CN104955493A - 密封剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含凝血酶、纤维蛋白原和脂化的组织因子的组合，以及包含所述组合的密封剂组合物以及它们作为密封剂以及在治疗出血中的用途。本发明的组合和组合物表现出提高的止血性质，同时，所形成的凝块的性质是一致的，使得密封剂效率优于现有技术的密封剂组合物。

Description

密封剂组合物
本发明涉及密封剂组合物领域。
背景技术
在损伤后，被触发来止住出血的一系列生理机制被称为止血。止血是非常复杂的过程，其涉及多种分子和细胞类型。为了便于研究，止血可被再分为四个重叠的步骤：i)血管收缩，ii)伤口区域中的最***小板栓的形成，iii)形成纤维蛋白抵抗凝块(凝血级联)和iv)凝块溶解步骤或纤维蛋白溶解，伤口愈合过程从该步骤开始。
通过在血浆中处于溶解的和无活性的形式的因子VII(FVII)与它的被称为组织因子(下文也称为“TF”)的特异性受体的相互作用来启动凝血级联的外源通路。在它的天然形式中，TF主要位于围绕血管的多种细胞类型的表面上。因此，在正常条件下，当发生损伤或伤口时，它与血浆分子特有地接触。血管破裂后，凝血级联由TF与FVII的相联而启动，触发多种凝血因子之间随后的相互作用。最终结果是形成凝血酶(FIIa)，凝血酶(FIIa)随后将在血浆中丰度很高的纤维蛋白原(FI)转化为纤维蛋白纤维。这些纤维蛋白纤维是不溶的，并且形成网，其与血小板一起，导致被称为纤维蛋白凝块的形成。
如果发生大量出血，出于促进快速止血的目的，各种各样的方法已经使用了几个世纪，如直接按压、纱布包扎、缝合线和止血带。尽管这些技术是有效的，但它们被称为“非主动”止血手段，并且当与不同类型的敷料使用时帮助止血过程。
为了试图提高外科止血效果，过去几十年期间，在开发含有“活性”成分的新产品上已经作出大量的努力，除了传统技术之外，这样的“活性”成分可帮助提高止血。在这方面，组织胶或纤维蛋白密封剂(后文也称为FS)代表快速发展的止血/粘合剂产品行业的新策略。使用FS密封伤口边缘的概念是一种相对新的理念。事实上，FDA在1998年批准第一次认可的FS(Tisseel,Baxter)的使用。自从那时起，商业化制备的纤维蛋白密封剂，如Tiseel(Immuno，Vienna，Austria)、Beriplast(BehringwerkeAG)、Tissucol(Baxter)和Biocol(CRTS)已经在全世界广泛地使用了近15年。
FS有许多的外科应用，并且主要由FI、FIIa、氯化钙组成，偶尔包含激活因子XIII(FXIIIa)。在一些制剂或在选定的适应症中，包括抗纤维蛋白溶解剂(抑肽酶，氨甲环酸)，以阻止凝块的溶解。FS被设计为模拟凝血级联的最后阶段，在该阶段期间，由于FIIa的催化作用，FI被转化为纤维蛋白。所形成的纤维蛋白纤维与血小板紧密联合，并且引起纤维蛋白凝块的形成。在这种相互作用中，FXIIIa发挥重要作用，因为它的存在允许产生的纤维蛋白网的排列，以取得在抗性和弹性方面最佳的结构构象。
FS提供的FI和FIIa的浓度大大高于它们在血液中自然存在的浓度，从而允许快速形成固体凝块。因此，它们的聚合与其他血液组分无关，并且甚至在不存在血液时工作地最好。
因为FI和FIIa的聚合是非常快的(少于5秒)，两种组分应该保存在分开的小瓶中直至它们使用。因此，市售FS呈现为两个独立的注射器中，其内容物在施用的位置混合。
FS的作用机制通过在施用位置产生坚固的凝块作为密封屏障来支持。FS被指示为用于发生体液(如血液、胆汁等等)流失的伤口区域上。它们也可用于预防肺部伤口中的空气泄漏。除了它们作为密封剂的功能外，FS能用在不同的医学应用中，如：i)用于伤口愈合的基质，ii)用于组织粘附的基底和iii)药物递送。
本领域公知的是，密封剂组合物必须是双重的，表现出止血和密封活性。
与双重分离组分(FIIa和FI)组成的传统FS相比，WO97/29792描述了无FIIa的单组分密封剂组合物FI。TF和FI的组合不诱导形成稳定的凝块。因此，除了TF和FI外，需要数种凝血因子。该文件公开了需要包括FII、FV、FVII、FX和FXIII以诱导凝块。因此，为了有效，WO97/29792中所描述的密封剂组合物施用于健康血液，或可选地也应该含有缺失的生理浓度的凝血因子(FII、FV、FVII、FX和FXIII)。
因此，尽管已做出努力，仍需要能有效地阻止液体迁移出或迁移进组织中的另外的组合物，表现出合适的止血和密封活性。
发明概述
本发明的发明人发现，通过将脂化TF加入到已知的包含凝血酶和纤维蛋白原的FS组合物中，在止血特性上存在明显改善。此外，由本发明的组合的应用产生的凝块表现出较高的均一性，指示它在密封出血伤口/损伤中的功效。这意味着至少包含凝血酶、纤维蛋白原和脂化TF的组合是有前景的密封剂组合物，其克服/改善了已知FS组合物的止血/密封的双重功效。
止血特性的明显改善主要由于凝块组合在它的施用位置附近的蔓延能力。蔓延作用极其重要，这不仅在健康血液中，而且在关键止血组分(如FIIa和FX)的活性受损的血液中，止血组分的受损可由外科手术中广泛使用的某些药物的施用造成，如肝素。出人意料地，用本发明的组合所观察到的凝块蔓延克服了用肝素处理过的血液的抗凝血阶段。
公开密封剂组合物的现有技术文献中，没有一篇描述它们基于凝块向它的施用位置附近范围蔓延能力的功效。
这意味着至少包含凝血酶(FIIa)、纤维蛋白原(FI)和脂化TF的组合是有前景的密封剂组合物，其克服/提高已知FS组合物的止血/密封双重功效。
因此，一方面，本发明提供包含脂化的组织因子、凝血酶和纤维蛋白原的组合。
图1(A)中显示，当脂化的组织因子加入到市售的密封剂组合物(包含凝血酶和纤维蛋白原)中时，血浆中所诱导的凝结(通过在施用位置3cm外的距离，健康血浆中凝块的蔓延)发生的时间明显低于当只使用时所需的时间。事实上，如由数据得到的，当用本发明的组合的凝结为约50％时(黑色三角形)，现有技术的组合(灰色正方形)刚开始凝结血浆样品。值得注意的是并且本文中首次描述，这种差异在较低治疗剂量的肝素处理血浆的情况中更明显(图1B)，并且当使用较高治疗剂量的肝素时，差异最大(图1C)。在后者的情况中，FS施用后7min时，肝素处理的血浆甚至不开始凝固。因此，通过将脂化的TF加入到包含FIIa和FI的FS中，实现止血性质上的明显改善。
这意味着施用本发明所描述的组合，止住出血需要的时间更少。如果发生在肝素治疗的患者，这是种相关性更为特别，在肝素治疗的患者中，用凝血酶或其他止血产品按压不能足够有效的止住出血，存在患者死亡的高风险。
此外，发明人发现包含纤维蛋白原、凝血酶和组织因子的组合表现出意想不到的密封剂效果。如下面所解释的，实施例4中，包含凝血酶、脂化的组织因子和纤维蛋白原的组合，当施用于肝素化的血浆样品中时，扩散穿过血浆样品的速度明显快于不包括脂化TF的密封剂组合。此外，已观察到，用包括组织因子、凝血酶和纤维蛋白原的组合所获得的凝块比用(即，不包括脂化的组织因子)所获得的凝块有更高的均一性。在不受理论束缚的情况下，发明人认为，组织因子嵌入所形成的纤维蛋白网(由于组合中包括凝血酶和纤维蛋白原)中，并且由于组织因子在纤维蛋白网内的这种分布，发生凝块的扩张效应，引起损伤或损害的有效密封。用本发明的组合所获得的凝块相对于用所获得的凝块显示出较好的均一性的事实意味着本发明的组合在预防血液迁移中更有效，在密封损伤/伤口中更有效，大大降低了凝块破裂的风险。
值得注意的是，由本发明的三重组合物所形成的凝块在正常的和肝素处理的血浆中的扩散不能由WO97/29792的教导预期到。具体而言，该文献公开了包括促凝血酶原激酶的无凝血酶的密封剂组合物。该文献在第6页6-8行中指出包含促凝血酶原激酶作为纤维蛋白凝块形成的引发剂可改善粘合剂的止血性质。然而，实施例II(也在表VI中总结)中提供的实验数据显示，止血所需的时间与现有技术组织粘合剂所需的时间基本上相同或更长。其意味着它是与现有技术组合物等同或更差的止血剂。因此，WO97/29792中提供的实验数据不会促使本领域技术人员有动机将脂化的组织因子加入到包含凝血酶和纤维蛋白原的组合物中以获得具有改善的止血性质的密封组合物。相反，从该文献的教导中，技术人员不会预期到加入促凝血酶原激酶的组合物的止血效果发生任何明显的改善。
