CN104965074A

CN104965074A - 一种免标记胶体金比色法用于银离子的快速检测及检测试剂盒

Info

Publication number: CN104965074A
Application number: CN201510283653.XA
Authority: CN
Inventors: 陈俊华; 周顺桂
Original assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences
Current assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明公开一种免标记胶体金比色法用于银离子的快速检测及检测试剂盒。以富含C碱基的核酸为分子识别元件，当检测体系中有银离子存在时，可与核酸相互作用，形成类似茎环结构形状，从而失去对胶体金的保护作用，在NaCl的作用，胶体金会聚集，颜色变蓝紫色，从而达到检测银离子的目的。本发明具有较高的灵敏度，对银离子的检测限为5nM，检测具有很好的特异性，常见的其他干扰重金属离子对检测不产生影响。本发明以胶体金为信号报告分子，检测结果直接肉眼可见，无需使用任何检测仪器，操作简单，而且不用任何标记，成本低廉，适于现场快速检测。

Description

一种免标记胶体金比色法用于银离子的快速检测及检测试剂盒

技术领域

本发明属于环境污染物快速检测领域，涉及一种免标记胶体金比色法用于银离子的快速检测及检测试剂盒。

背景技术

银离子（Ag⁺）是一类普遍存在的环境污染源，严重危害生态环境安全和人体健康。Ag⁺能在人体的皮肤、眼睛以及粘膜等处聚集，进入人体后能与巯基酶结合，抑制含巯基类酶的活性，同时还能与胺、咪唑、羧酸等多种生理代谢产物相互作用，从而导致各种疾病，以及过量的Ag⁺会引发肺癌、列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等。传统的的Ag⁺检测方法主要有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子荧光光谱法、电化学分析方法等，这些方法需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，需要经验丰富的操作人员难以实现大批量样本的现场快速分析。

Ag⁺能与核酸序列中的2个胞嘧啶碱基（C）形成C-Ag⁺-C复合物，利用这一特点可设计富含C碱基的核酸序列，以该核酸序列为分子识别元件，可特异性检测Ag⁺。目前报道的以富含C碱基的核酸序列来检测Ag⁺的技术大多需要标记，成本较高，操作复杂；而且这些技术需要使用检测仪器，限制了它们的广泛应用。因此，迫切需要建立一种无须标记的Ag⁺检测技术，并使检测过程无需检测仪器，检测结果直接肉眼可见，方便现场快速检测。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于建立一种免标记可视化的Ag⁺快速检测方法以及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种银离子的快速检测方法，包括如下步骤：

（1）以富含C碱基的核酸序列为分子识别元件，加入待检溶液中，混匀；

（2）加入胶体金，混匀；

（3）加入NaCl，混匀；

（4）观察颜色变化，当溶液颜色变成紫蓝色，表明溶液中有Ag⁺存在。

作为方案1：所述富含C碱基的核酸序列在有Ag⁺存在时，首尾两段通过C-Ag⁺-C作用，使该单链核酸序列本身互补，形成茎环结构。

作为其中一个案例，所述富含C碱基的核酸序列如下所示：

5′-CCCAGCCCAGACCCAAAAAACCCTCTCCCCTCCC-3′（SEQ ID NO.1）。

作为方案2：所述富含C碱基的核酸序列30%以上的碱基为C碱基，在有Ag⁺存在时，两条富含C碱基的核酸序列通过C-Ag⁺-C作用互补形成双链结构。

作为其中一个案例，所述两条富含C碱基的核酸序列如下所示：

5′-ACGTCCCAGCCCAGACCCATAT-3′（SEQ ID NO.2）；

5′-ATATCCCTCTCCCCTCCCACGT-3′（SEQ ID NO.3）。

一种用于快速检测银离子的试剂盒，其包括以下成分：

（1）富含C碱基的核酸序列：

（2）胶体金；

（3）NaCl。

所述富含C碱基的核酸序列如上所示。

所述试剂盒中还包括pH8.0的Tris-醋酸缓冲液。

本发明的有益效果是：

通过胶体金的颜色变化来检测Ag⁺，检测结果直接肉眼可见，无需任何检测仪器，操作简单，适于现场快速检测；无需标记，成本低廉，经济便宜，响应迅速，不需要专业技术人员，无须培训即可推广使用。

附图说明

图1为本发明所述的检测方法的原理图；

图2为对不同浓度的Ag⁺检测的结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1、一种免标记胶体金比色法用于银离子的快速检测试剂盒，包括以下成分：

（1）富含C碱基的核酸序列，如下所示：

5′-CCCAGCCCAGACCCAAAAAACCCTCTCCCCTCCC-3′（SEQ ID NO.1）

（2）胶体金溶液

（3）50 mMTris-醋酸缓冲液(pH 8.0)

