA)衍生物,其由HA、作为三甘醇的双功能聚乙二醇(PEG)间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物构成。
Description
发明概述
本发明公开了光交联的透明质酸(HA)衍生物,其由HA、作为三甘醇的双功能聚乙二醇(PEG)间隔基以及选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性化合物构成。
技术背景
水凝胶和海绵是特征为三维结构的聚合物网络,对水凝胶而言其是紧密的,对海绵而言其具有相互连接的孔。海绵通常吸收大量的水,而在水凝胶中该特性(“膨胀”)可能较不显著,其取决于水凝胶的紧密度;非常紧密的凝胶比不非常紧密的凝胶吸附的水少。
已经对这些类型的材料进行了一段时间的研究;例如,水凝胶用于以下领域:药物递送、软组织填充和关节障碍,所述关节障碍受益于向关节***吸收张力和振动的“支承(bearings)”。海绵特别用于组织工程学领域,尤其是它们被细胞建群的能力。这些应用明显完全取决于所使用的起始聚合物的性质。具体而言,在本发明的情况中,选择的聚合物是多糖、即透明质酸(HA),一种由交替的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺残基构成的杂多糖。其是分子量至多13x 106Da的直链聚合物,这取决于其获得的来源和所使用的制备方法。其普遍存在,且在生物有机体中起重要作用,尤其作为许多组织、诸如皮肤、腱、肌肉和软骨的细胞的机械支撑。其还调节许多涉及细胞生理学和生物学的不同的过程、诸如细胞增殖、迁移和分化和血管发生(Weigel P.等人,J Theoretical Biol,1986:219-234;AbatangeloG.等人,J Surg Res,1983,35:410-416;Goa K.等人,Drugs,1994,47:536-566),且还履行其它功能、诸如组织水合和关节润滑。在关节中,关节液中包含的透明质酸在缓慢移动期间用作粘性润滑剂,在快速移动期间,由于其弹性特性,其吸收任何影响关节的损伤或微伤(Balazs EA.等人,J Rheumatol Suppl,1993,12:75-82;Belcher C.等人,Annals of theRheumatic Diseases,1997,56:299-307)。这些受到广泛认可的性质的组合在各种来源的伤口、溃疡和皮肤损害的治疗所用的敷料的制备中和在设计用于骨关节炎、软骨退化等的治疗中的关节内应用的医疗装置中已经使用了一段时间。
使用众多方法从多种多糖来获得具有特定特性的水凝胶;对透明质酸成功使用的最重要的方法包括化学交联(使用与给定官能团特异性反应的分子(二乙烯基砜,BDDE)),或游离基聚合。这些方法,其先决条件为对HA化学修饰以使它们适合之后的交联或聚合(衍生)反应,得到具有良好特性(紧密度、化学和机械耐力和水合能力)的水凝胶;然而,由于衍生和交联同时发生,所以在凝胶的形成过程中,能将试剂残余物保留在它们的结构中,且试剂残余物特别经常是有毒的,因为它们难以除去。
获得聚合物交联形成的另一个***是对之前用适合的官能团衍生过的多糖使用UV辐照以赋予它们光反应性。衍生涉及:键合于多糖物质,当所述多糖物质通过UV辐照被活化时它们键合在一起,使不同的聚合物链交联,并由此生成网络。所述方法特别有利,因为在衍生步骤期间其能容易有效地去除不期望的反应残留或中间体,并因此有助于更安全地制备终产物。可以使用多种光反应性的物质;例如,已知的是从用肉桂酸或胸腺嘧啶衍生化的HA获得的水凝胶(EP0554898;US6602859)和海绵类(EP1666503)。在这些情况中,将透明质酸键合于肉桂酸或胸腺嘧啶残基,然后进行辐照以获得水凝胶;对于海绵,将水凝胶冷冻干燥或冷冻,然后进行第二次辐照周期。可以使用的另外的光反应性的物质是苯基乙基酮;经由酯键与苯基乙基酮键合、然后进行辐照而从透明质酸或其衍生物获得的凝胶是已知的(EP1519962)。现有领域中已知的其它光反应性物质是蒽、核黄素、香豆素和尿嘧啶,对其进行适当衍生化和取代以促进与多糖的键合,所述是多糖通常是酯或酰胺类型的,且因此包括多糖中常出现的-OH、-COOH和-NH2基团。多糖经常在反应前被衍生化,例如以保护一些官能团或以促进所需键的形成。水凝胶的特性、诸如紧密度、水合能力、机械强度等,可以通过调节各种参数来改变(多糖类型、光反应性、两个整体之间的键、与多糖相比光反应性物质的百分比、辐照的强度和持续时间)。
在本发明的范围内,申请人令人惊讶地发现经由特定的间隔基与特定的光反应性物质键合的透明质酸在适合的UV辐照之后生成具有卓越的紧密度的水凝胶,其是生物可降解的、生物相容的、无毒的,且具有形状记忆特性;换言之所述水凝胶保持它们在其中被制备的容器的形状,且可以在切割的同时保持它们的结构,或者非常容易操作。本文所要求的海绵也具有这些相同的特性,具有创新性的是其不是如迄今为止的现有技术所述那样从水凝胶获得,而是从与间隔基和光反应性物质键合的透明质酸的溶液开始、随后经冷冻干燥、最后进行UV辐照来获得;不同于已知的海绵,由此仅需要单一辐照步骤,这代表了相当巨大的工业优势。海绵还具有形状记忆特性,且因此可以被重复浸湿和挤压,而仍然保持相同的形状和结构特性以及需要单一UV辐照。本申请人已经证实该套特性与特定间隔基的使用相关,其使得与现有技术相比本发明具有新颖性和创造性。
具体而言,实施例8和图8阐述了根据所述现有专利EP1519962(其为本申请人所拥有)的实施例2制备的水凝胶和根据本申请的实施例15制备的水凝胶的膨胀度的比较数据。由于后一类水凝胶吸收的水更少,它们是更加紧密的,因而交联是更加有效的。
发明详述
本发明公开和要求了透明质酸(HA)的光交联的衍生物、它们的基于适当制备的可光交联的中间体的UV辐照的通过交联的制备方法、以及所述光交联的衍生物在医药领域的应用。本文所述的光交联的衍生物采用不同紧密程度的水凝胶形式或者采用海绵形式,即具有相互连接的孔的三维结构。它们是生物相容的、生物可降解的、无毒的,且尤其是可以调节它们的紧密程度或孔隙率。这些发明的另外的特性为形状记忆,即保持它们形状的能力、甚至在制备它们的容器之外以及对海绵而言在重复浸湿和挤压之后保持它们形状的能力。本发明的产品可以应用于众多医学和生物医学领域。水凝胶例如可以用于:
·包囊于它们中的或化学键合于它们的活性成分的释放;各种活性成分包括药理学和/或生物学活性物质、诸如营养因子、抗生素、甾体和非甾体抗炎药、蛋白质、肽、激素和血小板提取物;
·用于医药应用的对象的包衣;
·将固体材料、诸如骨粉、珊瑚颗粒、生物陶瓷和羟基磷灰石包囊,使用其可以将用于整形外科、口腔医学等领域的糊剂进行模型塑造;
·填充在软组织、诸如皱纹、凹陷瘢痕中的各种尺寸的缺损和源自外科手术的洞;
·用作细胞生长和组织、诸如骨、脂肪组织、皮肤、软骨、腱、韧带、肌肉、神经组织、内皮组织、***等再生的支架。可以在植入前将细胞(无论分化的或未分化的)***支架中,并适当地培养;或者,可以将支架***待治疗的损害(lesion)处,并放置以使其被损害位置生理性存在的细胞建群。对于该类型应用,其尤其可以用于将透明质酸在辐照前与胶原蛋白混合,所述胶原蛋白保持被物理捕获在形成的水凝胶网中,所述胶原蛋白赋予所述水凝胶更大的弹性,并改善其结构能力(structural capacity)和对其将被放置的位置的适应;
·用作手术后防止粘连的机械屏障和保护组织免受炎性损害;
·通过关节内注射治疗骨关节炎和/或软骨损伤。再次,如上文所述,水凝胶可以包含分化的或未分化的细胞和/或药理学或生物学活性物质。
由于海绵在它们的孔中收藏细胞的能力,其尤其可用于组织工程学领域(例如用于皮肤、骨、软骨、脂肪组织、腱、韧带、肌肉、神经、内皮和***);如在水凝胶类的情况中,可以在植入前将细胞(分化的或未分化的)***支架中,并适当地培养;或者,可以将支架***待治疗的损害处,并放置以使其被损害位置生理性存在的细胞建群。由于它们的结构,海绵特别适用于在形成腔洞的和深的损害(诸如大切除手术(乳腺、黑素瘤或深痣的全部和部分切除)后形成的那些)中的组织重建。
海绵也可以用作(如同水凝胶)骨或牙科损害的填充材料(任选地与药理学和/或生物学活性物质组合),以及最后用于骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗。在冷冻干燥(其在辐照之前)前将胶原蛋白加入海绵,这又赋予它们更好的稳定性和弹性的结构特性,且使得它们特别适用于其将被使用的位置的形状和尺寸。
本发明涉及的衍生物由以下构成:
·透明质酸;
·特定的双功能PEG间隔基;
·光反应性物质,其选自苯基乙基酮和香豆素衍生物
其(如下文所述那样键合)形成可光交联中间体,后者从而在UV辐照后,生成本文描述和要求的水凝胶和海绵形式的光交联的衍生物。如所述,所述衍生物可以任选地包含胶原蛋白,用于以上述及的目的。
更具体地,本发明的第一个目的是透明质酸(HA)的光交联的衍生物,其由HA、作为三甘醇的双功能聚乙二醇(PEG)间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物构成。
如所述,使用的多糖为透明质酸,已经描述了其主要特性。具体而言,本文使用的HA可以源自任何来源、诸如来自公鸡鸡冠提取(EP 138572),发酵(从马链球菌(Streptococcus equi)或兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus))或生物合成(来自Bacillus),且具有10kDa至1000kDa的范围的平均分子量、优选40k Da至700kDa、且甚至更优选160kDa至220kDa的范围的平均分子量;最后这个部分在下文被简称“具有200kDa平均MW的HA”。需要强调的是在本说明书中,“平均分子量”意指通过“特性粘度(intrinsic viscosity)”方法计算得到的重量平均分子量(Terbojevich等人,Carbohydr Res,1986,363-377)。
对于间隔基,聚乙二醇(PEG)适用于本发明的目的。PEG通过环氧乙烷的聚合获得;其由直链构成,且由于多能性其广泛用于化学和制药工业,尤其是其没有毒性。其还是双功能间隔基,可以在其链的两个末端键合于不同的分子。取决于聚合程度,其可以具有极其不同的MW;用于本发明目的,使用的PEG是三甘醇,其具有150Da的MW;因此其是基本由三个残基形成的链。
对于光反应性物质,在所引用的多个类别中,本文成功使用和要求了苯基乙基酮和香豆素;在可获得的香豆素衍生物的多种类型(伞形酮、七叶亭、东莨菪亭、补骨脂素类、呋喃并香豆素类化合物(furanocoumarin)和双香豆素)中,特别优选7-羟基香豆素(也称为伞形酮)。
最后,对于胶原蛋白,可以使用来自从所有类型的组织、特别是来自马科动物(equine)、猪类动物(porcine)、牛科动物(bovine)和绵羊类动物(ovine)的腱和皮肤提取的天然胶原蛋白和/或水解胶原蛋白(明胶)。除提取的胶原蛋白之外,不应当排除通过生物技术(发酵或酶技术)制备的各种类型的胶原蛋白。可光交联HA与胶原蛋白的比例范围可以为5:1至1:5重量/重量,这取决于要获得的最终结构的类型;特别优选来自马科动物腱的胶原蛋白,其中可光交联HA/胶原蛋白比例范围为1:1至1:4。
本发明的另一个目的是反应中间体,其由包含透明质酸(HA)、作为三甘醇的双功能聚乙二醇(PEG)间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物的可交联的等渗溶液构成,其中双功能间隔基和HA之间的键是酯或酰胺键,且光反应性的化合物和双功能间隔基之间的键是醚键。
本发明还涉及医学装置,其包含本发明的至少一种透明质酸的光交联的衍生物。
本发明还涉及制备形状记忆水凝胶形式的衍生物的方法,其包括以下的步骤:
a)形成PEG与香豆素衍生物或苯基乙基酮之间的醚键;
b)形成步骤a)中得到的产物和HA之间的酯或酰胺键,在酯键的情况中HA的最终衍生程度范围为5至80mol%,在酰胺键的情况中HA的最终衍生程度范围为1至50mol%;
c)将步骤b)中得到的产物溶液化,并通过波长300至450nm、优选320至380nm的UV射线将得到的等渗含水溶液辐照1分钟至24小时。
制备形状记忆海绵形式的本发明的衍生物的方法,其包括以下步骤:
a)形成PEG和香豆素衍生物或苯基乙基酮之间的醚键;
b)形成步骤a)中得到的产物和HA之间的酯或酰胺键,在酯键的情况中HA的最终衍生程度范围为5至80mol%,且在酰胺键的情况中,HA的最终衍生程度范围为1至50mol%;