为了确定当脂化的组织因子加入到无凝血酶的密封剂组合物中时脂化的组织因子的效果，本发明的发明人已尝试复制WO97/29792的技术方案。如下面表I中所总结的，当与一些商业的密封剂组合物的MCF和G值相比时，WO97/29792的组合物显示非常低的MCF和G值。如本领域技术人员所知，G和MCF值越高，组合物具有越好的止血和密封剂性能。因此，从下面表I所总结的结果中，技术人员所得出的结论会是，脂化的组织因子引入到无凝血酶的密封剂组合物，如WO97/29792中所公开的，不会改善这种组合物的止血特性。
最后，WO97/29792未提到加入脂化的组织因子对凝血酶密封剂组合物的密封剂特性的效果。
总之，从WO97/29792中，技术人员不会有动机将脂化的组织因子加入到密封剂组合物中并预期实现止血和密封剂特性的明显改善。
令人意想不到的是，如上文所述，本发明的发明人已经发现在包含凝血酶和纤维蛋白原的组合物中包括脂化的组织因子能实现止血和密封剂特性的明显改善。
因此，由于包含凝血酶、纤维蛋白原和脂化的组织因子的组合的极好的止血和密封剂性质，这种组合可用来与合适的载体材料一起配制密封剂组合物。
因此，第二方面，本发明提供了密封剂组合物，其包含如本发明的第一方面的组合和材料载体。
第三方面，本发明提供了本发明的第一方面的组合作为密封剂的用途。
由于本发明的组合和密封剂组合物的性质，它们能以药学或兽医学组合物的形式使用。
因此，第四方面，本发明提供了药学或兽医学组合物，其包含治疗有效量的如上所述的组合以及其他合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
如上所讨论的，本发明的组合和组合物，由于它的止血和密封剂效果，在治疗出血中是有用的。
因此，第五方面，本发明提供了用作药物的如上所述的组合或组合物。该方面可制定为治疗疾病的方法，包括对有需要的个体施用治疗有效量如上所述的组合或组合物以及其他合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
第六方面，本发明提供了用于治疗出血的如上所述的组合或组合物。
该方面可选地制定为如上所述的组合或组合物在制备用于治疗出血的药物的用途。该方面可选地制定为用于治疗出血的方法，该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的本发明的组合或组合物。
市售的FS在一些外科手术环境中作为粘合剂或密封剂的使用频率已经开启了它们作为载体用于缓慢释放相关药物的可能性。
在此方面，已经测试了一些含有抗生素的FS降低手术后的眼部感染，并且用于治疗局部的腹膜感染。已经发现，这种组合物提高活性物质的治疗效果，由于它们保留附着在位置上的时间延长。因此，含有其他活性分子(如抗生素、生长因子、化疗剂、局部***或基于DNA的载体)的包含凝血酶、纤维蛋白原和脂化TF的本发明的组合和组合物能提供增强的治疗效果。
因此，又一方面，本发明提供本发明的组合或组合物作为药物递送***的用途。
本领域的现有技术也已经描述了FS帮助皮肤、软骨和骨骼构建的用途。因此，所提议的FS加脂化TF的组合也能用作改善的支架用于细胞附着和新组织生长。这种潜能通过TF公知的血管生成的作用被放大。
因此，又一方面，本发明提供了本发明的组合或组合物作为伤口愈合剂的用途。
最后，本发明的组合或本发明的第二和第三方面的任何组合物可作为试剂盒提供。
因此，又一方面，本发明提供了试剂盒，其包含本发明的第一方面的组合和施用器，施用器允许纤维蛋白原、凝血酶和脂化的组织因子的同时施用。
附图简要描述
图1显示在正常的血浆中(A)或在肝素处理的血浆(B和C)中添加商标名的市售FS组合物(灰色正方形)或脂化的TF和的组合(黑色三角形)后不同的时间下的凝结进程。凝结距测试物的施用位置3cm确定。Y轴＝凝血％；X轴＝时间(A为秒，B和C为分钟)。
图2代表对应于不同产品(FS)，+脂化TF和对照(未处理)处理组的每只大鼠的失血量(mL/Kg)。每个点(三角形或正方形)代表单只动物的失血量值，并且每条水平线代表每组的平均值。
发明详细描述
如上文所述，本发明的组合含有凝血酶，纤维蛋白原和脂化的组织因子。
在本发明中，术语“组织因子(TF)”应被理解为整体的膜糖蛋白，其广泛地分布在动物界。TF出现在不同的细胞类型中，主要在内皮下组织中，并且是凝血级联的外源通路的启动所必需的，导致产生FIIa并且形成稳定的纤维蛋白凝块。可用在本发明中的示例性的TF蛋白包括人TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 148,2012年11月,登录号P13726)、小鼠TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 103,2012年11月,登录号P20352)、牛TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 89,2012年11月,登录号P30931)、兔TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 90,2012年11月,登录号P24055)和不同动物的TF蛋白。
SwissProt登录号P13726的人TF蛋白有定义明确的结构域结构，其包含(1)信号肽或具有32个氨基酸前导序列的区域，前导序列从不成熟到成熟的形式翻译后加工；(2)包含219个氨基酸的N-糖基化的亲水胞外结构域；(3)23个氨基酸的高度疏水片段，其形成跨膜结构域；和(4)21个氨基酸羧基端，其是蛋白细胞质片段。
在具体实施方案中，TF对应于成熟TF。
本文所用的术语“成熟TF”指氨基酸序列缺乏信号肽的TF蛋白。在一个实施方案中，所述成熟TF蛋白是SEQ ID NO：1的成熟人TF。在一个实施方案中，TF是糖基化的。
本文所用的术语“糖基化的”包括任何程度的糖基化。因为天然TF含有一些糖基化位点，如下面详细解释的，表述“组织因子”也包含表现出不同程度糖基化的那些蛋白形式，所述形式通过能够实施N-糖基化反应的宿主中表达TF来获得。
此外，术语“组织因子”也包括在天然TF序列中一个或多个氨基酸残基的***、缺失或取代所产生的那些变体。可用于评价给定的多肽是否是TF功能变体的合适的功能试验是基于测定TF变体特异性结合FVIIa能力或基于体外测定血浆或全血中凝结时间的那些试验，通过一些出血动物模型的体内试验或致死性出血动物模型的体内试验。实施这些试验的方法已经在现有技术中公开。
根据本发明的这种变体包括与上面提及的天然TF分子至少60％、70％、80％、90％、95％或96％相同的氨基酸序列。本领域已知，两个蛋白之间的“同一性”是通过将一种蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代与第二种蛋白的序列相比较来确定。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法来确定两种蛋白之间同一性的程度。两种氨基酸序列之间的同一性优选地通过使用BLASTP算法确定。
TF可以是完全糖基化，部分糖基化或非糖基化的。
在本申请中，“完全糖基化”指全部可能的糖基化位点已被糖基化。
在本申请中，“部分糖基化”指三个N-糖基化位点中至少一个是无功能的，它的糖基化是不可能的。
在本申请中，“非糖基化”指N-糖基化位点中没有一个是功能性的，或可选地，TF多肽通过体外非糖基化的方法(即，无细胞表达***)或在失去代谢糖基化途径的载体(即，大肠杆菌)中表达。
