CN104920477A - 一种球孢白僵菌种衣剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，包含如下组分：1.0g悬乳剂、50-100g玉米种子，搅拌均匀，晾干待播种。其利用球孢白僵菌与植物共生互惠的关系，其筛选到包衣种子孢子含量高、孢子萌发率高、可高效机械化播种的种衣剂，该种衣剂能明显促进玉米生长和提高玉米的抗虫性；对玉米具有促生和抗虫作用，可机械化播种。

Description

一种球孢白僵菌种衣剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及球孢白僵菌种衣剂及其制备方法。一种微生物农药的新剂型。

背景技术

玉米是我国第二大粮食作物，年产3000亿斤以上，可用来食用，也可以作为饲料和工业原料生产工业酒精和烧酒等。而玉米螟（Ostrinia nubilalis）是玉米生产中的主要害虫，不仅取食玉米叶片、蛀入玉米主茎或果穗内，降低光合作用，影响养分运输，还产生各种次级病害，致使玉米减产降质，常年造成玉米的产量损失在7%-15%，严重年份减产50%以上，甚至绝产，给我国粮食生产造成巨大的经济损失。

化学农药在玉米螟的防治中一直起着主要的作用，保证了粮食增产和安全问题，但是随着大量、连续的化学农药使用，农药残留对食用安全和环境经安全的危害越来越严重，环境兼容性好的高效农药已成为农药发展的方向。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一种微生物农药，是目前国内应用最广泛的昆虫病原真菌，可侵染鳞翅目螟蛾科、金花虫科、金龟子科、蚜虫科800余种害虫具有致病性强，杀虫范围广，环境友好等优点，尤其是在玉米螟和松毛虫的防治中更是取得了辉煌的成就，已经在各个地区被广泛应用。

目前，在白僵菌防治害虫中应用的剂型主要有粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、油剂、悬浮剂以及油悬浮剂等几大类，防治手段包括喷粉、撒颗粒剂、喷雾防治及无纺布挂条等，但这些农药剂型和防治手段均采用球孢白僵菌与害虫直接接触的触杀方式，唯一目标是杀虫效率。近年来，随着昆虫内生真菌与植物互作关系研究的深入，学者们发现球孢白僵菌可以在玉米、高粱、小麦、西红柿、香蕉、罂粟等植物体内共生，提高植物的抗病虫能力，增强植物对营养的吸收、对生物量的累积、对逆境环境的适应，是植物的生态益生菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种球孢白僵菌种衣剂及其制备方法，利用球孢白僵菌与植物共生互惠的关系，其筛选到包衣种子孢子含量高、孢子萌发率高、可高效机械化播种的种衣剂，该种衣剂能明显促进玉米生长和提高玉米的抗虫性；对玉米具有促生和抗虫作用，可机械化播种。

本发明的技术方案是这样实现的：一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，包含如下组分：1.0g悬乳剂、50-100g玉米种子，搅拌均匀，晾干待播种。

所述的悬乳剂包含如下组分：水 55-75ml、聚乙烯醇 3.0g, 种衣成膜剂 853 2.0g，麦芽糖2.0g、蛋白胨3.0g、黄原胶1.0g、农乳600# 2.0g、农乳603# 2.0g、乳化剂 A110  2.0g 、乳化剂M0A23  2.0g、大红水性色素1.0g、乳酸链球菌素0.5g、球孢白僵菌高孢粉10.0-30.0g。

