CN104940952B - 包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法。所述的组合物包含siRNA序列和大环酯类化合物，还包含阳离子脂质、磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。本发明的可包含大环酯类化合物和siRNA的组合物可提高siRNA治疗的药动学特征，改变生物分布、胞内摄取量、靶向性和转染效率，减少不良反应等。

Description

包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及包含大环酯类化合物和siRNA的组合物及其制备方法。
背景技术
自10多年前RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术发现以来，RNAi已经成为细胞遗传的关键调节器和阐明机体生长、发病机制和衰老的有力工具。siRNA与相关的蛋白质结合成RNA。RISC通过siRNA的引导识别并降解靶基因的信使RNA(messengerRNA，mRNA)，使特定蛋白的表达受到抑制，进而特异性导致基因沉默。RNAi成功的关键在于是否能将siRNA完整地转染入靶细胞，与靶基因mRNA结合，其中siRNA在体内的稳定性具有重要意义。研究表明：通过对siRNA结构进行化学修饰和对siRNA骨架进行载体修饰是提高siRNA体内传递稳定性的2个重要途径。
siRNA发挥作用时具有高度的序列特异性和很强的靶向性。RNAi具有级联放大效应，极少量的双链核糖核酸(double-strandedRNA，dsRNA)便可降解比自身浓度大得多的mRNA，，但体内注射siRNA后，复合物必须经过全身循环***，尽可能避免肾脏肾小球的滤过，吞噬细胞的吞噬，血清蛋白吸附和内源性核酸酶的降解，以及网状内皮***(RES)的滞留才能到达靶细胞。siRNA在血清中的稳定性较差，容易被核酸酶RNase降解。静脉注射siRNA后，siRNA通过血液循环分布到各大器官，同时经历消除。siRNA经血管进入组织间质(外渗)，然后横跨间质到达靶细胞，到达靶细胞后通过内吞摄取。在此过程中，siRNA被内涵体启动的内吞小囊泡包埋，必须从内涵体逃逸，释放到细胞质中，并加载至RISC方能发挥作用。siRNA的外渗和穿透能力取决于靶组织的物理结构，而它的胞内摄取量还与siRNA与载体的表面性质有关。将siRNA传递到靶部位的最大障碍是内涵体对siRNA和载体的包埋和溶酶体对siRNA和载体的降解。
裸siRNA自身带负电，分子量大，极性强，很难穿过细胞膜、血管内皮，容易在脾脏滞留，在生物体内容易被核酸酶降解，半衰期短，转染效率低，甚至会产生强烈的炎症反应等。因此，siRNA的体内稳定性对其疗效的发挥至关重要。利用各种载体的协助，将siRNA通过不同的手段高效地递送到靶细胞是当前研究的重点。
发明内容
本发明一个技术方案是提供一种包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，组合物包含siRNA序列和大环酯类化合物。
优选地，所述组合物还包含磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组合。
优选地，所述组合物中按照质量份数计算，所述的siRNA1-5份和大环酯类化合物化合物2-5份。
优选地，所述组合物中所述的siRNA序列为HBVsiRNA：
正义链:[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT][dT]；
反义链:UGAAGCGAAGUG[mC]A[mC]ACGGUC。
优选地，所述组合物中，按照质量份数计算，所述的siRNA序列1-5份、大环酯类化合物化合物1-5份，磷脂0-3和脂质-聚乙二醇1-10。
优选地，所述组合物中，按照质量份数计算，所述的siRNA1份、大环酯类化合物化合物2份，磷脂0.5份和脂质-聚乙二醇3份。
优选地，所述组合物中，所述磷脂选自DPPE、DPPC、DPPG、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂，磷脂酰肌醇和心肌磷脂中的一种或几种；
所述脂质-聚乙二醇选自胆固醇-聚乙二醇、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1,2-二亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨、双棕榈酰基甘油聚乙二醇和双硬脂基甘油聚乙二醇中的一种或几种。
所述T2C1化合物的结构式如下：
所述T2C1化合物是由1,4,7,10-四氮杂环十二烷和环氧化合物在90℃反应得到；反应时置于玻璃容器内，持续搅拌，反应摩尔比为1:4，反应时长为24-72小时，优选为28-65小时。环氧化合物优选环氧烷基缩水甘油醚（烷基C12-C14)。
优选地，所述T2C1化合物是称量1,4,7,10-四氮杂环十二烷与C12-14-烷基缩水甘油醚mg混合，然后在92oC搅拌下孵育43小时合成T2C1。
本发明另一个技术方案是提供包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将所述siRNA序列溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；
（2）称取T2C1化合物、磷脂、胆固醇或/和脂质-聚乙二醇，并将这些组分溶解于溶剂中得溶液二；
（3）将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的溶剂逐渐蒸发；
（4）待大部分的溶剂蒸发后，进行均质，得到悬浮液；
（5）再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述包含大环酯类化合物和siRNA的组合物。
优选地，组合物的制备方法，所述溶液一与溶液二的体积比为1:（0.25-0.8）。
优选地，组合物的制备方法，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合。
所述步骤（4）中，均质后的悬浮液中的颗粒大小为40-240nm。
本发明的可包含大环酯类化合物和siRNA的组合物可提高siRNA治疗的药动学特征，改变生物分布、胞内摄取量、靶向性和转染效率，减少不良反应等。
具体实施方式
实施例1合成化合物T2C1化合物
称量100mg1,4,7,10-四氮杂环十二烷与C12-14-烷基缩水甘油醚726.8mg混合，然后在92oC搅拌下孵育43小时合成T2C1。
实施例2
制剂配方siRNA(siRNA+T2C1+胆固醇-聚乙二醇+DPPE1:1:1:1)
制备制剂：称量一定量的100mgT2C1，阳粒子脂质DOTMA，磷脂DPPE，胆固醇-聚乙二醇胆固醇聚乙二醇，在玻璃容器内混合溶于三氯甲烷，在真空下除去三氯甲烷。然后加上300ml水，旋涡震荡溶于水中，经均质处理,均质条件是1000巴，两次循环(ATS均质机)。
实施例3
siRNA:T2C1胆固醇-聚乙二醇:DPPE为1:0.3:0.3:0.4。
制备制剂：称量一定量的100mgT2C1，阳粒子脂质DOTMA，磷脂DPPE，胆固醇-聚乙二醇，在玻璃容器内混合溶于乙醇，在真空下除去乙醇。然后加上300ml水，旋涡震荡溶于水中，经均质处理,均质条件是1000巴，两次循环(ATS均质机)。
实施例4
siRNA:T2C1:胆固醇-聚乙二醇:DPPE为1:0.5:0.1:0.4
称量一定量的100mgT2C1，阳粒子脂质DOTMA，磷脂DPPE，胆固醇-聚乙二醇胆固醇聚乙二醇，在玻璃容器内混合溶于乙醇，在真空下除去乙醇。然后加上300ml水，旋涡震荡溶于水中，经均质处理,均质条件是1000巴，两次循环(ATS均质机)。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
实施例5
HBVsiRNA：
正义链:[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT][dT]；
反义链:UGAAGCGAAGUG[mC]A[mC]ACGGUC。
制剂制备方法参照实施例2。
细胞转染：HepG2.2.15细胞接种于96孔板中，在CO2中（5％CO2），37℃培养箱中培养过夜。第二天早晨细胞覆盖到?40％的孔板面积。用10μLDMEM培养液稀释0.5μLsiRNA（1μM储备溶液）。用10μL的DMEM培养液稀释0.4μL转染制剂（其配方如表一，部分转染制剂转染siRNA后抑制基因表达的效果如表二）。并在室温下保持5分钟。混合稀释的siRNA和稀释的转染制剂，涡旋震荡10秒，并保持在室温下20分钟。加20μL转染复合体于含80μLDMEM培养液的孔中。在CO2中（5％CO2），37℃培养箱中继续培养。
mRNA的分离：转染后两天，将细胞用100μL　PBS洗一次，然后加入100μL（Turbocapture试剂盒，Qiagen公司制）裂解缓冲液。溶解的细胞产物（80μL）转移到一个96孔的mRNA的捕捉板，在室温下孵育1小时。用100μL洗涤缓冲液洗涤三次，然后80μL的洗脱缓冲液加入到各孔中，在65℃下温育5分钟。洗脱溶液（含有mRNA的）被转移到一个新的96孔清晰板。
实时RT-PCR：3μL分离的mRNA用来实时RT-PCR。RT-PCR方法采用SYBRGreen一步实时RT-PCR试剂盒（SensiMix一步SYBRGreen试剂盒，BIOLINE）。混合11μL　mastermix（含逆转录酶），1μL的正向和反向引物（6μM），0.3μL　50X的SYBRGreen和2.7μL水。反转录反应的温度在42°C，30分钟后，之后95°C，15分钟用于激活Tag聚合酶;PCR循环的温度和时间是95°C，15秒，60°C，30秒，72°C，20秒。用ΔΔCT方法分析基因表达的变化。
表1：制剂转染siRNA后抑制基因表达的效果。转染制剂转染siRNA至HepG2.2.15细胞，48小时后取材，用实时RT-PCR方法分析基因表达变化。
表2：制剂转染siRNA后抑制基因表达的效果。转染制剂转染siRNA至HepG2.2.15细胞，48小时后取材，用实时RT-PCR方法分析基因表达变化。