在一个实施方案中，TF是部分糖基化的或非糖基化的。在该实施方案中，TF按照这样的方式被修饰，至少一个N-糖基化位点是无功能的，它的糖基化是不可能的。
所有成熟TF蛋白含有三个可能的N-连接糖基化位点，具有共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr。以人成熟TF为例，这三个糖基化位点位于Asn11(序列Asn11-Leu12-Thr13)，Asn124(序列Asn124-Val125-Thr126)和Asn137(序列Asn137-Asn138-Thr139)上，位置是相对于SEQ ID NO：1而言。
在一个实施方案中，人成熟TF蛋白中的N-糖基化位点可被修饰使得它们成为无功能的位点是对应于上文序列SEQ ID NO：1的成熟人TF中在位置11-13上的N-糖基化位点NLT，位置124-126上的NVT和位置137-139上的NNT。
在另一实施方案中，TF携带一个或多个Asn残基向不是N-糖基化的接受体的残基的取代。在一个更优选的实施方案中，TF变体包含在Asn残基位置上一个或多个Asn到Ala的突变，残基位置对应于成熟人TF中位置11，124或137。优选地，成熟人TF携带在SEQ ID NO：1的位置124上Asn到Ala的突变。
糖基化将根据用于生成TF的表达***变化。比如，组织因子蛋白可包括一种或多种植物特异多糖、酵母特异多糖、昆虫特异多糖或动物特异多糖。
当TF在酵母中生成时，糖基化通常涉及约10个甘露糖残基的内部核心和50-100个甘露糖残基的分支外链，内部核心通过两个GlcNAc残基连接天冬氨酸。因此，N-连接的糖基化可潜在地将多达300个甘露糖残基加到TF上，分子量增加约60kDa。此外，也可能的是，一些甘露糖残基可连接到不同的O-连接糖基化位点上(多于25个)。因此，包括在本发明的组合和组合物中的TF分子具有一个或多个N-糖基化位点中N-连接的糖基化的可变的程度和组成。
在另一实施方案中，TF蛋白是融合蛋白，所述融合蛋白包含第一部分和第二部分，第一部分包含所述TF蛋白，第二部分包含另一肽或蛋白。
所述第二部分可结合到所述TF蛋白片段的第一部分N-端，或可选地，所述第二部分可结合到所述TF蛋白片段的C端区域。第一部分和第二部分均可直接地结合或通过所述第一和第二区域之间的连接多肽结合。
在另一实施方案中，所述第二部分是标签。标签能结合到TF蛋白第一部分的C-端或N-端结构域。在本发明中，术语“标签”应被理解为结合到所述TF蛋白的C-端或N-端结构域的任何肽或氨基酸序列，其能用于分离或纯化融合蛋白。因此，所述标签能够结合一个或多个配体，例如，如高亲和力的色谱分析载体或珠子的亲和基质的一个或多个配体。所述标签的实例是组氨酸标签(His标签或HT)，如包含6个组氨酸残基的标签(His6或H6)，其能以高亲和力结合镍柱(Ni2+)或钴柱(Co2+)上。用于分离或纯化融合蛋白的标签的其他示例性、非限制性的实例包括Arg标签、FLAG标签、Strep标签、能够被抗体识别的表位：如c-myc标签(能被抗c-myc抗体识别)、SBP标签、S标签，钙素蛋白结合肽，纤维素结合结构域、几丁质结合结构域，谷胱甘肽S-转移酶标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi标签等，如Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO:2)、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO:3)、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列、β-半乳糖苷酶等等。
之前已公开，用于分离或纯化重组TF的His标签具有理想的特征，其能在大多数蛋白变性并且大多数蛋白-蛋白的相互作用破坏的条件下结合它的配体。因此，它能用来在引诱蛋白参与蛋白-蛋白相互作用的破坏后去除标记有H6的引诱蛋白，。
因此，在一个实施方案中，标签是His标签。在另一实施方案中，所述His标签结合TF蛋白第一部分的C端结构域。在另一实施方案中，所述His标签结合TF蛋白第一部分的N端结构域。
在另一实施方案中，融合蛋白的第一部分包含成熟TF蛋白，优选地，包含成熟人TF蛋白。在另一实施方案中，第一部分是人成熟TF。
在另一实施方案中，融合蛋白具有第一部分和第二部分，第一部分包含至少一个N-糖基化位点无功能的成熟人组织因子蛋白，第二部分包含His标签。在优选的实施方案中，组织因子是包含SEQ ID NO:5的人TF的融合蛋白，其(a)缺少信号序列，(b)在糖基化位点上具有N124A突变，(c)在C端具有6个组氨酸标签。
所述融合蛋白可通过常规手段获得，例如，通过在合适的酵母细胞中编码所述融合蛋白的核苷酸序列的基因表达的方法。如果需要，最终的标签可用于分离或纯化的所述融合蛋白。
本文所用的术语“脂化的组织因子(TF)”指任何来源的TF，该TF完全地或部分地***到脂质的囊泡或细胞膜中。“脂化的TF”来源的示例性、非限制性的实例为：1)含有组织提取物的脂化的TF(它的分离可从一些组织中实施，如脑，胎盘和肺组织，来自不同的动物的组织，如羊、牛、兔、狗和人等)；2)纯化的和(再)脂化的TF蛋白质组分，即，TF纯化后，加入脂质组分(磷脂质)的蛋白质组分；和3)包含细胞提取物的脂化的TF，其中脂类部分来自宿主细胞并且TF被重组表达。
作为示例性的、非限制性的实例，纯化的和(再)脂化的TF可根据Mimms L.T.et al.,“Phospholipid vesicle formation and transmembraneprotein incorporation using octyl glucoside”,Biochemistry,1981，vol.20(4),p.833-840中所描述的方案来制备。在所述方案中，使用如N-辛基-β-D-半乳吡喃糖苷的非离子型去污剂将非脂化TF并入磷脂囊泡中。用于根据本发明的脂化TF的磷脂可有任何的来源(动物，植物或合成的)。几乎任何磷脂都能用于制备本发明的脂化TF。能用于制备脂化TF的磷脂的示例性的、非限制性的实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺等等。TF蛋白质组分：磷脂比例(摩尔、重量或体积)可在大范围内变化，例如，从约1:50000-约1:3000。在具体的实施方案中，脂化TF是脂化人TF，并且由从人组织或从重组细胞中分离并且以合适的TF蛋白质组分：磷脂比例***到脂质膜中的TF的蛋白质组分组成。实现最佳的TF活性的脂质组分(优选磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸)的优选摩尔比是本领域技术所知的。
关于制备含有细胞提取物的脂化TF，其中脂质部分来自宿主细胞并且TF已经被重组表达，因为TF分子含有大的疏水结构域，合理的假设是任何可用的真核表达***中rTF基因的克隆将导致表达或与宿主细胞脂质膜相关的重组TF(rTF)蛋白。在该关联中，可能的是，宿主膜组分为rTF分子模拟或提供与哺乳细胞中发现的那些与TF正常地关联的支架相似或相同的支架。因此，这些膜组分的纯化将导致可用的脂化rTF的来源。由于它的化学构成，这些分离的脂质膜组分将主要地以不同大小的囊泡的形式存在。除了rTF外，这些囊泡也含有具体的蛋白或脂质，其取决于宿主细胞的来源。因此，来自酵母、细菌、不同来源的细胞(如昆虫、哺乳动物、植物、鱼、藻类)的脂质膜也含有这些宿主细胞的蛋白和脂质特性。
TF包含疏水区域(跨膜结构域)，其锚定于脂质膜中，然而其亲水区域(即，所述TF蛋白的氨基端区域和羧基端区域)朝向膜的外质侧。
在本发明中，术语“脂质膜”应被理解为形成细胞边界(即，细胞膜或质膜)或胞内细胞器的边界的一些分子(脂质和蛋白)厚的有组织的层。通常，膜由两层定向的脂质组成，蛋白可嵌入其中。脂质双层，其是细胞膜的基本结构，通常由两亲分子(如磷脂，脂肪酸等等)在水性环境中形成，每个分子由层外部的亲水基团和层内部的疏水基团进行定向。优选地，TF锚定在脂质微泡中。