b’)将步骤b)中得到的产物在等渗含水溶液中溶液化,并将由此得到的等渗含水溶液冷冻干燥;
c)通过波长300至450nm、优选320至380nm的UV射线将步骤b’)中得到的产物辐照1分钟至24小时。
得到本发明的凝胶和海绵的方法因此包括多个步骤,其可以示意描述如下:
-对于水凝胶:
a)通过醚键将光反应性物质键合于双功能间隔基,以形成能在之后的步骤与HA反应的可光交联的基团;
b)通过酯或酰胺键(其涉及葡糖醛酸残基的游离的羧基)将步骤a)中得到的产物键合于HA;对于酯键而言HA的最终衍生程度范围为5至80mol%,对于酰胺键而言为1至50mol%。得到的沉淀可溶于水和/或含水溶液中,且可在溶液化后经0.22μm过滤器过滤灭菌;
c)将步骤b)中得到的产物溶于等渗含水溶液中,并用300至450nm、优选320至380nm的波长的UV射线辐照1分钟至24小时,得到的物质为最终的光交联的产物;
-对于海绵:
b)通过酯或酰胺键(其涉及葡糖醛酸残基的游离的羧基)将步骤a)中得到的产物键合于HA;对于酯键而言HA的最终衍生程度范围为5至80mol%,对于酰胺键而言为1至50mol%;
b’)将之前的步骤b)中得到的产物溶于等渗含水溶液中,并将得到的溶液进行冷冻干燥,其由三个分离的步骤组成:冷冻;升华(或首次干燥);和脱附(或二次干燥);
c)将由此得到的冷冻干燥物用300至450nm、优选320至380nm的波长的UV射线辐照1分钟至24小时;
整个过程最复杂的步骤自然是步骤b),因为HA和间隔基-光反应性物质之间的键可以是酯或酰胺型,所以涉及不同的官能团并需要不同的条件;取决于键的性质,得到的凝胶和海绵将具有不同的特性。
具体而言,本申请人就所要产生的键的类型给出了步骤b)的示意的具体说明:
-HA和可光交联的基团的酯衍生物(A)的制备
‐从具有40kDa至700kDa、优选160至220kDa的范围的分子量的HA钠盐起始制备HA的季铵盐。
‐HA的季铵盐在1至200mg/mL的浓度的极性非质子溶剂(DMSO、DMF或NMP、优选DMSO)中与具有适当制备的可光交联的基团的卤化物衍生物(碘化物、溴化物或氯化物、优选碘化物)反应,卤化物/HA摩尔比范围为0.05至0.8、优选0.2至0.5,温度范围为20℃至50℃、更优选为35°至45℃,进行4h至72h、优选18h至48h。
‐通过在有机溶剂(乙醇、乙酸乙酯、丙酮)中沉淀以及洗涤,分离和纯化用可光交联的基团酯化和钠盐形式的HA衍生物(A);HA的最终衍生程度的范围是5至80mol%:
-HA和可光交联的基团的酰胺衍生物(B)的制备
‐从具有40kDa至700kDa、优选160至220kDa的范围的分子量的HA钠盐起始制备HA的季铵盐。
‐用活化剂(CDI、CMPJ、EDC、HOBT或NHS、优选CDI)在极性非质子溶剂(DMSO、DMF或NMP、优选DMSO)中活化HA季铵盐,活化剂/HA摩尔比范围为0.01至0.5,进行0.1h至3h,温度范围为35℃至45℃。
‐活化的HA与具有适当制备的可光交联的基团的胺衍生物在极性非质子溶剂(DMSO、DMF或NMP、优选DMSO)中反应,胺/HA摩尔比范围为0.01至1.5,温度范围为35至45℃,进行4h至30h(优选12h至24h)。HA的最终衍生程度的范围为1至50mol%。
‐通过在有机溶剂(乙醇、乙酸乙酯、丙酮)中沉淀以及洗涤,分离和纯化用可光交联的基团酰胺化的和钠盐形式的HA衍生物(B)。
就水凝胶和海绵而言,相应的制备方法的步骤示意如下:
基于用可光交联的基团酯化的HA衍生物(A)的水凝胶的制备:
‐在磷酸盐、盐酸盐或盐水缓冲液(优选盐水)中制备等渗含水溶液(A),浓度范围为5至70mg/ml,
‐经0.22μm醋酸纤维素薄膜过滤器过滤来灭菌
‐将无菌溶液置于可透过UV射线的容器(诸如聚乙烯)中
‐用伍德氏灯和波长范围300至450nm、更优选320至380nm的光束将该溶液辐照1分钟至24h;
基于用可光交联的基团酰胺化的HA衍生物(B)的水凝胶的制备
‐在磷酸盐、盐酸盐或盐水缓冲液(优选磷酸盐缓冲液)中制备等渗含水溶液(B),浓度范围为1至40mg/mL,
‐通过自动洗涤(autowashing)或经0.22μm醋酸纤维素薄膜过滤器过滤来灭菌
‐将无菌溶液置于能透过UV射线的容器(诸如聚乙烯)中
‐用伍德氏灯和波长范围300至370nm、更优选320至365nm的光束将该溶液辐照1分钟至24h;
海绵的制备:
-制备具有可光交联的基团的酯或酰胺HA衍生物的等渗含水溶液(含0.9%NaCl、或1至20%重量/体积的甘露醇、或1至20%体积/体积的异丙醇、或1至20%重量/体积的葡萄糖)、优选仅水,浓度范围为1至70mg/ml。
-在以下步骤中冷冻干燥:
·冷冻:将所述溶液倾入适当的盘中(以得到0.5至20mm、优选2至7mm的厚度),所述盘静置于冻干机的搁板上,所述搁板的冷却温度被设置为-3℃并且在该温度保持直至所述溶液达到2℃(1至8小时、优选4至5小时)。将搁板的温度降至-30℃并且该搁板温度根据要使溶液达到至少-20℃的需要来保持(3至10小时、优选4至7小时);
·升华(或首次干燥):将所述仪器的冷凝器调节至至少-30℃的温度,并且使用真空泵将冻干机腔中的压力降至8x10-1和5x10-3mbar范围的值、优选8x10-2至2x10-2mbar。然后将搁板逐渐加热(在1至3小时的时间范围内)到-10°至10℃、优选0℃的温度;将该温度保持稳定达至少12小时,或直至产品达到与搁板相同的温度,压力是相同的;
·脱附(或二次干燥):将搁板逐渐加热(在1至3小时的时间范围内)到15°至55℃、优选25℃的温度,而不改变所施加的压力。将该温度保持稳定达至少8小时,或直至产品达到与搁板相同的温度。在确保脱附完成后,通过注入脱水的、微孔过滤的(microfiltered)氮气来恢复冻干机腔中的压力;
-用波长范围300至450nm、优选320至380nm的光束将从前述步骤得到的冷冻干燥的固体辐照1分钟至24h。