所述玉米种子选自市售玉米种子：肯粘1号，平均百粒重为23g，发芽率≥ 90%。

所述球孢白僵菌高孢粉为含水量为5-10%的球孢白僵菌高孢粉，细度为400目，孢子萌发率≥95%。

所述的聚乙烯醇为成膜剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

所述的种衣成膜剂853为成膜剂，购自广州凡***细化工有限公司。

所述的麦芽糖为高温保护剂和营养剂，购自工生物工程（上海）有限公司。

所述的蛋白胨为增稠剂和营养剂，购自北京澳博星生物技术有限公司。

所述的黄原胶为增稠剂，购自淄博中轩生化有限公司。

所述的农乳600# 和农乳603#为乳化剂, 购自山东天道生物工程有限公司。

所述的乳化剂 A110和乳化剂 M023为乳化剂，购自江苏省海安石油化工厂。

所述的大红水性色素为警戒色，购自广州凡***细化工有限公司。

所述的乳酸链球菌素为生物保护剂，购自天津艾玛斯特生物科技有限公司。

所述的水为纯净水，购自公主岭市叮咚饮品有限公司。

本发明积极效果是通过对球孢白僵菌种衣剂的制备，实现了球孢白僵菌与种子同时播种，提高了球孢白僵菌施用的劳动效率；同时，本研究获得的球孢白僵菌包衣种子可短时间保存，不影响种子和孢子活力，这对地下害虫防治、促进玉米生长、提高玉米抗虫性具有重要意义，打破了球孢白僵菌仅仅作为杀虫剂施用的现状，对推进生物农药球孢白僵菌的商业化和产业化发展具有重要意义。

为了更好地验证本发明的效果，通过以下实验例来进行说明：

一、试验方法

1. 制备悬乳剂方法：

根据悬乳剂1-5的配方，向砂磨机料桶中依次加入纯净水、聚乙烯醇、成膜剂835、黄原胶、蛋白胨、麦芽糖、农乳600#、农乳601#、乳化剂A110、乳化剂M023，2500rpm/min，砂磨15-20min；待将这些化合物搅拌均匀后加入大红水性色素和乳酸链球菌素，2000rpm/min，砂磨5min；最后加入球孢白僵菌高孢粉，根据加入量的不同在2500rpm/min砂磨10-25min，待悬乳剂成流动性不同的均匀膏状体即可，球孢白僵菌高孢粉含量分别为10g、15g、20g、25g、30g，具体见下表：

2. 悬乳剂品质检测方法

2.1. 悬乳剂悬浮率检测方法：参照GB/T14825-93执行，称取适量试样（悬浮液浓度为最高喷洒浓度），精确至0.0001g，置于盛有50mL标准硬水（30±1℃）的200mL烧杯中，用手摇荡作圆周运动，约每分钟120次，进行2min，将悬乳液在同一温度的水浴锅中放置13min，然后用30±1℃的标准硬水将其全部洗入250mL量筒中，并稀释至刻度盖上盖子。以量筒底部为轴心，将量筒在1min内上下颠倒30次（将量筒倒置并恢复至原位为1次，约2s）。打开塞子，在垂直放入无振荡的恒温水浴锅中30min。用吸管在10～15s内将内容物的9/10即（225mL）悬浮液移出。不要摇动或搅起量筒内的沉降物，确保吸管的顶端总是在液面下几毫米处，之后烘干称取重量，并计算悬浮率，每组实验重复三次。

悬浮率=（试样质量-25ml悬乳液中有效成分质量）/试样质量×10/9×100%。

2.2 悬乳剂粘度检测方法：高孢粉悬浮液稀释2倍后，采用粘度计直接读数，单位为mPa·s，读数3次。

2.3 悬乳剂孢子萌发率测定方法：高孢粉悬乳液稀释100倍后，取1ml稀释液加入到9ml灭菌的含有抗生素的SDY液体培养液中，26℃、180rpm恒温振荡培养16h后显微镜镜检萌发孢子，并统计孢子萌发率。每个样品重复三次，取平均值。

孢子萌发率=萌发包子/（萌发孢子+未萌发孢子）*100%

3. 悬乳剂种子包衣方法：

悬乳剂3号和玉米种子按照下表比例加入到500ml三角瓶中充分搅拌，待玉米包衣均匀后取出晾干，待用。每种包衣处理重复3次。

4.  种衣剂品质检测方法

4.1种衣剂球孢白僵菌孢子包衣率检测方法：

取25粒包衣种子，放入无菌100ml三角瓶中，加入无菌的含0.05%的吐温-80无菌水25ml，无菌玻璃珠25g，摇床200rpm/min震荡洗涤包衣的球孢白僵菌孢子2小时，显微镜下血球计数板计数孢子数目，计算每粒种子孢子包衣浓度。