在本发明中，“脂质微泡”应被理解为小的和封闭的室，其基本上由脂质单层或双层组成。本发明中的携带TF的微泡的尺寸能在相对宽的范围内变化，通常，尺寸等于或小于10μm，典型地等于或小于0.5μm。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源微泡的尺寸的范围为10-0.01μm。微泡由来自真核细胞的质膜或其片段组成。在一个实施方案中，微泡可富集带负电的磷脂，优选为磷脂酰丝氨酸。用于富集这种磷脂酰丝氨酸的微泡的方法已公开，比如，在WO2011131658中。简要地，富集磷脂的携带TF的微泡可通过以下方法制备，其包括：a)在允许表达TF蛋白或具有促凝活性的TF蛋白片段的条件下，将表达TF蛋白的重组真核细胞的培养物进行发酵；b)使从步骤a)发酵中产生的培养细胞离心，以得到发酵产物；c)将来自步骤b)的发酵产物匀浆，以得到发酵匀浆产物；和d)将来自步骤c)的发酵匀浆产物进行分离，以得到沉淀和澄清的酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物含有携带TF的来源微泡，其具有促凝活性；e)收集澄清的酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物含有携带TF的酵母来源微泡，其具有促凝活性；并且，任选地，f)如果需要，通过尺寸分离方法分离或纯化具有促凝活性的携带TF的酵母来源微泡，并且g)按照WO2011131658中所描述的，通过将组分磷脂酰丝氨酸和含有TF的脂质微泡孵育，使获得的微泡富集带负电的磷脂(即，磷脂酰丝氨酸)。如之前提到的孵育步骤，磷脂酰丝氨酸可通过重悬缓冲溶液中的脂质随后通过超声处理制备为多层囊泡。
生成TF的方法取决于所用的真核细胞。一般地，用包含编码TF蛋白的核苷酸序列的表达载体转化真核细胞，所述核苷酸序列可操作地连接于细胞中的功能性的启动子，细胞可来自：真菌、酵母、植物或动物(如鱼、爬虫类、哺乳类、昆虫等等)。编码TF蛋白的cDNA可通过使用cDNA文库为模板以及合适的引物的聚合酶链式反应(PCR)扩增。实施例1公开了编码3’端有18个额外核苷酸(编码6个组氨酸)的成熟hTF蛋白的cDNA的扩增。
在另一实施方案中，TF蛋白可遵循完善的色谱纯化的方法从上面的步骤a)到d)纯化。一旦纯化，TF蛋白可用最佳的磷脂浓度在体外脂化。
在另一实施方案中，脂化的TF可从动物组织提取物中获得，如脑、胎盘和肺组织，组织来自不同动物，如羊、牛、兔、狗和人等等。优选地，脂化的TF来自人。更优选地，脂化的TF是人重组体。
在本发明中，术语“凝血酶(FIIa)”应被理解为在止血中发挥关键作用的关键丝氨酸蛋白酶。FIIa激活许多涉及凝血级联的凝血因子，包括纤维蛋白原(FI)、因子V(FV)、因子VIII(FVIII)、因子XI(FXI)和因子XIII(FXIII)。FIIa也激活血小板和血管内皮细胞。凝血酶的前体为凝血素酶原(FII)，其从肝中分泌到血液中。凝血级联期间，FII以不同的速率转化为FIIa，首先通过激活的FX(FXa)，并且在级联的最后步骤通过凝血素复合物(FXa:FVa)。分离来自人或牛来源的血浆中的FII后产生商业的FIIa。它的分离后，FII体外转化为FIIa。所有目前市售的FS含有来自人或牛来源的FIIa。此外，高度纯化的重组人FIIa也是可获得的。纯化来自重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的人FII后，通过体外方法加工为FIIa后获得该重组人FIIa。
可用在本发明中的示例性的FII蛋白包括人FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 182,2012年11月,登录号P00734)、牛FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 153,2012年11月,登录号P00735)、鼠FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 141,2012年11月,登录号P19221)、猪FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 37,2012年11月.登录号B3STX9)以及不同动物的FII蛋白。优选地，凝血酶来自人或牛来源，但是更优选地是人凝血酶，并且甚至更优选为重组人凝血酶。
在本发明中，术语“纤维蛋白原(FI)”对应于止血中的倒数第二种蛋白。FI表现出复杂的结构，因为它由两条α(66kDa)，两条β(52kDa)和两条γ(46.5kDa)链组成，通过29个二硫键结合在一起。FI在肝脏中合成，并且在血浆中以2-4mg/mL浓度循环。凝血级联的最后阶段期间，通过FIIa使FI激活为纤维蛋白。纤维蛋白聚集形成交联的纤维网，其与血小板协作形成凝块。目前的FS含有血浆来源的纤维蛋白原，其从人血液中纯化。该过程具有病原体污染的相关风险。这些风险可通过产生重组形式的人纤维蛋白原被最小化。重组人FI已经在大肠杆菌、幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾(COS-1)细胞和CHO细胞中产生。最近，人FI已经在转基因牛中产生，从转基因牛中，重组FI从牛奶中获得。
可用在本发明中的示例性的FI蛋白包括人FI：α链(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 174,2012年11月,登录号P02671)、β链(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 163,2012年11月,登录号P02675)、γ链(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 171,2012年11月,登录号P02679)；牛FI：α链(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 104,2012年11月,登录号P02672)、β链(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 102,2012年11月,登录号P02676)和不同动物的FI蛋白。优选地，包括在本发明中的组合中的纤维蛋白原为人来源的纤维蛋白原，并且更优选为重组人FI。
在本发明的第一方面的一个实施方案中，组合还包含交联剂。
在本发明的第一方面的另一实施方案中，组合还包含纤维蛋白溶解抑制剂。
在本发明的第一方面的另一实施方案中，组合还包含CaCl2。
在本发明的第一方面的又一实施方案中，组合还包含交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。
在本发明的第一方面的又一实施方案中，组合还包含交联剂，纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl2。
优选地，交联剂是FXIII。
优选地，纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶，氯甲环酸和氨基己酸。
又一方面，本发明提供止血密封剂组合物，其包含本发明的组合和载体材料。
在本发明中，涉及组合物、效果和用途的术语“止血剂”应被理解为促进止血的物质，即，停止出血的物质。其也被称为“抗出血药”和“促凝血剂”。