对于海绵而言,就如同水凝胶,辐照的持续时间的变化可以非常大,其受到波长的选择性、UV灯发射的强度、材料的厚度和辐照操作程序的强烈影响。后者根据所使用的灯的类型而不同;如果使用单一灯,则将样品旋转以便将整个表面暴露于UV射线。如果使用多重灯则不需要旋转,因为其同时辐照整个暴露表面。还应注意的是,通过调节所涉及的参数(初始溶液的浓度、所使用溶剂的类型、冷冻干燥条件和辐照条件),海绵的孔隙率和水凝胶的紧密度能够被提前确定。这一方面是至关重要的,考虑到特别是海绵,还有水凝胶,是可被细胞建群的。所述细胞,无论是分化的还是未分化的,能被***植入前的所述海绵或水凝胶中并被适当培养;或者所述海绵或水凝胶能被植入待处理的损害中,使得其会被所述损害位置生理性存在的细胞建群。
如所述,本申请人令人惊讶地发现了,本文所要求的水凝胶和海绵的特有的特性在决定性的程度上取决于所使用的间隔基(PEG)的链长度以及其化学性质。已经通过大量测试证明了,使用具有长链的间隔基妨碍材料均匀、紧密的胶凝,其不再可定义为“形状记忆”;通过去除间隔基得到了类似的结果。也在海绵中发现了这些特性,其变得非常脆弱,不仅在被浸泡和挤压后完全不能保持它们的形状,而且在只是放入含水溶液中也是如此。特别地,申请人出乎预料地发现,由三个残基构成的PEG链赋予本文所述的材料那些所讨论过的特性。鉴于所有这些因素,申请人还已合成了没有间隔基的一些类似的可光交联的衍生物,以比较所得到的产品。
本文所述和所要求的水凝胶和海绵的一些制备实施例见下文所列,其根据所示的方法进行。
所使用的光反应性物质是7-羟基香豆素(伞形酮)或苯基乙基酮,其必须被适当地处理,这样它们键合所述双功能间隔基(三甘醇),或者直接与HA反应来给出比较产品。实施例遵循以下所列方案:
‐实施例1、2和3:待经由酯键键合于HA的伞形酮-三甘醇;
‐实施例4:待键合于具有酯键的HA(直接)的衍生化的伞形酮;
‐实施例5和6:待经由酰胺键键合于HA的伞形酮-三甘醇;
‐实施例7和8:待键合于具有酯键的HA(非直接)的苯基乙基酮-三甘醇。
实施例1:4-甲基苯磺酸2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙基酯(1)的合成。
将180mL无水CH2Cl2、10.0mL(2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇、10.55mL三乙胺(Et3N)和16.8g N,N’二甲氨基吡啶(DMAP)加入装备有磁力搅拌器、氩气流和冰浴的双颈烧瓶中。然后加入溶于60mL无水CH2Cl2中的14.43g甲苯磺酰氯(TsCl),在氩气流下将温度保持在0℃。将该反应在0℃进行1h 30min,然后在室温进行3h 30min。将有机相用水、1N HCl、饱和的NaHCO3水溶液和饱和的NaCl水溶液洗涤,并经MgSO4干燥,然后将溶剂在低压下除去。1H NMR分析检测到所需产物的存在,其不需要进一步纯化。
实施例2:7-(2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(2)的合成。
将18.3g伞形酮、200mL丙酮和溶于丙酮(600mL)中的39.0g 4-甲基苯磺酸2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙基酯(1)、93.6g K2CO3和催化量的18-冠-6加入装备有磁力搅拌器、油浴、冷却剂和氩气流的双颈烧瓶中。将该反应在搅拌下回流24h;然后将冷却的反应混合液用Celite经古氏漏斗过滤,并将溶剂在低压下除去。通过1H NMR分析确定得到的产物的性质(白色结晶固体)。
实施例3:7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(3)的合成。
将2.5g 7-(2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(2)和丙酮(50mL)加入装备有磁力搅拌器、油浴和冷却剂的双颈烧瓶中。然后加入碘化钠(8.35g),并将该混合液在搅拌下回流48h。通过将该混合液放置冷却、将其经古氏漏斗和Celite过滤、然后在低压下除去溶剂来进行后处理。通过1H NMR光谱分析确定终产物的本质(白色结晶固体),在图1中报道。
在图1中:在CDCl3中的(3)的1H NMR,400MHz,δ(ppm):7.63(d,J=9.5Hz,1H),7.37(d,J=8.6Hz,1H),6.89–6.84(m,2H),6.26(d,J=9.5Hz,1H),4.24-4.15(m,2H),3.95-3.88(m,2H),3.80-3.66(m,6H),3.26(t,J=6.9Hz,2H)。
实施例4:7-溴甲基香豆素(4)的合成。
将7-甲基香豆素(3.0g)、N-溴琥珀酰亚胺(3.34g)和四氯化碳(80mL)加入装备有油浴、磁力搅拌器和冷却剂的双颈烧瓶中。在搅拌下加入AIBN(31mg),并将该混合液在搅拌下回流(106℃)1小时30分钟。将该混合液冷却至室温,用旋转式蒸发器和机械泵除去溶剂;然后向残余物中混入水,并将该反应物在搅拌下进行2h。将该混合液经古氏漏斗过滤,并将沉淀用水溶解,并在搅拌下放置再进行1小时。将该混合液经古氏漏斗过滤,然后将溶剂用机械泵除去。得到所需产物,并通过1H NMR分析确定其本质。
实施例5:7-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(5)的合成。
将4.0g 7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(3)(如在实施例3中所述那样获得)、1.93g NaN3和30mL蒸馏水加入装备有磁力搅拌器、油浴和冷却剂的双颈烧瓶中。将该反应在搅拌下回流过夜,然后用CH2Cl2萃取,经MgSO4干燥,并经古氏漏斗过滤。将溶剂在低压下除去。将产物经快速色谱(洗脱剂:环己烷/AcOEt 2:1)纯化。得到浅黄色透明油状物,通过1H NMR分析确定其本质。
实施例6:7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(6)的合成。