洗脱液孢子浓度（个孢子/ml菌悬液）=每个方格内孢子总数*稀释倍数*4*10⁶

种子包衣浓度（个孢子/粒种子）=洗脱液孢子浓度

    4.2 种衣剂包衣孢子萌发率检测方法：

取包衣种子孢子洗脱液1ml，加入到9ml灭菌的含有抗生素的SDY液体培养液中，26℃、180rpm恒温振荡培养20h后显微镜镜检萌发孢子，并统计孢子萌发率。每个样品重复三次，取平均值。

孢子萌发率=萌发孢子/（已萌发孢子+未萌发孢子）*100%

   4.3种衣剂包衣种子发芽率检测方法：

取包衣种子50粒，用种子发芽机25℃避光发芽，每12小时换一遍水，48小时候统计种子萌发情况。种子萌发以胚芽吸胀穿透种皮为标志，记为萌发，以未包衣种子为对照处理。

种子萌发率=萌发种子/（萌发种子+未萌发种子）*100%

4.4包衣种子储存时间检测

包衣种子室温干燥储存，在1、5、10和15天时分别检测包衣孢子和种子的萌发率，筛选包衣种子的室温储存时间。

5.  种衣剂田间应用

5.1 包衣种子田间种植和管理方法

包衣种子采用播种机两粒播种，垅距0.75米，株距0.25米，播种前用除草剂封闭除草一次，播种时一次性施用长效缓释复合肥，出苗10天后进行除草和间苗，约30天时进行二次除草和趟地。未包衣种子为对照处理，3个重复。

    5.2  促生检测方法

在种子出苗后，第30、45、55天用5米卷尺测量20株玉米苗的株高，计算玉米每天的生长速率。重复3次。

玉米生长速率（cm/天）=（后一次株高-前一次株高）/两次测量的间隔时间

   5.3 抗虫检测方法

7月5日早晨8:00前，调查玉米螟对玉米叶片的危害程度，危害标准和抗性程度参见NY/T 1248.5-2006（见下表）。调查20株玉米，重复3次。

5.4 增产检测方法

在9月中旬，收获玉米，检测玉米百穗重、千粒干重，计算增产率。重复3次。

    增产率=（包衣千粒干重-非包衣千粒干重）/非包衣千粒干重*100%

    所述的述砂磨机采用“众时（上海）机械有限公司”生产的ZMD-550实验室分散砂磨机。

    所述的粘度计为上海天平仪器厂生产的NDJ-1型号粘度计。

    所述的显微镜采用重庆光电仪器有限公司生产的XSZ-HY2型生物显微镜。

所述摇床为上海智诚分析仪器制造有限公司生产的ZWY-2102C型号摇床。

所述电子称为上海光正医疗仪器有限公司生产的YPB2003型号电子称。

所述电子称为上海光正医疗仪器有限公司生产的YPCB100001型号电子称。

所述种子发芽机为中山市容威电器有限公司，采用春/秋模式发芽。

所述抗生素为头孢和卡那霉素，购自北京鼎国生物技术有限公司。

所述吐温-80，购自天津市光复精细化工研究所。

二、实验结果

1. 悬乳剂品质检测结果

对制备的5组悬乳剂进行悬浮率、粘度和孢子萌发率检测，结果显示：悬乳剂的悬浮率排序为悬乳剂1＞悬乳剂2＞悬乳剂3＞悬乳剂4＞悬乳剂5；粘度结果排序为悬乳剂5＞悬乳剂4＞悬乳剂3＞悬乳剂2＞悬乳剂1；孢子萌发率结果排序为高孢粉＞悬乳剂2＞悬乳剂4＞悬乳剂3＞悬乳剂1＞悬乳剂5。具体数据见下表。