术语“载体材料”应被理解为允许本发明的组合沉积在其上，本发明的组合的转运并释放在预期的位置(例如，本发明的组合物需要发挥它的治疗效果的位置)的合适的材料的基底。载体材料可为固体载体或非固体载体，例如，液体载体，粉末载体或气体载体。固体载体的示例性的、非限制性的实例包括敷料、创可贴、敷布、膏药等等。液体载体的示例性的、非限制性的实例包括凝胶、喷雾剂、漱口水等等。气体载体的示例性的、非限制性的实例包括气体、推进剂等等。这种组合物的制备可通过传统方法获得，例如，通过将本发明的组合和材料载体混合。组合的组分和固体材料之间的相互作用可为物理的或化学的相互作用。
在一个实施方案中，材料载体是由胶原，明胶或氧化的再生纤维组成的固体载体。
在另一实施方案中，载体材料是喷雾，气溶胶或用于分散粉末的设备。
在本发明的第二方面的一个实施方案中，密封剂组合物还包含交联剂。
在本发明的第二方面的又一个实施方案中，密封剂组合物还包含纤维蛋白溶解抑制剂。
在本发明的第二方面的又一个实施方案中，密封剂组合物还包含CaCl2。
在本发明的第二方面的又一个实施方案中，密封剂组合物还包含交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。
在本发明的第二方面的又一个实施方案中，密封剂组合物还包含交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl2。
优选地，交联剂为FXIII。
优选地，纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶，氯甲环酸和氨基己酸。
如上文所述，又一方面，本发明提供药学或兽医学组合物，其包含治疗有效量的本发明的组合以及合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
本文所用的表述“治疗有效量”，指当施用时，组合的量足够阻止一种或多种被治疗的疾病的症状的发展，或在一定程度上减轻一种或多种被治疗的疾病的症状。施用根据本发明的组合的具体剂量将当然通过围绕事件的具体情况来确定，其包括施用的化合物、给药途径、被治疗的具体的疾病状态以及相似的考虑。
用于制备这种密封剂组合物的方法是本领域所公知的。
本发明的药学或兽医学组合物应当局部地施用于出血的位置，可直接地施用或在载体材料中施用，如纱布。局部施用的实例包括，但不限于，外部、皮肤、鼻内、囊内、***内、颊、直肠、眼部、内窥镜局部施用和滴注法。优选地，本发明的组合和组合物为局部施用。
药学或兽医学组合物可采取以下形式：软的或硬的凝胶、液体、洗液、乳霜、药膏、糊剂、走珠剂型、喷雾剂、气溶胶、施用垫剂型和成膜剂型。
对于局部给药，合适的药物赋形剂或载体包括，但不限于，保湿剂、润肤剂、乳化剂、湿润剂、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、介质或其混合物。所用的赋形剂或载体对皮肤有亲和性，耐受性好，稳定，并且使用量足以提供预期的均一性，并且易于施用性。
当本发明的药物组合物是局部的时，它可配制为多种形式，包括，但不限于，溶液、洗液、凝胶、药膏、糊剂、乳霜、软的或硬的凝胶、液体、洗液、乳霜、药膏、糊剂、走珠剂型、喷雾剂、气溶胶、施用垫制剂和成膜制剂。这些局部药学组合物可根据本领域公知的方法制备。合适的药物赋形剂和/或载体以及它们的量可通过本领域技术人员根据制备的制剂的类型很容易地确定。
当用传统的外科手段(如缝合，绷带和烧灼)控制出血时，本发明的组合物可用作对进行手术的患者止血的辅助物，以及预防渗漏的标准外科手段(如缝合和绷带)中的辅助物。
又一方面，本发明提供本发明的第四方面的组合作为密封剂的用途。
如上文所述，本发明的组合，由于所产生的凝块的高度均一性并且随着凝块的蔓延扩大，可在非常短的时间内有效地密封任何损伤或损害，它以安全和有效的方式阻止流体的迁移，因为渗漏的风险被大大降低。该施用在密封皮肤、器官和内部创伤后等等的损伤或伤口是感兴趣的。
在一个实施方案中，通过将组织缝合在一起(当可能时)并将上文所述的组合或组合物施用到组织上，使用所述组合或组合物用来密封组织。
在另一实施方案中，通过在将移植物放置在组织上之前将上文所述的组合或组合物施用于组织上，使用所述组合或组合物来将移植物固定到组织上。
由于上文详细指出的性质，本发明的组合和组合物可用作药物递送***或作为伤口愈合剂。
表述“伤口愈合”涉及复杂的过程，其中任何种类并且在任何位置上的损伤伤口愈合后，皮肤(或一些其它器官)自身修复。它可以是正常的和受损的伤口愈合。后者特别发现于疾病的情况中，如糖尿病、血管炎、动脉闭塞性疾病、慢性静脉和/或感染的溃疡以及不良愈合的胃溃疡。受损的伤口愈合也发现于神经分布损伤的情况中(如截瘫、麻风病、神经病变等等)，以及需要护理的患者的褥疮性坏疽。如果手术后发生不牢固的缝合和受损的愈合，特别是肠道以及皮肤和其它器官的移植中，受损的伤口愈合也发生。
受损的伤口愈合也发现于骨折、烧伤和使用类固醇治疗的情况中。
本文所用术语"伤口"包括任何组织的损伤，包括例如，愈合伤口延迟或困难，以及慢性的伤口。伤口的实例可包括开放性和闭合性伤口。术语“伤口”也可包括，例如不同方式(例如来自长期卧床的压疮和由外伤诱导的伤口)引起的和含有不同特性的皮肤和皮下组织的损伤。根据伤口的深度，伤口可被分为四个等级之一：i)等级I：伤口限于上皮；ii)等级II：伤口延伸到真皮；iii)等级III：伤口延伸到皮下组织；和iv)等级IV(全层伤口)伤口，其中骨骼暴露(例如，骨压点，如大转子或骶骨)。
术语“慢性伤口”一般指未愈合的伤口。慢性伤口包括静脉溃疡、静脉淤积性溃疡、动脉溃疡、压力溃疡、糖尿病溃疡、糖尿病足部溃疡、血管炎溃疡、褥疮性溃疡、烧伤溃疡、外伤诱导溃疡、感染溃疡、组合溃疡和坏疽性脓皮病。
本发明的组合和组合物也可用于治疗出血。出血可由于凝血病、损伤、伤口或血小板病症等等。
如下文所示，本发明的组合作为抗出血剂，并且，因此可用来治疗或改正出血病症，特别是与出血性素质相关的那些出血病症。
术语“出血性素质”指引起出血病症的进程，并且其作为结果，导致发生出血综合征，出血综合征可偶然地发生有广泛和大量出血。
术语“凝血病”指凝血因子病症。该病症可能是由于特定的凝血因子的缺乏或不足，或由于凝血因子病症，凝血因子缺乏或不足的结果是将出现出血综合征。凝血病一般地可为先天的凝血病或后天的凝血病。作为先天的凝血病的示例性、非限制性的实例，可被提到的凝血因子的缺乏选自凝血因子V(FV)、凝血因子VII(FVII)，凝血因子VIII(FVIII)(其缺乏或不足引起血友病A)，凝血因子IX(FIX)(其不足或缺乏引起血友病B)，凝血因子X(FX)，凝血因子XI(FXI)(其缺乏或不足引起血友病C)，凝血因子XII(FXII)，凝血因子XIII(FXIII)和它们的组合。后天的凝血病可有不同的来源。示例性的实例包括严重肝衰竭、抗凝血疗法(如肝素、低分子量肝素、华法令、香豆素衍生物、双香豆素等等)中凝血因子合成的缺乏。可选择的机理基于凝血因子的过度消耗以至于它们不可以在出血损害中形成凝块。由于消耗发生在多种疾病中，如损伤微循环内皮、使血小板和凝血因子激活、伴随形成多微血栓的重症脓毒症中、由TF血液入侵如胎盘释放中、死胎的滞留中、破碎组织的多处创伤中、毒蛇咬伤中等等，该机制发生在弥漫性血管内的凝血综合征或凝血病中。在血管炎中，顶骨和内皮损伤释放凝血激活物。由于胞浆素(其是抗血小板药物和抗凝血剂)的作用，通过溶解许多微血栓的纤维蛋白，凝血因子的消耗被加剧。
术语“血小板病症”指血小板数量上和功能性能力上的病症，其结果是发生出血综合征。血小板病症可以是先天的或后天的。在具体实施方案中，血小板病症是先天的血小板病症。先天的血小板病症的示例性、非限制性的实例包括Glanzmann’s病、Bernard Soulier病、Bolin-Jamieson综合征、Wiskott-Aldrich综合征、Paris-Trousseau-Jacobsen综合征、X染色体血小板减少症、灰色血小板综合征、Sebastian综合征和范可尼贫血。在另一具体的实施方案中，血小板病症是后天的血小板病症。后天的血小板病症的示例性、非限制性的实例包括骨髓增殖性疾病，如血小板增多症、红血球增多症、慢性粒细胞白血病等等。在骨髓化生中存在功能性的血小板病症伴随出血时间增加、玻璃珠滞留缺陷症、血小板聚集缺陷症、异常释放和血小板因子III缺陷症。功能性的血小板缺陷症发现于坏血病中的血内蛋白异常，先天性心脏病和肝硬化中。