Claims (7)

1.一种包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，组合物包含siRNA序列和大环酯类化合物，还包含磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组合；
所述大环酯类化合物为T2C1化合物，
所述磷脂选自DPPE、DPPC、DPPG、磷脂酰乙醇胺中的一种或几种；
所述脂质-聚乙二醇选自胆固醇-聚乙二醇、1,2-二亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨中的一种或几种；
其中，按照质量份数计算，所述的siRNA序列1-5份、T2C1化合物1-5份，磷脂0-3份和脂质-聚乙二醇1-10份。
2.如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，按照质量份数计算，所述的siRNA1-5份和T2C1化合物2-5份。
3.如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，所述的siRNA序列为HBVsiRNA：
正义链:[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT][dT]；
反义链:UGAAGCGAAGUG[mC]A[mC]ACGGUC。
4.如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物，其特征在于，按照质量份数计算，所述的siRNA1份、大环酯类化合物2份，磷脂0.5份和脂质-聚乙二醇3份。
5.如权利要求1所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述siRNA序列溶解于水或含有9％蔗糖的水中，得溶液一；
(2)称取大环酯类化合物、磷脂、胆固醇或/和脂质-聚乙二醇，并将这些组分溶解于溶剂中得溶液二；
(3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的溶剂逐渐蒸发；
(4)待大部分的溶剂蒸发后，进行均质，得到悬浮液；
(5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述包含大环酯类化合物和siRNA的组合物。
6.如权利要求5所述的用于治疗乙型病毒性肝炎的siRNA组合物的制备方法，其特征在于，所述溶液一与溶液二的体积比为1:0.25-0.8。
7.如权利要求5所述的包含大环酯类化合物和siRNA的组合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合。
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