在装备有磁力搅拌器、冰浴和氩气流的双颈烧瓶中将2.02g 7-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(5)溶于25mL无水THF中。在0℃加入1,742g三苯基膦,并将该反应混合液在全程搅拌下在室温放置18h。加入3mL蒸馏的H2O,并将该反应在搅拌下在室温进行过夜。将溶剂在低压下除去,然后经该产物纯化经快速色谱。通过确定得到的产物的本质1H NMR分析。在CDCl3中的(6)的1H-NMR谱在图2中显示。
实施例7:1-(4-(2-(2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙-1-酮(7)的合成。
将31.2g 2-羟基-1-(4-(2-羟基乙氧基)苯基)-2-甲基丙-1-酮、400mL丙酮和如实施例1中报道而合成的并且溶于丙酮(600mL)中的39.0g 4-甲基苯磺酸2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙基酯、93.6g K2CO3和催化量的18-冠醚-6加入装备有机械搅拌器、油浴、冷却剂和氩气流的双颈烧瓶中。将该反应在搅拌下回流24h;然后将冷却的反应混合液用Celite经古氏漏斗过滤,并将溶剂在低压下除去。通过1H NMR分析确定得到的产物的本质(白色结晶固体)。
实施例8:2-羟基-1-(4-(2-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-2-甲基丙-1-酮的合成(8)。
将4.0g 1-(4-(2-(2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-2-羟基-2-甲基丙-1-酮(7)和丙酮(80mL)加入装备有磁力搅拌器、油浴和冷却剂的双颈烧瓶中。然后加入碘化钠(8.35g),并将该混合液在搅拌下回流48h。通过将该混合液放置冷却、将其经古氏漏斗和Celite过滤、然后在低压下除去溶剂来进行后处理。通过1H NMR光谱分析确定终产物的本质(白色结晶固体)。
将如上文所述得到的光反应性物质与HA反应如下:
‐实施例9和10:通过酯键合于HA的伞形酮-三甘醇;
‐实施例11和12:通过酯键合于HA的伞形酮;
‐实施例13和14:通过酰胺键合于HA的伞形酮-三甘醇;
‐实施例15:通过酯键合于HA的苯基乙基酮-三甘醇。
实施例9:使用7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮合成HA酯衍生物(9)–最终官能团化率30%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中,将2.0gHATBA溶于240mL无水DMSO中,并加入521mg如实施例3中所述制备的7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(3)(521mg)。将该反应在40℃进行48h;然后在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,并通过逐滴加入EtOH进行沉淀。将产物通过在EtOH/H2O 95:5和绝对EtOH中洗涤来纯化,然后在高真空下干燥。通过FTIR、RP-HPLC和1H-NMR分析由此得到的产物,显示32%的官能团化率和92%的收率。图3显示(9)的FTIR谱,图4显示与HANa(线B)相比的(9)的1H-NMR谱(线A),在D2O中。
实施例10:使用7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮合成HA酯衍生物(10)–最终官能团化率50%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中,将2.0gHATBA溶于240mL无水DMSO中,并加入521mg如实施例3中报道制备的7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(1.0241g)。将反应在40℃进行48h;然后在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,并通过逐滴加入EtOH进行沉淀。通过在EtOH/H2O 95:5和绝对EtOH中洗涤将产物纯化,然后在高真空下干燥。通过FTIR、RP-HPLC和1H-NMR分析由此得到的产物,显示49%的官能团化率和86%的收率。
实施例11:使用7-(溴甲基)-2H-色烯-2-酮合成HA酯衍生物(11)–最终官能团化率40%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中将2.0gHATBA溶于240mL DMSO中。然后加入308g如实施例4中报道制备的7-溴甲基-2H-色烯-2-酮(4),并将该反应在40℃进行72h。在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,随后用96%EtOH沉淀。经在96%EtOH/H2O 8:2和绝对EtOH中洗涤纯化产物。得到粉末性白色化合物,将其在高真空下干燥。
实施例12:使用7-(溴甲基)-2H-色烯-2-酮合成HA酯衍生物(12)–最终官能团化率90%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中将2.0gHATBA溶于240mL DMSO中。然后加入1.011g如实施例4中报道制备7-溴甲基-2H-色烯-2-酮(4),并将该反应在40℃进行72h。在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,随后用96%EtOH沉淀。将产物通过在96%EtOH/H2O8:2和绝对EtOH中洗涤来纯化。得到粉末性白色化合物,将其在高真空下干燥。通过FTIR、RP-HPLC和1H-NMR分析产物,显示91%的官能团化率。在图5中显示(8)的FTIR谱。