本发明的第七方面的一个实施方案中，提供了上文所述的组合或组合物通过施用于损伤位置用于在局部治疗出血中使用。
如本文所用的术语“个体”包括任何动物物种成员，包括人类物种；作为示例性、非限制性的实例，个体可为哺乳动物，如灵长类、驯养动物、啮齿动物等等。个体优选任何年龄和种族的男性或女性。在具体实施方案中，个体是没有止血病症历史的人，例如没有凝血病或血小板病症的个体。在另一具体的实施方案中，个体是具有止血病症历史的人，如具有出血性素质的个体，例如凝血病，如先天的或后天的凝血病，或血小板病症，如先天的或后天的血小板病症。
因为TF是公知的促血管生成分子，因此本发明的组合和组合物也能用于治疗与缺乏血管生成相关的疾病中。
本文所用术语“缺乏血管生成相关的疾病”指通过激活血管形成可被治愈的疾病。“血管形成”的表述指任何种类并在任何位置上的血管形成。促进血管形成在多种临床疾病状态中是有用的。例如，在缺血疾病期间或之后，心肌梗塞或冠状动脉架桥手术之后，本发明的组合可用于促进心肌组织中侧支血管的血管生成。可通过提供本发明的组合和组合物来治疗的其它疾病或状态包括引起外周或中枢神经***病变的血管疾病和/或缺血疾病。这种状态/疾病可包括脑血管意外事件，例如，由凝块闭塞或动脉瘤破裂引起的，或大体或局部的缺血，引起神经元死亡或外周功能性损伤，如运动或感知功能或言语功能损伤、缺血性心肌病或外周动脉疾病，如慢性肢体缺血跛行(骨骼肌)、静止痛/缺血溃疡/坏疽。而且，例如，促进血管形成足够替代损伤的老血管。例如，它们可存在于脑或心脏中，以便能预防或治疗中风或梗塞。预防也能针对presbyphrenia。此外，它涉及用于治疗动脉硬化、克罗恩病和溃疡性结肠炎、糖尿病视网膜病变和腿/溃疡的深部静脉血栓形成以及预防复发中的血管形成。
最后，又一方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明的组合和组合物以及施用器。
试剂盒可采取(a)三部分的形式，在这种方式下，每部分含有形成本发明的组合的每种组分，即，试剂盒的一部分含有凝血酶，另一部分含有纤维蛋白原和其他一部分含有脂化的组织因子；或可选择地，采取(b)两部分的形式，在这种方式下，组合的两种组分(凝血酶和脂化的组织因子，或纤维蛋白原和脂化的组织因子)并成一部分，并且第三组分单独地包含在第二部分中。
因此，在一个实施方案中，试剂盒包含：a)包含凝血酶的第一部分；b)包含纤维蛋白原的第二部分；和c)包含重组脂化的组织因子的第三部分；和d)同时施用包括在试剂盒中的全部组分的施用器。
在另一实施方案中，试剂盒包含：a)包含凝血酶和脂化的组织因子的第一部分；b)包含纤维蛋白原的第二部分；c)同时施用试剂盒中所包括的全部组分的施用器。
在另一实施方案中，本发明提供试剂盒包含a)包含凝血酶的部分；b)包含纤维蛋白原和脂化的组织因子的第二部分；和c)同时施用试剂盒中所包括的全部组分的施用器。
在另一实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含含有全部凝血酶、纤维蛋白原和脂化的组织因子的单个部分。
试剂盒中所含的凝血酶、纤维蛋白原和脂化的组织因子可为任何合适的形式，如溶液，悬浮液或粉末，以及合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
此外，试剂盒可包括它在上文提到的任何应用中使用的说明书。
在一个实施方案中，试剂盒还包含交联剂。
在另一实施方案中，试剂盒还包含纤维蛋白溶解抑制剂。
在另一实施方案中，试剂盒还包含CaCl2。
在又一实施方案中，试剂盒还包含交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。
在又一实施方案中，试剂盒包含交联剂，纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl2。
交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl2可包括在上文对于凝血酶，纤维蛋白原和脂化的组织因子指定的任何一部分中，或可选地，每一种可为另外的单独的部分或可共享试剂盒的相同的部分。
任何其他的组分可包括在试剂盒中，只要它对其中所包括的组合的止血和密封剂性质无负面地影响。这些额外的组分可包括在上文关于凝血酶，纤维蛋白原和脂化的组织因子指定的任何一部分中。可选地，试剂盒的每种“额外的组分”可为另外的单独的部分或可共享试剂盒的相同的部分。
优选地，交联剂是FXIII。
优选地，纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶，氯甲环酸和氨基己酸。
允许同时施用试剂盒中所包括的全部组分的施用器的示例性、非限制性的实例为有管的注射器、喷雾施用器、或当它们是粉末时，用于分散组分的设备，等等。
粉末分散设备的实例在WO2010/07033中公开。
在整个说明书和权利要求书中，术语“包含(comprise)”和该术语的变形词不是意图排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。而且，术语“包含(comprise)”包含“由…组成(consisting of)”的情况。根据查阅说明书，本发明的其他目的，优势和特征对本领域技术人员而言是显而易见的，或通过实施本发明能够获知的。以下的实施例和附图以举例说明的方式提供，并且它们不意图限制本发明。涉及附图和权利要求中括号中置入的参考标记仅用于试图增加权利要求的可理解性，并且不应该被理解为限制权利要求的范围。而且，本发明覆盖了本文所描述的具体的和优选的实施方案的所有可能的组合。
实施例
实施例1：基于在酵母中表达全长TF his标签修饰蛋白产生重组组织因子 (后文也称为“TT-173”)
使用WO2008080989的实施例1中所描述的酵母游离型载体pTT-10301，其包含URA3基因、氨苄青霉素抗性基因、酵母2μ复制起点、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子和磷酸甘油酸激酶的酵母转录终止信号，将该载体在GDP启动子的控制下，用于克隆SEQ ID NO：6的cDNA，SEQ ID NO：6编码在3’端有His标签并且有Asn124Ala突变的成熟hTF蛋白(SEQ ID NO:1的33-295氨基酸)，Asn124Ala突变使天然hTF序列(SEQ ID NO：5)中一个可能N-糖基化位点失活。
SEQ ID NO：6的获得过程如下。使用序列SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8引物扩增TF的人cDNA序列(Genbank登录号BC011029，SEQID NO：11)。得到的扩增后DNA序列通过定点突变进一步修饰，使用序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10引物。为了该目的，使用Quick Change定点突变试剂盒(Stratagene)，依照Stratagene手册中所描述的方法。用这种后者的突变，产生含有在TF蛋白序列的氨基酸残基124位上Asn到Ala的点突变的TF序列。