（4）10 mMNaCl溶液

2、利用上述试剂盒用于银离子的快速检测，步骤如下：

（1）用50 mMTris-醋酸缓冲液 (pH 8.0) 溶解富含C碱基的核酸序列(10 nM)，再加入不同浓度的Ag⁺，室温反应15分钟。

（2）加入粒径大小约为15 nM的胶体金溶液，充分混匀，室温放置10分钟。

（3）加入10 mM的NaCl溶液，充分混匀，室温反应15分钟，观察颜色变化。

当没有Ag⁺时，单链核酸吸附在胶体金表面，对胶体金具有保护作用，防止NaCl引起的胶体金聚集变蓝。当有Ag⁺时，通过C-Ag⁺-C作用，富含C碱基的核酸序列首尾两端互补，形成茎环结构，从而无法吸附在胶体金表面，失去了对胶体金的保护作用，在NaCl作用下，胶体金聚集，颜色变蓝紫色。通过颜色变化即可达到检测Ag⁺的目的。

3、对不同浓度Ag⁺的检测：

配制Ag⁺标准溶液，浓度分别为5 nM，50nM，100 nM，1 mM和5mM，室温保存。

将不同浓度的Ag⁺溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，5nM的Ag⁺可产生明显的蓝紫色变化，说明其检测限为5nM。随着Ag⁺浓度的增加，蓝紫色强度增加，并逐渐趋于饱和。

4、特异性实验：

配制浓度为1 mM的不同干扰物标准溶液，分别是Hg²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、和Cd²⁺。

将1 mM的不同干扰物标准溶液和50 nMAg⁺标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，1 mM的Hg²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、和Cd²⁺仍然保持红色，对检测不产生影响。只有当加入Ag⁺后才会产生蓝紫色变化，这证明该方法对Ag⁺的检测具有很好的特异性。

实施例2

（1）两条富含C碱基的核酸序列，如下所示：

5′-ACGTCCCAGCCCAGACCCATAT-3′（SEQ ID NO.2）；

5′-ATATCCCTCTCCCCTCCCACGT-3′（SEQ ID NO.3）。

（2）胶体金溶液

（3）50 mMTris-醋酸缓冲液(pH 8.0)

（4）10 mMNaCl溶液

2、利用上述试剂盒用于银离子的快速检测，步骤如下：

当没有Ag⁺时，单链核酸吸附在胶体金表面，对胶体金具有保护作用，防止NaCl引起的胶体金聚集变蓝。当有Ag⁺时，通过C-Ag⁺-C作用，两条富含C碱基的核酸序列通过C-Ag⁺-C作用互补形成双链结构，从而无法吸附在胶体金表面，失去了对胶体金的保护作用，在NaCl作用下，胶体金聚集，颜色变蓝紫色。通过颜色变化即可达到检测Ag⁺的目的。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东省生态环境与土壤研究所

<120> 一种免标记胶体金比色法用于银离子的快速检测及检测试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccagcccag acccaaaaaa ccctctcccc tccc 34

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atatccctct cccctcccac gt 22

Claims

1.一种银离子的快速检测方法，包括如下步骤：

（2）加入胶体金，混匀；

（3）加入NaCl，混匀；

2.根据权利要求1所述的银离子的快速检测方法，其特征在于，所述富含C碱基的核酸序列在有Ag⁺存在时，首尾两段通过C-Ag⁺-C作用，使该单链核酸序列本身互补，形成茎环结构。

3.根据权利要求1所述的银离子的快速检测方法，其特征在于，所述富含C碱基的核酸序列30%以上的碱基为C碱基，在有Ag⁺存在时，两条富含C碱基的核酸序列通过C-Ag⁺-C作用互补形成双链结构。

4.根据权利要求1-3任一项所述的银离子的快速检测方法，其特征在于，所述富含C碱基的核酸序列如下所示：

5′-CCCAGCCCAGACCCAAAAAACCCTCTCCCCTCCC-3′（SEQ ID NO.1）。

5.根据权利要求1-3任一项所述的银离子的快速检测方法，其特征在于，所述两条富含C碱基的核酸序列如下所示：

5′-ACGTCCCAGCCCAGACCCATAT-3′（SEQ ID NO.2）；

5′-ATATCCCTCTCCCCTCCCACGT-3′（SEQ ID NO.3）。

6.一种用于快速检测银离子的试剂盒，其包括以下成分：

（1）富含C碱基的核酸序列：

（2）胶体金；

（3）NaCl。

7.根据权利要求6所述的快速检测银离子的试剂盒，其特征在于，所述富含C碱基的核酸序列如权利要求2-5任一项所示。

8.根据权利要求6所述的快速检测银离子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括pH8.0的Tris-醋酸缓冲液。