实施例13:用7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮合成HA酰胺衍生物(13)–最终官能团化率20%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中将2.0gHATBA溶于200mL DMSO中。然后加入63μl甲磺酸和0.1145g羰二咪唑,并将该反应在42℃进行1h。然后加入0.7208g如实施例6中报道制备的7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(6),并在搅拌下在40℃放置24h。在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,随后用96%EtOH沉淀。将产物通过在96%EtOH/H2O 8:2和绝对EtOH中洗涤来纯化。得到粉末性白色化合物,将其在高真空下干燥。
实施例14:用7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮合成HA酰胺衍生物(14)–最终官能团化率40%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中将2.0gHATBA溶于200mL DMSO中。然后加入63μl甲磺酸和0.2389g羰二咪唑,并将该反应在42℃进行1h。然后加入1.4015g如实施例6中报道获得的7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2H-色烯-2-酮(6),并将该反应在搅拌下在40℃进行24h。然后在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,随后用96%EtOH进行沉淀。将产物通过在96%EtOH/H2O 8:2和绝对EtOH中纯化洗涤。得到粉末性白色化合物,将其在高真空下干燥。
实施例15:用2-羟基-1-(4-(2-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-2-甲基丙-1-酮合成HA酯衍生物(15)–最终官能团化率50%。
在装备有耐热的乙二醇夹套和磁力搅拌器的玻璃反应器中,将2.0gHATBA溶于240mL无水DMSO中,并加入751mg如实施例8中报道制备的2-羟基-1-(4-(2-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-2-甲基丙-1-酮(8)。将反应在40℃进行48h;然后在搅拌下加入饱和的NaBr溶液,并通过逐滴加入EtOH进行沉淀。将产物通过在EtOH/H2O 95:5和绝对EtOH中纯化洗涤,然后在高真空下干燥。通过RP-HPLC和1H-NMR分析由此得到的产物,显示45%的官能团化率和89%的收率。
在无菌过滤器测试根据上文所述方法得到的化合物的溶解度和过滤性,如下文所述
实施例16:如实施例9和11所述制备的化合物的溶液化和之后的胶凝的测试。
将通过实施例9和11中报道的合成方法得到的产物溶于含水溶剂(0.9%NaCl盐水溶液、磷酸盐缓冲液等)来制备已知的浓度范围10至40mg/mL的溶液。由此得到的溶液显得澄清,且不非常粘稠;为评价经0.2μm再生纤维素(RC)无菌过滤器的过滤的可能性,在过滤之前和之后记录溶液的UV谱,比较在320nm的吸光度。记录的值表明该产物可以以该方式过滤,回收率97%。图6显示在经0.22μm RC过滤之前和之后,浓度30mg/mL的被称为HA019的(9)的溶液的UV谱。
这方面至关重要,因为可经无菌过滤器过滤的溶液能在进行至所述方法的下一步骤之前灭菌,且因此除去所有杂质。此外,在灭菌步骤的产物损失最小,所以所述方法从工业观点来说的确是经济的。
对在之前溶于盐水溶液中的浓度范围10至40mg/mL的相同的产品(如实施例9和11中所述)进行胶凝测试。经0.2μm过滤器过滤后,将该溶液置于容器中,并使用波长300-380nm的光束在室温或在37℃(没有显著差异)辐照1至20分钟。对于如实施例9中所述得到的产物的情况,在所有测试浓度都形成了水凝胶;起始溶液的浓度越高或辐照时间越长,紧密度越大。如实施例11中所述得到的产物、包括在不同的浓度的溶液经长时间辐照之后,不生成与产物(9)相同稠度的水凝胶。
特别是,在仅5分钟的辐照后,产物(9)甚至在10mg/mL的浓度也具有紧密的形状记忆结构。如所述,浓度相等时,凝胶的紧密度随辐照时间增加,所以在30mg/mL的浓度仅辐照5分钟后,形成极其紧密的能经受切割、压力和操作而结构没有任何改变的水凝胶,其在10、15或20分钟辐照后更是如此。
与之相反,30mg/mL的浓度的产物(11)在15分钟的辐照后仅达到中等程度的紧密度;在5和10分钟后,该凝胶不能保持容器的形状,更不能经受压缩或切割。
所以很明显的是,通过对键合于三甘醇、随后通过酯键键合于HA的伞形酮的溶液进行辐照而得到的水凝胶,具有令人惊讶的紧密度、弹性和机械强度特性。
实施例17:依据辐照时间的(9)的膨胀研究。
在分别辐照10或20分钟后,对源自属于类别(9)的化合物的水凝胶进行膨胀试验(SW)。膨胀包括将水凝胶浸泡在蒸馏水中达规定时间,比较初始重量与随时间增加的重量(由于吸收水)。根据下式计算SW值:
图7显示与如实施例9中所示制备的水凝胶的膨胀度相关的图(使用记录的重量值得到)。该图的分析证实上文所述,即,浓度相等时,辐照的持续时间使得水凝胶更紧密,所以其吸收更少的水,反之,辐照时间相等时,水凝胶的紧密度随起始溶液的浓度增加。
实施例18:从具有已知浓度的(9)的溶液制备海绵。
将462.3mg如实施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于23mL Milli-Q水中,得到浓度20mg/ml的溶液。当溶液化完成时,将该溶液倾入直径7.7cm的圆形玻璃盘。
冷冻干燥:将该盘转移至冷冻干燥器的搁板中,后者被冷却至-3℃。将所述搁板在所述温度保持4小时,直至该溶液达到至少2℃的温度。然后将所述搁板冷却至-35℃,并将所述温度保持6小时,直至所述溶液完全冷冻。在将冷凝器冷却至低于-35℃的温度后,将真空泵打开,并运行直至腔内达到低于1x 10-1mbar的值。将所述搁板在2小时中逐渐加热至-5℃。当达到设定温度后,将其保持24小时。在该时间后,将所述搁板加热至25℃,并由此所达到的温度保持6小时。将得到的样品***聚苯乙烯陪替氏培养皿中以避免潮湿。
辐照:将样品放置具有在330至380nm的放射光谱的伍德氏灯下达12小时。每3小时将盘倒置以使样品的整个表面受到辐照。