转化后，收集能够在无尿嘧啶的培养基中生长的酵母菌株并且测试它们表达hTF的能力，基本上如WO2008080989中所描述，通过Western印迹分析酵母提取物。简要地，使包含具有修饰形式的TF编码基因(SEQID NO：6)的游离表达质粒的酵母菌在发酵罐中生长，并且通过离心收集得到的细胞。收集的细胞在合适的裂解缓冲液(20mM磷酸盐，50mMNaCl，pH 7.4)中重悬，并且经受高压裂解，其在1000bar的压力下通过均质器三次以获得发酵裂解液(发酵匀浆)。通过将容器浸入冰浴中，细胞悬浮液维持冷却。之后，通过离心的手段从发酵裂解液中去除最重的材料，从而获得澄清的酵母提取物(CYE)上清液。从均质化步骤中获得的CYE用裂解缓冲液稀释，直至总蛋白含量达到5-6mg/mL的浓度，并且分别通过0.45μm，0.2μm和0.1μm的连续滤器过滤以降低无膜宿主细胞衍生蛋白(HCP)的量并且获得rTF囊泡中更均质的材料。
0.1μm的微滤滞留物中的囊泡具有小于0.2μm的直径。为了减少DNA的痕迹，然后用10U/mL的核酸内切酶Benzonase(Merck)和最终浓度1mM的氯化镁处理0.1μm的微滤滞留物，在转速大约20rpm的玻璃容器中4℃孵育12h，并且用于进一步的富集步骤。
为了根据它们的尺寸进一步分离不同的囊泡亚群以及去除不想要的残留细胞材料，将滤过的澄清的酵母提取物施加于Sephacryl尺寸排阻色谱柱。分离后，将对应于rTF富集囊泡的组分2-22合并并且过滤除菌。之后，最终浓度0.1mg/mL的磷脂酰丝氨酸(PS)加入到除菌产物中，并且混合物在室温下维持2h以允许PS合并到囊泡中。作为之前的步骤，PS可制备为多层囊泡，通过在缓冲溶液中重悬脂质随后经过超声处理，依照通过超声处理用于制备磷脂囊泡(SUV)的Morrissey实验室方案。简要地：(1)在玻璃试管(13x 100mm试管是合适的尺寸)中分配2.6μmol的总磷脂(PL)；(2)在通风橱中，在温和的氮气或氩气流下干燥PL混合物。当干燥时，在高度真空下抽真空额外60min(这是为了去除任何残留的氯仿)；(3)向脱水PL加入2.6mL室温的HBS溶液并且用保鲜膜封闭试管的端部。在室温下静置1h；(4)将试管强力涡旋以完全地重悬PL。得到的应该是乳白色的均匀的悬浮液；(5)用室温水填充水浴超声仪，使用环架和试管夹，在水浴中悬浮含有PL悬浮液的试管。试管内的液体水平应该与试管外的液体水平相当。超声处理直至悬浮液在外观上从乳白色变化为几乎清澈(即，仅有轻微的模糊)。每10min检查一次，一般将耗费10到30min的总超声时间(确保不要让水浴过热，并且不能排出水浴水直到它已经完全地冷却)；和(6)在4℃保存最终的产物。得到的是HBS中含有总共1mM的磷脂的小单层囊泡(SUV)的悬浮液。
孵育2小时后，将含有PS富集囊泡的无菌产物分成小份并冻干。该冻干材料对应于下面试验中所用的rTF，并且由锚定于高度富集PS的脂质囊泡上的SEQ ID NO:5的蛋白组成。
实施例2：TF添加到FS中对正常血浆和肝素化血浆中的凝块蔓延的影 响
在本试验中作为参照物使用的FS为一种市售的1mL的含有：500U人凝血酶、115mg纤维蛋白原、抑肽酶3000U和氯化钙40μmol。
通过加入2mL的Tissucol和300ng依照实施例1所获得的脂化TF制成本发明的组合。
为了这些研究，2.5mL的正常血浆(来自5个健康供体的混合血浆)放置在4cm长条上。然后，1mL参照物()或本发明的组合物(+脂化TF)作为测试的密封剂组合物施用在其一端上。
测试物施用后每15s(持续5分钟)，借助分光光度计测定距施用位置3cm的凝结程度。为了该目的，用分光光度计(Biotek)在340nm下测定血浆的光密度。图1显示在每种产品施用后不同的时间下，距施用位置3cm的FS参照物()(灰色正方形)的凝结百分比和本发明的组合(FS+TF)(黑色三角形)的凝结百分比。
如图1所示，FS+TF组合在施用105s后，正常血浆中已经提供了50％的凝结(图1A)。然而，当单独施用FS时，在这个时间点(105s)凝结刚开始。当用肝素()处理血浆、在两个治疗浓度限制：0.5U/mL(图1B)和1U/mL(图1C)进行相似的实验时，这样的差异更显著。
从这些结果可推断出，将脂化的TF添加到包含FIIa和FI的FS中提高了通过凝块的蔓延的止血特性。
实施例3：添加脂化的TF后FS体内止血作用的增强
本实施例实施的试验为由Kemal Karakaya et al在The Journal ofTrauma Injury,Infection,and Critical Care,2000,vol.49(2),p.246-250中所公开的试验。
简要地，52只雄性(HsdHan:WIST,Harlan Interfauna)大鼠(380-400gm)用在本研究中。动物饲养在环境受控的设备中(笼：25x50cm。每笼两只动物)。食物(Global Diet 2014，Harlan Tekland)和水可自由摄取。动物饲养在巴塞罗那大学，生物学学院，生化和分子生物学系，实验动物研究部(CEREMET)。研究方案由来自巴塞罗那大学和加泰罗尼亚自治区政府农业部、食品部和环境部的实验动物伦理委员会(CEEA)批准。批准参号：DAAM 5996。所有动物获得人道护理符合UE动物福利条例的要求。
动物随机地分为三组，接受：无处理(n＝15)，(n＝21)或+依照实施例1所获得的脂化的TF(200ng/mL)(+TF，n＝16)。
肌肉注射100mg/kg***使动物麻醉。实施中线剖腹手术后，用棉海绵擦干腹腔。将一部分的肝脏通过剪刀快速切离。当快速地出血的肝脏表面容易地显现时，对出血的表面不做操作。然后根据随机化原则，用+脂化TF处理切除的表面，或剩下的不处理。之后，允许血液积聚在所有组的腹腔中，并且用小的棉海绵收集血液以避免溢出腹腔。在研究阶段的最后，用小的棉海绵收集腹腔中的流血。总的失血量计算为用于每只动物的浸湿棉海绵的重量减去预称的干的棉海绵的重量。肝脏损伤后，监测动物30min。
如图2所示，当与未处理的动物相比时，(FS)的施用导致失血量降低。然而，相对于单独的FS，脂化TF加入到(FS)中在功效上产生大约50％的增加。
结果的统计学显著性由Newman-Keuls多重比较检验确认，给出以下p值：相比于未处理组：p值<0.001，相比于 +脂化TF：p值<0.01，+脂化TF相比于未处理组：p值<0.001。
实施例4：凝块的均一性
将实施例2中使用的参照物FS和组合各自施用在4cm长条的一端上，长条含有2.5mL肝素()处理血浆。
当施用本发明的组合时，观察到的是，其蔓延穿过长条的速度大大快于参照密封剂。此外，借助于尖端移液管，取出每种组合获得的凝块：商业FS获得的凝块是脆的并且容易破裂，然而由本发明的组合施用产生的凝块不是这样。这表明：本发明的组合获得的凝块比参照物获得的凝块有更高的均一性。本发明的组合获得的凝块相对于商业参照物()获得的凝块显示出更好的均一性的事实意味着它大大降低了与从商业FS获得的密封相关的凝块破裂的风险。因此，它在密封损伤/伤口中是完全有效的。
不受理论的束缚，发明人认为，组织因子嵌入所形成的纤维蛋白网中(由于组合中包括的凝血酶和纤维蛋白原)，并且由于组织因子在纤维蛋白网内的这样的分布，发生凝块的扩张效应，引起有效地密封损伤或损害。
实施例5：包括脂化组织因子的无凝血酶的密封剂组合物的止血和密封剂 特性
为了试图确定WO97/29792中所公开的组合的止血和密封剂性质，制备一些无凝血酶的密封剂组合物并且依照生产商推荐(说明书手册)通过TEM进行分析。记录与凝块的总体强度有关的参数MCF(最大凝块坚度)和G(弹性系数强度)。
为了比较来自那些组合物的凝块与含有FIIa的FS诱导的凝块的强度，对商业FS(Tissuol)和非商业FS还测定相同的参数。
测试样品：
1：FII、FV、FVII、FX、FXIII、FI(来源：从五个不同的健康供体中获得的混合血浆)+脂化TF200ng/mL(来源：TT-173)+氯化钙5mM
2：FII、FV、FVII、FX、FXIII、FI(来源：从五个不同的健康供体中获得的混合血浆)+脂化TF 200ng/mL(来源：TT-173)+FI 3mg/mL(来源：SIGMA.ref.F4129)+氯化钙5mM