 理论上悬乳剂的悬浮率越大越适宜种衣剂均匀包衣种子，有效包衣孢子含量越高，本研究中的五组悬乳剂四组悬浮率超过80%，均可使用，但随着高孢粉含量增加悬浮率有下降趋势，在悬乳剂4之后，悬浮率下降明显；粘度是随着高孢粉含量的增加逐渐增加的，在悬乳剂4之后，粘度增加明显；悬乳剂中球孢白僵菌孢子的萌发率无规律性差别，但均比高孢粉对照略有降低，可能是加工过程或添加的助剂影响了孢子的萌发活力。因此，在有效成分球孢白僵菌添加尽量多，悬浮率尽量高，和粘度合理的原则下，选用悬乳剂3号进行种衣剂包衣研究。

2、种衣剂包衣品质检测结果

在种衣剂包衣过程中，进行了悬乳剂/种子重量比为1/50、1/75、1/100的三个不同包衣处理，通过单粒种子球孢白僵菌孢子的包衣量、包衣孢子的萌发率、包衣种子的萌发率三个指标，选择合适的包衣处理。结果显示：孢子萌发率和种子萌发率与对照差别不大，无明显的变化规律，但是孢子包衣量随着包衣重量比下降而下降。因此，根据包衣有效成分球孢白僵菌孢子量尽量多的原则，选择悬乳剂/种子重量比为1/50（种衣剂1号）进行包衣，开展田间实验。

3、包衣种子储存时间检测结果

悬乳剂3号与肯粘1号以重量比1/50比例包衣好的玉米种子，室温（15-25℃）下风干保存1-15天，检测孢子萌发率和种子萌发率。结果显示包衣孢子随着室温储存时间延长萌发率逐渐降低，在储存15天时以降低至88%，所以建议包衣种子尽早播种，勿要长时间存放；而玉米种子的萌发率随储存时间延长，变化并不明显，也无明显规律性。

4、种衣剂促进玉米生长结果

包衣种子田间播种后，在6月初开始测量株高，具体数据如下表。结果显示包衣种子的株高比未包衣种子的株高略高，第一次测量时高约1cm，第二次测量时高约3cm，第三次测量时高约6cm，每天的生长速率也略有增加，这说明包衣对玉米生长具有一定的促进作用，有利于玉米更好的利用水分、光等量。

5、种衣剂提高玉米抗玉米螟作用结果

     吉林省公主岭地区玉米螟一般在6月末开始发生，到7月上旬为幼虫发生盛期，本研究在7月5日展开玉米螟叶片危害级别调查，数据结果显示包衣玉米叶片危害级别略低于非包衣玉米，包衣玉米健株率略高于非包衣玉米，说明包衣可以在一定程度上提高玉米对玉米螟的抗性。

6、种衣剂促进玉米增产结果

百穗重和千粒干重的结果显示，包衣提高了玉米百穗重和千粒干重，千粒增产率达到5.12%，百穗增产达到8.06%。

三、实验结论

本发明研制的球孢白僵菌种衣剂，不降低球孢白僵菌孢子活力，包衣浓度达到0.35亿个孢子/粒种子，对玉米种子发芽率无明显影响，可促进玉米生长，提高玉米抗虫性，提高玉米的产量，打破了传统球孢白僵菌仅仅作为杀虫剂的使用局限，对进一步推广应用生物农药球孢白僵菌具有重要意义，对保护农村生态环境，促进我国可持续农业发展具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1

一种球孢白僵菌种衣剂，其特征在于由以下成份组成悬乳剂：水 55ml、聚乙烯醇 3.0g, 种衣成膜剂 853 2.0g，麦芽糖2.0g、蛋白胨3.0g、黄原胶1.0g、农乳600# 2.0g、农乳603# 2.0g、乳化剂 A110  2.0g 、乳化剂M0A23  2.0g、大红水性色素1.0g、乳酸链球菌素0.5g、含水量为5-10%，细度为400目，孢子萌发率≥95%的球孢白僵菌高孢粉10.0-30.0g。