由此得到的海绵是均匀多孔的,且没有薄片(lamellae);当浸入30mL盐水溶液达24小时时,其形状和质地均保持不变。还使海绵进行多个挤压和饱和周期(至少4个):甚至在该应力情况下,海绵仍保持其形状、结构、弹性和孔隙率不变,且因此具有形状记忆特性。
然后将该海绵与如实施例18中所述制备的、但不进行辐照的类似的海绵进行比较;该非辐照的海绵在一接触到水时就碎裂了。
所述成分和本文所遵循的方法二者的重要性均进一步被以下事实证实:根据实施例18制备了另一种海绵,但辐照和冷冻干燥步骤的顺序被颠倒。因此,在与实施例18描述相同的条件下,将得到的溶液辐照,并将得到的凝胶冷冻干燥;当将得到的海绵置于水中时,其被溶解,生成紧密的凝胶。
类似水凝胶那样,将得到的形状记忆海绵与由通过酯键键合于伞形酮的HA(即没有间隔基,如实施例11中)制备的类似的海绵进行比较。
实施例19:从具有已知浓度的(11)的溶液制备海绵。
将462.3mg如实施例11中所述得到的HA酯衍生物溶于23mLMilli-Q水中,得到浓度20mg/mL的溶液。当溶液化完成,将该溶液倾入直径7.7cm的圆形玻璃盘中。
将该溶液进行冷冻干燥和辐照(正如实施例18中),并将得到的海绵浸入30mL盐水溶液中;其在与该含水溶液非常短暂的接触后溶解。
如已经对水凝胶所述的那样,也证实了对于海绵而言只有在使用间隔基分隔HA与伞形酮时、且仅通过遵循上文所述的精确的方法流程时,才令人惊讶地获得了形状记忆性质(结构、弹性和孔隙率)。
实施例20:与如EP1519962的实施例2所述那样制备的同等衍生物对比进行的(15)的膨胀研究。
对由如实施例15中所述合成的化合物和如EP1519962的实施例2所述合成的化合物以30mg/mL的浓度、并辐照20分钟后制备的水凝胶进行膨胀试验(SW)。如EP1519962的实施例2中所述合成的化合物是如下衍生物,其中苯基乙基酮的可光交联的基团以类似于(15)的百分比(即约50%)通过酯键直接键合于HA。
通过对比初始重量与由于水吸收导致的重量增加,如实施例17中所述那样计算SW值。图8显示使用相对于时间记录的重量值得到的图。
该图的分析证实,当取代度相同时,HA与光交联的基团之间的三甘醇间隔基的存在生成了吸收更少水的水凝胶,且其因此更紧密;因此交联更有效。如EP1519962的实施例2所述得到的产物在仅1小时后吸收的水比(15)多了近50%,且这种趋势随时间进行在持续。因此该水凝胶具有与如本发明中所述的使用HA与光交联的基团之间的三甘醇间隔基得到的水凝胶非常不同的质地。在没有间隔基的情况下,不能保持能经受压缩和切割的紧密度、弹性和机械强度的特性和形状记忆特性。
实施例21:从(9)制备的水凝胶的流变学特征鉴定。
流变学测定在25℃进行,以振荡方案进行;具体而言,仅测定了弹性模量G’,其表示水凝胶的紧密度且因此其是基本参数。G’(弹性模量)在0.07至90.0rad/s以Pa测定,力值为10%。从使用低功率UV灯辐照后胶凝的样品获得的数值与交联百分比(通过HPLC-MS分析计算)直接相关,假设在t 0的光聚合百分比是零。
从图(图9)中将会看出,弹性模量G’(表示为Pa,在0,628rad/s)的趋势与交联程度的趋势成比例;因此辐照更长时间的溶液交联更高,所以显示更佳的弹性性质,具有更高的G’值。
实施例22:对在由(9)制备的水凝胶的存在下的人成纤维细胞培养物细胞增殖的评价。
评价细胞增殖的标准方案涉及MTT试验的应用。简言之,所述试验定量测定培养的细胞中琥珀酸脱氢酶活性的存在;仅存在于存活细胞的线粒体中的所述活性通常用作检查培养的细胞的代谢活性、生存力和由此的生长的标志。该试验基于琥珀酸脱氢酶使唑鎓染料MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5二苯基四氮唑溴化物)从黄至蓝的转化。分光光度计测量的蓝色染料(甲)的量与细胞培养物中存在的琥珀酸脱氢酶成比例,因此与存活细胞的数量成比例。
在以浓度20mg/mL或30mg/mL在溶液中的(9)的存在下(以增加的浓度(20、50、100μL)),或者在对照情况中仅为培养基,将混悬于适合的培养基中的人成纤维细胞(HF)接种于24-孔多孔板中。将细胞(HF)用0.5mg/mL MTT溶液在37℃孵育3小时。在孵育的末尾,使用提取溶液(90%异丙醇、10%DMSO)从HF中提取染料,并在570nm的波长读取(OD、光密度)。
24h后在570nm检测OD值(图10)。
图10显示由此制备的HA衍生物的溶液是无毒的,甚至在逐渐增加的量的情况下如此,并且保持了细胞生存力。
实施例23:评价在如实施例19所述制备的海绵上的人成纤维细胞增殖。
将人成纤维细胞(HF)混悬物接种于如实施例19所述制备的海绵上,并转移至24-孔板。接种后1小时,加入1mL培养基;在培养3和7天后进行MTT试验(图11)。
对照由接种于24孔多空板的并仅用培养基处理的相同量的HF组成。
从图(图11)中可以看出,接种于海绵的人成纤维细胞在3和7天培养后是活的、能生存的和增殖的。它们的生存力是这样的以致诱导比对照更高的增殖;在3天后增殖的百分比更佳,而且在7天后也是相当大的。这些结果清楚地证明了如本发明描述制备的海绵不仅对细胞不具有任何毒 性,而且实际上还促进细胞增殖。应当知晓的是,在接种于海绵上并且随后转移至孔中的过程中,许多细胞损失了,所以在图11中显示的增殖数值甚至是更令人惊讶的。
实施例24:以1:1的w/w比例添加胶原蛋白的源自(9)的溶液的水凝胶的制备。
将600mg如实施例9中所述得到HA酯衍生物溶于20mL盐水中,得到30mg/mL的浓度。溶液化完成后,在冰浴中通过逐渐加入0.05M HCl将pH调节至弱酸性值(pH≈4)。然后加入预先制备的浓度60mg/ml的10mL来自马腱的胶原蛋白的酸溶液。在完全混合后,将该溶液经0.2μm过滤器微孔过滤,置于容器中,并在室温用波长300-380nm的光束辐照3至15分钟。
得到了在切割或操作后能保持其形状的紧密的水凝胶。
实施例25:从已知浓度的(9)的溶液以1:1的w/w比例加入胶原蛋白来制备海绵。
将400.0mg如实施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于20mL Milli-Q水中,得到浓度20mg/mL的溶液。在完全溶液化后,在冰浴中通过逐渐加入0.05M HCl将pH调节至弱酸性值(pH≈4)。然后加入预先制备的浓度40mg/ml的10mL来自马腱的胶原蛋白的酸溶液。在完全混合后,将该溶液经0.2μm过滤器微孔过滤,并倾入直径5.0cm的圆形玻璃盘中。