3：FII、FV、FVII、FX、FXIII、FI(来源：从五个不同的健康供体中获得的混合血浆)+脂化TF 200ng/mL(美国国际临床分析和病理产品ref.4500L)+氯化钙5mM
4：FII、FV、FVII、FX、FXIII、FI(来源：从五个不同的健康供体中获得的混合血浆)+脂化TF 200ng/mL(美国国际临床分析和病理产品ref.4500L)+FI 3mg/mL(来源SIGMA.Ref.F4129)+氯化钙5mM
5：FII：100μg/mL、FV：10μg/mL、FVII：0.5μg/mL、FX：FXIII：10μg/mL、FI：6mg/mL(来源：FI(ref.F4129 SIGMA)、FII：(ref.HCP-0010 CellSystems)、FXIII：(ref.HCXIII-0160 CellSystems)、(ref.HCX-0050 CellSystems)、FV(ref.HCV-0100 CellSystems)、FVII(ref.HCVII 0030 CellSystems))+脂化TF 200ng/mL(来源：TT-173)+氯化钙5mM。组分的混合物在使用它们前10min新鲜制备。
6：FII：100μg/mL、FV：FVIIa：0.5μg/mL、FX：8μg/mL、FXIII：10μg/mL、FI：6mg/mL(来源：FI(ref.F4129 SIGMA)，FIIa：(ref.HCP-0010 CellSystems)，FXIII：(ref.HCXIII-0160 CellSystems)，(ref.HCX-0050 CellSystems)，FV(ref.HCV-0100 CellSystems)，FVII(ref.HCVII 0031 CellSystems))+脂化TF 200ng/mL(来源：TT-173)+氯化钙5mM。组分的混合物在使用它们前10min新鲜制备。
还测定了两种FS组合物的MCF和G值：商业和非商业FS：
非商业的FS，每mL组合物含有：
纤维蛋白原(FI)(ref.F4129.SIGMA)：115mg
凝血酶(FIIa)(ref.T4648SIGMA)：500IU
氯化钙：40μmol
结果在表I中显示，对应于400μL的每种组合的分析(n＝3)：
表I
从表I所总结的数据中可以看出，将脂化的组织因子引入无凝血酶的密封剂组合物中提供的密封剂组合物的MCF(最大凝块坚度)和G(弹性系数强度)值大大低于商业的凝血酶密封剂组合物。具体而言，MCF比参照组合物的MCF低至少200％。另一方面，G值比商业的凝血酶密封剂组合物的G值低至少约2000％。
如本领域技术人员所知，MCF和G值越低，凝块的密封剂特性越差。因此，通过将脂化的组织因子加入到无凝血酶的组合物中，实现不了密封剂活性的改进。因此，当脂化的组织因子加入到凝血酶密封剂组合物中时，由发明人所发现的的密封剂的效果不能WO97/29792的教导衍生出来。
实施例6：凝结时间的分析
用于分析FS的功效相关的其他参数是它们不同组分产生稳定的凝块所需的时间。这可借助于凝血计容易地定量。对应于本发明的三重组合物FS+TT-173(纤维蛋白原(FI)(ref.F4129 SIGMA)：115mg/mL、凝血酶(FIIa)(ref.T4648SIGMA)：500IU/mL、TT-173(200ng TF/mL)、40μmol/mL氯化钙)也包括在本试验中。
凝血计量分析如下实施：来自实施例5中所测试的组合物或FS+TT-173的小份(200μL)加入到含有不锈钢球的比色皿中，并入凝血计(Diagnostica Stago,Inc.NJ,USA)中的磁力搅拌移动钢球直到它由于凝块停止。该时间称为凝结时间(s)，并进行记录。300s后停止实验。结果在表II中显示。
表II
如表II中所看到的，含有FIIa的FS诱导的凝结时间显示凝结时间少于5s，然而，WO97/29792的组合需要15-31s的时间，即，至少300％的更多时间，诱导能被凝血计检测的足够的纤维蛋白纤维。
鉴于上面的数据，我们能推断出，本发明中所描述的三重FS组合物显示出比WO97/29792中所描述的组合物快速的和坚固的凝块。
实施例7：肝素化的血浆样品中本发明的组合的止血能力
凝块由以下产生：
(a)30μL非商业FS(参见实施例5的组合物)；
(b)30μL三重组合FS+TT173(参见实施例6的组合物)或
(c)30μL相似的三重组合但是其含有脂化rTF(200ng/mL.来源American Diagnostica ref.4500L)替代TT-173作为TF的来源。
以上加入到300μL肝素化血浆中(0.6U/mL)。接下来，凝结时间(CT＝从凝块的施用直到出现第一个纤维蛋白网的时间)，凝块形成时间(CFT＝从形成第一个纤维蛋白网直到形成全部凝块的时间)和最大凝块形成(MCF＝凝块坚度)参数依照制造商的推荐(说明手册)通过TEM来确定。
结果在下面的表III中总结：
表III
FS FS+TT-173 FS+rTF
CT 171.6 41.3 37.5
CFT -- 159.6 356.5
MCF 7 33.6 34.5
值得注意的事实是，当单独使用FS时，在本试验中没有获得稳定的凝块。事实上，40min(本试验中所花费的时间)后仅检测到凝块形成开始(其需要171s)。
相反，在引入脂化的组织因子的情况下，三重组合很快开始凝结，并且两种情况中，产生稳定的凝块，凝块显示高度均一性(MCF值)。
本发明的三重组合能够在如此短的时间内产生稳定一致的凝块的事实在关键医疗情景中有着重要意义。
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Claims (15)

1.组合，其包含脂化的组织因子、凝血酶和纤维蛋白原。
2.如权利要求1所述的组合，其中所述组织因子的至少一个N-糖基化位点是无功能的。
3.如权利要求1和2中任一项所述的组合，其中所述组织因子是融合蛋白，所述融合蛋白包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含所述组织因子蛋白，所述第二部分包含另一肽或蛋白。
4.如权利要求3所述的组合，其中所述第二部分是标签。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合，其中所述融合蛋白具有第一部分和第二部分，所述第一部分包含至少一个N-糖基化位点无功能的成熟人组织因子蛋白，所述第二部分包含His标签。
6.如权利要求5所述的组合，其中所述融合蛋白对应于SEQ ID NO：5。
7.如权利要求6所述的组合，其中所述脂化的TF被***微泡。
8.如权利要求1-14中任一项所述的组合，其中所述凝血酶是人凝血酶。
9.如权利要求1-15中任一项所述的组合，其中所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原。
10.密封剂组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的组合和材料载体。
11.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-9中任一项所述的组合以及其他合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
12.权利要求1-9中任一项所述的组合或权利要求10所述的组合物作为密封剂的用途。
13.用作药物的权利要求1-9中任一项所述的组合或权利要求10-11所述的组合物。
14.用于治疗出血的权利要求1-9中任一项所述的组合或权利要求10-11中任一项所述的组合物。
15.试剂盒，其包含权利要求1-9中任一项所述的组合和施用器，所述施用器允许同时施用形成所述组合的全部组分。
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