将1.0g悬乳剂和50肯粘1号玉米种子，平均百粒重为23g，发芽率≥ 90%。，搅拌均匀，晾干待播种。

其中聚乙烯醇为成膜剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

种衣成膜剂853为成膜剂，购自广州凡***细化工有限公司。

麦芽糖为高温保护剂和营养剂，购自工生物工程（上海）有限公司。

蛋白胨为增稠剂和营养剂，购自北京澳博星生物技术有限公司。

黄原胶为增稠剂，购自淄博中轩生化有限公司。

农乳600# 和农乳603#为乳化剂, 购自山东天道生物工程有限公司。

乳化剂 A110和乳化剂 M023为乳化剂，购自江苏省海安石油化工厂。

大红水性色素为警戒色，购自广州凡***细化工有限公司。

乳酸链球菌素为生物保护剂，购自天津艾玛斯特生物科技有限公司。

水为纯净水，购自公主岭市叮咚饮品有限公司。

实施例2

一种球孢白僵菌种衣剂，其特征在于由以下成份组成悬乳剂：水 65ml、聚乙烯醇 3.0g, 种衣成膜剂 853 2.0g，麦芽糖2.0g、蛋白胨3.0g、黄原胶1.0g、农乳600# 2.0g、农乳603# 2.0g、乳化剂 A110  2.0g 、乳化剂M0A23  2.0g、大红水性色素1.0g、乳酸链球菌素0.5g、含水量为5-10%，细度为400目，孢子萌发率≥95%的球孢白僵菌高孢粉10.0-30.0g。

将1.0g悬乳剂和80肯粘1号玉米种子，平均百粒重为23g，发芽率≥ 90%。，搅拌均匀，晾干待播种。

实施例3

一种球孢白僵菌种衣剂，其特征在于由以下成份组成悬乳剂：水 65ml、聚乙烯醇 3.0g, 种衣成膜剂 853 2.0g，麦芽糖2.0g、蛋白胨3.0g、黄原胶1.0g、农乳600# 2.0g、农乳603# 2.0g、乳化剂 A110  2.0g 、乳化剂M0A23  2.0g、大红水性色素1.0g、乳酸链球菌素0.5g、含水量为5-10%，细度为400目，孢子萌发率≥95%的球孢白僵菌高孢粉10.0-30.0g。

将1.0g悬乳剂和100肯粘1号玉米种子，平均百粒重为23g，发芽率≥ 90%。，搅拌均匀，晾干待播种。

Claims (10)

1.一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，包含如下组分：1.0g悬乳剂、50-100g玉米种子，搅拌均匀，晾干待播种；其特征在于所述的悬乳剂包含如下组分：水 55-75ml、聚乙烯醇 3.0g, 种衣成膜剂 853 2.0g，麦芽糖2.0g、蛋白胨3.0g、黄原胶1.0g、农乳600# 2.0g、农乳603# 2.0g、乳化剂 A110  2.0g 、乳化剂M0A23  2.0g、大红水性色素1.0g、乳酸链球菌素0.5g、球孢白僵菌高孢粉10.0-30.0g。

2.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述玉米种子选自市售玉米种子：肯粘1号，平均百粒重为23g，发芽率≥ 90%。

3.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述球孢白僵菌高孢粉为含水量为5-10%的球孢白僵菌高孢粉，细度为400目，孢子萌发率≥95%。

4.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的聚乙烯醇为成膜剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

5.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的种衣成膜剂853为成膜剂，购自广州凡***细化工有限公司。

6.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的麦芽糖为高温保护剂和营养剂，购自工生物工程（上海）有限公司。

7.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的蛋白胨为增稠剂和营养剂，购自北京澳博星生物技术有限公司。

8.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的黄原胶为增稠剂，购自淄博中轩生化有限公司。

9.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的农乳600# 和农乳603#为乳化剂, 购自山东天道生物工程有限公司。

10.根据权利要求1中所述的一种球孢白僵菌种衣剂悬乳剂，其特征在于所述的乳化剂 A110和乳化剂 M023为乳化剂，购自江苏省海安石油化工厂；所述的大红水性色素为警戒色，购自广州凡***细化工有限公司；所述的乳酸链球菌素为生物保护剂，购自天津艾玛斯特生物科技有限公司；所述的水为纯净水，购自公主岭市叮咚饮品有限公司。