将该溶液冷冻干燥,并如实施例10中所述进行辐照。将得到的海绵浸入30mL盐水溶液中不发生溶解或碎裂,甚至在与该含水溶液长时间接触(72-96h)后也不溶解或碎裂,且具有与实施例20中描述的海绵类似的形状记忆性质。
实施例26:从已知浓度的(9)的溶液以1:4的w/w比例加入胶原蛋白来制备海绵。
将400.0mg如实施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于20mL Milli-Q水中,得到浓度20mg/mL的溶液。在完全溶液化后,在冰浴中通过逐渐加入0.05M HCl将pH调节至弱酸性值(pH≈4)。然后加入预先制备的浓度160mg/ml的10mL来自马腱的胶原蛋白的酸溶液。在完全混合后,将该溶液经0.2μm过滤器微孔过滤,并倾入直径5.0cm的圆形玻璃盘中。
将该溶液冷冻干燥,并如实施例10中所述进行辐照。将得到的海绵浸入30mL盐水溶液中不发生溶解或碎裂,甚至在与该含水溶液长时间接触(72-96h)后也不溶解或碎裂。
所述海绵保持与实施例20中描述的海绵的形状记忆性质,甚至在机械应力后保持其结构和弹性。由于本文描述并证实的因素,本申请人旨在要求均具有形状记忆特性的水凝胶和海绵,其由以下构成:通过醚键键合于PEG的伞形酮或苯基乙基酮,以及得到的产物,所述产物还通过酯或酰胺键键合于透明质酸;其还旨在要求所述水凝胶的制备方法,其包括将所述化合物溶液化,随后辐照获得的溶液,及海绵制备方法,其包括将所述起始化合物溶液化,将得到的溶液冷冻干燥,随后进行辐照。水凝胶和海绵均适合用于医学、化妆品和医学护肤品领域,单独使用或与药理学和/或生物学活性物质组合使用,或与细胞组合使用。特别地,均适合用于以下特定的应用:
-骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗,
-活性成分的释放,
-用于医药应用的对象的包衣,
-软组织的填充,
-防止术后粘连,和填充术后的深的形成腔洞的损害。
Claims (19)
1.透明质酸(HA)的光交联的衍生物,其由HA、作为三甘醇的聚乙二醇(PEG)双功能间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物构成。
2.根据权利要求1的衍生物,其中所述香豆素衍生物选自伞形酮、七叶亭、东莨菪亭、补骨脂素类、呋喃并香豆素类化合物和双香豆素,且优选是伞形酮。
3.根据前述权利要求中任意一项的衍生物,其中光反应性的化合物与双功能间隔基之间的键是醚键。
4.根据前述权利要求中任意一项的衍生物,其中双功能间隔基与HA之间的键是酯或酰胺键。
5.根据前述权利要求中任意一项的衍生物,其中HA具有40kDa至700kDa、优选160至220kDa的重量-平均MW。
6.形状记忆水凝胶或形状记忆海绵形式的根据前述权利要求中任意一项的衍生物。
7.根据权利要求6的衍生物,其还包含药理学和/或生物学活性物质、诸如营养因子、抗生素、甾体和非甾体抗炎药、蛋白质、肽、激素、血小板提取物或者分化的和/或未分化的细胞。
8.如权利要求6中所要求的衍生物,其还包含胶原蛋白、优选天然胶原蛋白和/或水解胶原蛋白。
9.包含透明质酸(HA)、作为三甘醇的聚乙二醇(PEG)双功能间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物的可交联的等渗溶液,其中双功能间隔基与HA之间的键是酯或酰胺键,且其中光反应性的化合物与双功能间隔基之间的键是醚键。
10.形状记忆水凝胶形式的根据权利要求1-8中任意一项的衍生物的制备方法,其包括以下步骤:
a.形成三甘醇与香豆素衍生物或苯基乙基酮之间的醚键;
b.形成步骤a)中得到的产物和HA之间的酯或酰胺键,在酯键的情况中HA的最终衍生程度为5至80mol%,在酰胺键的情况中HA的最终衍生程度为1至50mol%;
c.将步骤b)中得到的产物溶液化,并通过波长300至450nm、优选320至380nm的UV光将得到的等渗含水溶液辐照1分钟至24小时。
11.形状记忆海绵形式的根据权利要求1-8中任意一项的衍生物的制备方法,其包括以下步骤:
a.形成三甘醇与香豆素衍生物或苯基乙基酮之间的醚键;
b.形成步骤a)中得到的产物和HA之间的酯或酰胺键,在酯键的情况中HA的最终衍生程度为5至80mol%,在酰胺键的情况中HA的最终衍生程度为1至50mol%;
b')将步骤b)中得到的产物在等渗含水溶液中溶液化,并将由此得到的等渗含水溶液冷冻干燥;
c.通过波长300至450nm、优选320至380nm的UV光将步骤b')中得到的冻干产物辐照1分钟至24小时。
12.如权利要求10-11中任意一项所要求的衍生物的制备方法,其还包括在HA辐照步骤之前添加胶原蛋白的步骤。
13.用于骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗的根据权利要求1-8的形状记忆水凝胶形式的透明质酸的光交联的衍生物。
14.用于活性成分的释放、用于医药应用的对象的包衣、软组织的填充和防止术后粘连的根据权利要求1-8的形状记忆水凝胶形式的透明质酸的光交联的衍生物。
15.用于填充术后的深的形成腔洞的损害的如权利要求1-8中所要求的形状记忆水凝胶形式的透明质酸的光交联的衍生物。
16.用于骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗的根据权利要求1-8形状记忆海绵形式的透明质酸的光交联的衍生物。
17.用于活性成分的释放、用于医药应用的对象的包衣、软组织的填充和防止术后粘连的根据权利要求1-8的形状记忆海绵形式的透明质酸的光交联的衍生物。
18.用于填充术后的深的形成腔洞的损害的如权利要求1-8中所要求的形状记忆海绵形式的透明质酸的光交联的衍生物。
19.医学装置,其包含至少一种根据权利要求1-8中任意一项的光交联的衍生物。
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